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DNA甲基化与癌症 2018 07 25 表观遗传学与DNA甲基化DNA甲基化的检测手段DNA甲基化与癌症 一 表观遗传学与DNA甲基化 基因型相同 现象1 一个生物体的不同组织基因表达模式截然不同 表达模式迥异 现象2 同卵双生的孪生子具有完全相同的基因组 但他们往往在长大成人后在性格 健康方面往往存在很大差异 现象3 肿瘤抑制基因被过量地甲基化而导致失去活性 而基因的DNA序列并不发生变化 现象4 橘生淮南则为橘 生于淮北则为枳 叶徒相似 其实味不同 同一种水果 在不同产地生长 其味道 大小 外观可能相差很远 Basketballplayer Singer President TVhost 如果他们出生在不同的地方 基因 环境 表型 表观遗传学 相同的基因型 不同的表型 什么是表观遗传学 表观遗传学 基因序列无变化基因功能发生变化可遗传并且是可逆的 表观遗传学机制 DNA甲基化组蛋白修饰RNA调控 RNA干扰 microRNA longnon codingRNA等 表观遗传学 Epigenetics 基因型不变的情况下 影响表型并能遗传的现象 称为表观遗传或后生遗传 表观遗传学研究的是在基因组DNA序列不变的情况下 在表型上具有的稳定的 可遗传 或潜在的可遗传性 的变化 定义 Epi genetics On or over thegeneticinformationencodedintheDNA 在细胞基因组上存在两类信息 A 遗传学信息B 表观遗传学信息前者 维持细胞活性功能工厂的所有物质材料后者 怎么建 何时建 在哪建的附加信息 基因组不仅仅是序列包含遗传信息 而且其修饰也可以记载遗传信息 DNAsequencecoding Epigeneticprogramming 表观遗传的特点 广泛 多样 复杂 DNA甲基化染色质重塑RNA调控 RNA干扰 非编码RNA microRNA longnon codingRNA等 表观遗传学目前的主要研究发现 细胞命运 个体发育 疾病发生 表观遗传调控 基因选择表达 表观遗传学 基因表达前的调控 DNA甲基化 基因印记 染色质重塑 基因转录后的调控 ncRNA miRNA 反义寡核苷酸 核糖开关RNA 蛋白翻译后的修饰 组蛋白的甲基化和乙酰化 非组蛋白的共价修饰 DNA甲基化 组蛋白翻译后修饰 RNA机制 甲基化是指从活性甲基化合物 如S 腺苷基甲硫氨酸 上将甲基催化转移到其他化合物的过程 可形成各种甲基化合物 或是对某些蛋白质或核酸等进行化学修饰形成甲基化产物 在生物系统内 甲基化是经酶催化的 这种甲基化涉及基因表达的调控 蛋白质功能的调节以及核糖核酸 RNA 加工 甲基化 DNA甲基化的概念及机理 1950年 Wyatt在Nature上首次指出测序结果表明DNA可能存在第5碱基 DNA甲基转移酶 DNMT胞嘧啶 Cytosine5 甲基胞嘧啶 5 MethylctosineS 腺苷 甲硫氨酸 SAMS 腺苷 高半胱氨酸 SAH DNMTs 活性甲基化合物DNA甲基化可以发生在腺嘌呤的N 6位 胞嘧啶的N 4位 鸟嘌呤的N 7位或胞嘧啶的C 5位等 但在哺乳动物中DNA甲基化主要发生在5 CpG 3 的C上生成5 甲基胞嘧啶 DNA甲基化 DNAmethylation DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶 DNMTs 的作用下 将一个甲基添加在DNA分子中的碱基上 最常见的是加在胞嘧啶上 由此形成5 甲基胞嘧啶 5mC DNA甲基化位点 