番茄绵疫病菌抗药性检测技术规程

ICS点击此处添加ICS号点击此处添加中国标准文献分类号DB江西省地方标准DB 36/ XXXXXXXXX番茄绵疫病菌抗药性检测技术规程Technological rules for detecting fungicide resistance in Phytophthora capsici on tomato点击此处添加与国际标准一致性程度的标识XXXX - XX - XX发布XXXX - XX - XX实施江西省质量技术监督局发布DB36/ XXXXXXXXX目次前言II1范围12规范性引用文件13术语和定义14测定方法25数据统计和分析36检测报告的形成及归档5附录A（资料性附录）辣椒疫霉菌菌落培养特征及孢子囊形态特征6前言本标准编写规则符合GB/T 1.1-2009标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写的规定。本标准由江西省农业农村厅提出并归口。本标准起草单位：江西省农业科学院植物保护研究所。本标准主要起草人：何烈干、邹芬、马辉刚、涂玉琴、王美清、王修慧、朱跃冬、朱业斌、赖金美。6标准名称1 范围本标准规定了番茄绵疫病菌抗药性检测的术语和定义及检测方法。本标准适用于番茄绵疫病菌对杀菌剂的抗性检测。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB 16715.3 瓜菜作物种子 第3部分：茄果类GB 12475 农药贮运、销售和使用的防毒规程；NY 608农药产品标签通则；NY/T 496 肥料合理使用准则 通则；NY/T 1276 农药安全使用规范 总则；NY/T 2118 蔬菜育苗基质。3 术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3.1 原药Technical grade material未经加工的农药原产物。3.2 抗药性 fungicide resistance有害生物群体对农药产生敏感性下降的遗传变化称为抗药性。3.3 抑制中浓度（EC50）Median effective concentration（EC50）指在试验时间内，抑制50%菌丝生长或孢子萌发所需的药剂有效浓度。3.4 番茄绵疫病tomato brown rot指由疫霉属辣椒疫霉Phytophthora capsici Leonian侵染番茄引起的一种流行性病害。3.5 敏感基线 sensitivity baseline在同类作用方式的杀菌剂使用之前，靶标病菌群体中不同菌株对一种药剂的敏感性(EC50 值)分布曲线，常用平均值及95%置信限表示。3.6 人工接种 artificial inoculation在适宜条件下，通过人工操作将菌饼置于含药的平板中央，通过菌丝生长速率来检测病菌的抗药性水平。4 测定方法4.1 菌丝生长直径法将能明显抑制菌丝生长的供试药剂（烯酰吗啉、霜脲氰、嘧菌酯、氟吗啉、霜霉威、精甲霜灵、百菌清等及其混剂）与培养基混合，以菌丝生长速率快慢来检测番茄绵疫病菌对药剂的抗性水平。试验时，先进行预备测定，将各待测菌株移入含上述杀菌剂0.1、1.0、10、100gmL-1的培养基平板中培养7d，根据其生长情况设计正式测定时的杀菌剂系列浓度梯度。4.2 培养基的制备4.2.1 基础培养基取50g黑麦种子在适量去离子水中浸泡24h36h，捣碎机捣碎，5560水浴1 h2 h，双层纱布过滤，5560水浴1 h2 h，双层纱布过滤，上清液补水至1000 mL，加入琼脂15g，121高压灭菌30min。4.2.2 选择性培养基待基础培养基冷却至5060时，加入利福平20mgL-1，氨卞青霉素200mgL-1，70%五氯硝基苯100mgL-1，充分摇匀后倒入培养皿中。4.3 绵疫病样的采集、分离和保存4.3.1 菌株的采集在田间选择刚发病的番茄叶片，装入一次性小塑料袋内，置于冰块中，1天内带回实验室进行分离。4.3.2 病原菌的分离将采回的病叶用自来水和灭菌水冲洗干净，凉干后，背面朝上置于灭菌过的2%琼脂培养基上，1620培养箱内光暗交替（12h/12h）保湿培养45d，发病后挑取霉层置于选择性培养基上，1620培养8d10d(菌落直径长至2cm3cm)。4.3.3 绵疫病菌的鉴定挑取少量分离纯化的菌丝制成玻片，在100倍显微下观察菌体形态。当菌体形态与附录A相符时，则确定所分离的病菌为绵疫病菌。4.3.4 病原菌的保存挑取分离出来的绵疫病菌少量菌丝置于选择性培养基上，在培养箱中1620黑暗培养2d3d，再将菌落边缘单菌丝的尖端连同培养基一起切下，置于斜面基础培养基上，1620黑暗培养14d后，加入灭菌过的石蜡油（液面超过菌面约1cm），10黑暗保存，备用，每半年转接1次。