CpG岛或富含CpG岛的区域CpG双核苷酸在人类基因组中的分布很不均一 而在基因组的某些区段 CpG保持或高于正常概率 这些区段被称作CpG岛 CCAGGCCTGGCCTTGACAGGCGGGCGGAGCAGCCAGTGCGAGACAGGGAGGCCGGTGCGGGTGCGGGAACCTGATCCGGAGGCGGGGGCGGGGCGGGGGCGCAGCGCGCGGGGAGGGGCCGGCGCCCGCCTTCCTCCCCGGGGCCCTCCGGCGTCTGCACTGCAGGAGCGCGGGCGCGGCGCCCCAGCCAGCGCGCAGGGCCCGGGCCCCGCCGGGGGCGCTTCCTCGCCCCGCGCGACCCGCTGCpG岛特征 A CpG岛主要位于基因的启动子区 部分位于基因的第一个外显子区 B CpG岛甲基化可以直接导致相关基因的表观遗传学沉默 高等生物基因组甲基化特点 1 广泛性2 可遗传性3 可逆性4 组织特异性 CpG岛 CpGislands 在结构基因5 端附近的调控区段 CG二联核苷常常以成簇串联的形式排列 含量大于50 预测软件http pbil univ lyon1 fr software cpgprod query htmlhttp www ebi ac uk Tools emboss cpgplot 广泛性 可遗传性 DNA修复 基因表达的调节 癌基因代谢 凋亡 分化 细胞周期 DNA甲基化 DNA甲基化的功能 DNA甲基化的生物学意义 DNA甲基化直接影响基因的活化状态DNA甲基化的生物学意义在于 A 基因表达的时空调控B 保护基因组的稳定性 表现 基因在不同时期不同身体部位特异表达I 有些基因在发育早期甲基化II 发育晚期被诱导去甲基化III 管家基因低甲基化IV 印记基因高甲基化 CpG甲基化与转录活性成反比CpG岛的数目与基因密度相关 人类基因组甲基化情况1 2 的人类基因组是CpG群人类基因组CpG岛约为28890个平均值为每Mb含10 5个CpG岛80 90 的CpG位点已被甲基化 一 DNA甲基化干扰转录因子对DNA元件的识别与结合 序列特异性的甲基化DNA结合蛋白与启动子区甲基化CpG岛结合 募集组蛋白去乙酰化酶 HDAC 形成转录抑制复合物 阻止转录因子与启动子区靶序列的结合 从而影响基因的转录 DNA甲基化抑制基因转录的机制 没有甲基化基因表达 基因启动子区域 转录因子 结合 不能结合 甲基化基因不表达 甲基化 二 序列特异性的甲基化DNA结合蛋白与启动子区甲基化CpG岛结合 募集组蛋白去乙酰化酶 HDAC 形成转录抑制复合物 阻止转录因子与启动子区靶序列的结合 从而影响基因的转录 DNA甲基化抑制基因转录的机制 Sin3AMeCP2 启动子 基因 转录因子 基因表达 启动子 基因 基因不表达 染色质构型的变化伴随组蛋白的乙酰化和去乙酰化 以调控基因转录的开关 DNA甲基化能引起染色质结构 DNA构象 DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变 从而控制基因表达 三 DNA甲基化通过改变染色质结构抑制基因表达 DNA甲基化抑制基因转录的机制 二 DNA甲基化的检测手段 亚硫酸氢盐测序的原理 1 直接测序法 1 直接测序法 注 A 癌组织 B 癌旁组织 未甲基化 甲基化 43A 43B 369bp 43B 2 重亚硫酸盐转化后PCR克隆测序 2 重亚硫酸盐转化后PCR克隆测序 3 甲基化特异性PCR 3 甲基化特异性PCR UMUMUMladder 100 150 200 250 MSP法检测抑癌基因RASSF1A启动子区的甲基化 图MSP检测组织切片DNA甲基化状态电泳图片 甲基化特异性PCR MSP 结果 U为非甲基化 M为甲基化 4 结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法 5 基于限制性内切酶的甲基化分析方法 6 基于亲和纯化的甲基化分析方法 三 DNA甲基化与癌症 DNA甲基化与癌症 DNA甲基化与癌症的发生发展有着密切的联系 DNA甲基化改变包括高甲基化和去 低 甲基化 对不同肿瘤细胞的DNA分析表明 癌变细胞中出现基因突变的概率要远远低于预期 与基因突变相比 DNA甲基化改变在细胞恶变过程中可能发挥了更大的作用 DNA甲基化与癌症的发生发展有着密切的联系 高甲基化 抑癌基因沉默 低甲基化 原癌基因被激活 CpG岛 抑癌基因高甲基化 在肿瘤细胞中 抑癌基因启动子区域的CpG岛处于高甲基化状态 因而抑癌基因沉默 使得细胞脱离正常的细胞周期 进入肿瘤发生过程 原癌基因激活 正常细胞中 由于甲基化作用原癌基因多处于沉默状态 但在多种肿瘤细胞中 均发现原癌基因处于低甲基化状态 并且低甲基化状态与其蛋白表达升高密切相关 表明低甲基化状态可使原癌基因激活 肿瘤细胞的特性 现在认为 肿瘤细胞具有以下特征 1 逃避细胞死亡 resistingcelldeath 2 对生长抑制信号不敏感 evadinggrowthsuppressors 3 诱导新血管生成 inducingangiogenesis 4 无限的复制潜能 enablingreplicativeimmortality 5 组织浸润和转移 activatinginvasionandmetastasis 6 持续的增殖信号 sustainingproliferativesignaling 另外 近年的研究又提出了新的两点 能量代谢的改变 reprogrammingofenergymetabolism 和逃避免疫系统的破坏 evadingimmunedestruction 以上几点在细胞发生癌变的过程中有着重要的意义 近年来的研究发现 特定基因的DNA高甲基化在这些过程中均发挥重要作用 1 逃避细胞死亡 通常情况下 细胞在接触抑制 辐射 凋亡信号分子等刺激时会发生凋亡 但是癌细胞却可以不受凋亡的控制 而大量分裂增殖 例如 p53基因是一个重要的抑癌基因 可以促使损伤细胞发生凋亡 50 的癌症中存在p53基因的突变失活 p53基因编码区的甲基化状态容易因为脱氨基作用发生5mC T的转换 同时 INK4a ARF基因启动子区域的甲基化可以使表达下降 导致原来受抑制的MDM2表达上升 MDM2进而结合p53并使后者发生蛋白质水平的降解 使细胞逃避p53引起的凋亡圈 DNA高甲基化与癌症 2 对生长抑制信号不敏感 细胞生长抑制因子对细胞生长的调控存在多种机制 在丙肝病毒感染的肝细胞中 发现了丙肝病毒的核心蛋白 coreprotein 可引起p16基因启动子的甲基化 p16表达水平下降从而促进了细胞的分裂 在丙肝诱导的肝癌中起着重要的作用 DNA高甲基化与癌症 3 诱导新血管生成 新血管的生成是癌症发生中重要的步骤 新血管生成首先需要金属蛋白酶分解细胞外基质 再通过血管内皮生长因子来诱导血管生成 组织金属蛋白酶抑制剂可以抑制金属蛋白酶的活性 同时与血管内皮生长因子结合阻止血管生成 肿瘤细胞中组织金属蛋白酶抑制剂的下调有一部分原因是由于启动子区域的甲基化引起的 血小管反应蛋白 TSP1 是另一个抑制血管生成的蛋白 TSP1基因启动子区域甲基化引起基因表达抑制 进而导致肿瘤发生过程中细胞外基质重构和血管生成 DNA高甲基化与癌症 4 无限的复制潜能 癌细胞无限的复制潜能主要与端粒酶活性的升高有关 端粒酶可以利用RNA逆转录DNA 