4.4 含药培养基的制作收集杀菌剂原药，保存于避光、低温（04）及干燥条件下。称取适量的原药，用有机溶剂（如丙酮、甲醇、二甲亚砜等）溶解，以无菌水稀释成母液（有机溶剂的含量应低于总体积的1%），再加入无菌水稀释成系列浓度的药液，按照药液与培养基体积比1:9 分别加入溶化的黑麦琼脂培养基（RA）中，混匀，泼碟，配制成含不同浓度药剂的RA平板。对照仅加入适量DMSO或丙酮等溶剂。4.5 接种及培养将保存的菌株取出活化，然后在RA平板上培养10d，从菌落边缘以直径5mm 打孔器打菌饼，用接种针挑取菌饼接在含药RA平板（直径9 cm) 中央，以不含药RA 平板为对照，每皿接1个菌饼，每处理重复3 次。盖上皿盖，1620培养10 d。4.6 结果检查当对照（即不含杀菌剂的培养基平板）的菌落直径至少达到5cm 时，采用垂直十字交叉法测量菌落直径，计算平均值。5 数据统计和分析5.1 毒力回归方程的建立用十字交叉法测量菌落直径的平均值(mm)，按依以下公式算出各药剂浓度对菌丝生长的抑制百分率（%），抑制率（P）（%）=（对照菌落增长直径-处理菌落增长直径）/对照菌落增长直径100%。将菌丝生长抑制率换算成抑制效果机率值(Y) , 药剂浓度换算成浓度对数(X)。采用SPSS、DPS 等统计软件，进行药剂浓度对数值（X）与抑制率的几率值（Y）之间的线性回归分析，求出每种药剂对每个菌株的毒力回归方程式（Y=a+bX）、相关系数和置信区间。由毒力回归方程式求出菌株对药剂的敏感性(EC50 值)。5.2 敏感基线(EC50)的建立从未使用过某种药剂及其相同作用机理药剂的多个代表性地区采集番茄绵疫病菌90株110株，测定其对该药剂的敏感性（EC50值）。将供试菌株对某种药剂的敏感性(EC50 值)划分成不同区段（一般5个区段），确定敏感性分布范围（例如从较小的a 到较大的b)，写出浓度区段（等差数列）a,a+（b-a）/n, a+2（b-a）/n,a+3（b-a）/n, a+4（b-a）/n,a+(k-1)（b-a）/n（n 为区段数，k 为数列的序数），以每个区段菌株出现频率（%）为纵轴，以药剂浓度区段为横轴，画出敏感性分布光滑曲线图，由n 个点连成，每一点以(x,y)来表示，x=浓度区段中值，y 代表该区段菌株出现频率。利用DPS、SPSS 等统计软件进行敏感性数据正态性分布检验，如果P值0.05，即在95%置信限内，敏感性呈近似正态分布，则菌株可视为野生敏感菌株，其敏感性(EC50 值)平均值可作为敏感基线(EC50 值)。5.3 抗性水平抗性水平敏感性（ EC50值）100/敏感基线（ EC50值），抗性水平的结果保留整数。5.4 菌株敏感型划分菌株对甲霜灵（或精甲霜灵）敏感型：高抗菌株：在含5 g/mL、100 g/mL 甲霜灵（或精甲霜灵）的RA平板上菌落直径对照菌落直径的40；中抗菌株：在含5 g/mL 甲霜灵（或精甲霜灵）的RA平板上菌落直径40%对照菌落直径，在含100 g/mL 甲霜灵（或精甲霜灵）的RA 平板上菌落直径对照菌落直径的40%；敏感菌株：在含5 g/mL、100 g/mL 甲霜灵（或精甲霜灵）的RA 平板上菌落直径均对照菌落直径的40。菌株对嘧菌酯、吡唑醚菌酯、噁霜灵等高度固有抗性风险药剂的敏感型：敏感菌株（S），敏感性（EC50 值）敏感基线的95%置信限上限，抗性水平(敏感基线的95%置信限上限/敏感基线)；低抗菌株（LR），(敏感基线的95%置信限上限/敏感基线)抗性水平100 倍；中抗菌株（MR），100 倍500 倍。菌株对霜脲氰、烯酰吗啉、氟吗啉、双炔酰菌胺、霜霉威、氰霜唑、氟啶胺、氟吡菌胺等中低度固有抗性风险药剂的敏感型：敏感菌株（S），敏感性（EC50 值）敏感基线的95%置信限上限，抗性水平(敏感基线的95%置信限上限/敏感基线)；低抗菌株（LR），(敏感基线的95%置信限上限/敏感基线)抗性水平10 倍；中抗菌株（MR），10 倍100 倍。5.5 抗性频率评估抗性频率（%）=抗性菌株数100/供试菌株数，抗性频率结果保留小数点后2位数字。6 检测报告的形成及归档建立番茄绵疫病菌抗药性监测数据库，将测定的所有原始数据及计算结果、抗性水平及抗性频率评估，按时间、地点建立档案，长期保存。AA附录A （资料性附录）辣椒疫霉菌菌落培养特征及孢子囊形态特征在CA上菌落呈放射状、絮状，气生菌丝中等到繁茂。菌丝形态简单，粗3-10m。孢囊梗不规则分枝或伞形分枝，细长，粗1.5-3.5m。孢子囊形态变化甚大，从近球形、卵形、肾形、梨形到长卵形、椭圆形和不规则形，40-80m29-52m，平均56.7m 42.2m；长宽比值为1.4-2.7，平均1.86；具明显乳突1（-3）个，乳突高2.7-5.4m；