解决DNA复制时末端缺失的问题 正常情况下端粒酶只有在受精卵和十细胞中才有活性 而肿瘤细胞大多具有高活性的端粒酶 端粒酶的重要组成部分是人端粒酶逆转录酶 它的活性与端粒酶活性高度相关 引起人端粒酶逆转录酶激活的启动子甲基化有位置特异性 即与启动子特定部位的甲基化及相关区域整体的非甲基化相关 DNA高甲基化与癌症 5 组织浸润和转移 组织浸润和转移是细胞恶变的重要特征 近年来这力一面的研究进展迅速 细胞骨架的异常调节与肿瘤转移密切相关 DFNAS是一个新发现的乳腺癌相关基因 DFNAS可以促进细胞凋亡 而DFNA基因启动子甲基化后的表达抑制导致了肿瘤细胞转移几率增大 DNA高甲基化与癌症 6 持续的增殖信号 大部分的癌细胞不需要外界的生长刺激因子的作用就可以完成增殖 原因是细胞内的信号转导通路发生了变化 导致促增殖因子作用的增强 在结直肠癌中发现肿瘤干细胞中SFRPs的启动子区域的高甲基化使其表达抑制 引起了Wnt通路的过度激活而刺激细胞分裂 因而细胞在不需要外界生长刺激因子的作用下就可以不断增殖 DNA高甲基化与癌症 与癌症发生过程中DNA的甲基化不同 DNA的低甲基化既包括特定基因 主要是原癌基因 的低甲基化 还包括基因组范围内以非编码重复序列为主的DNA整体水平的低甲基化 DNA低甲基化与癌症 1 特定基因的甲基化水平降低 CT cancer testisantigengenes 抗原属于MACE melanomaandgermcellexpressed 基因家族 正常情况下只在生殖细胞表达 CT抗原在多种肿瘤组织中高表达 如肺癌 胰腺癌 胃癌等 CT激活与它的启动子区域的去甲基化相关 近年来 白血病基因 乳腺癌基因 结肠直肠癌 肾细胞癌基因肝癌基因中都发现了由启动子低甲基化所引起的肿瘤相关基因的过表达 DNA低甲基化与癌症 2 基因组范围整体DNA甲基化的降低 基因组范围DNA甲基化的程度可以通过甲基化敏感的DNA酶来检测 在多种癌症当中都发现了基因组范围整体水平的DNA甲基化降低 包括许多重复序列甲基化水平的下降 正常组织细胞的甲基胞嘧啶含量约4 而癌细胞则为大约2 一3 DNA甲基化水平的降低可以出现在肿瘤发生早期阶段 肿瘤细胞在基因缺乏区域 gene poorareas 的DNA甲基化水平明显下降 而基因启动子区域的甲基化差异则相对较小 提示这些非编码区域的甲基化水平降低可能与肿瘤发生有更密切的关系 DNA低甲基化与癌症 DNA甲基化与癌症诊断 表观遗传学的改变是细胞癌变的重要特征之一 因此 细胞DNA甲基化的变化可以作为癌症早期诊断的重要依据 甲基化生物标记的不断发现使这一技术在临床的应用成为可能 甲基化特异的PCR技术 methylation specificPCRMSP 的出现 使得细胞DNA甲基化水平的检测变得十分方便 DNA甲基化检测稳定性好 有组织特异性 易于检测且其异常程度常与癌症的进展相关 因此 相对于传统的基因突变检测有很大的优势 在许多癌症中都己经发现了癌症相关基因甲基化水平的改变 如外周血细胞的DNA低甲基化与膀胱癌的发生密切相关 随着全基因组甲基化图谱的绘制 相信会有更多的甲基化生物标记投入到临床癌症的诊断中 与基因的突变不同 表观遗传学的改变大都是可逆的 因此 利用药物来改变细胞的表观遗传学状态可能是治疗癌症的一条新途径 目前的甲基化酶抑制剂主要有zebularine和5 ADC 5 ADC在试验中显示了对骨髓增生症 白血病和实体肿瘤都有明显的疗效 Zebularine在小鼠的肠癌模型中能够明显减少息肉的数量 其它的甲基化抑制剂如RG 108 EGCG等在实验中均表现出了对肿瘤的抑制作用 DNA甲基化抑制剂的研究才刚刚起步 但己表现出巨大的潜力