基因工程常用工具酶及应用.ppt

1 第四章 基因工程的工具酶及其应用 2 TOOLSFORGENECLONINGSCISSORS RESTRICTIONENZYMESGLUE DNALIGASEVEHICLE PLASMIDORVIRALVECTORS 3 基因工程的工具酶定义用于DNA和RNA切割和连接的各种酶叫做工具酶 4 分子剪刀 的发现者 5 第一节限制性核酸内切酶 限制性核酸内切酶 restrictionendonuclease RE 是由细菌自己产生的一种能识别双链DNA中的特定序列 并以内切方式水解核酸中磷酸二酯键的核酸内切酶 6 在细菌体内 这种内切酶可以分解外源性的DNA物质 例如病毒等 而细菌本身的DNA同一识别序列中的某些碱基被甲基化所保护 这种细菌内部的限制与修饰作用分别由核酸内切酶和甲基化酶完成 构成了类似免疫的防御系统 7 解释何谓内切酶 o o o o o o o o o o o o o o 红色为外切酶的作用位点 蓝色为内切酶的作用位点 8 限制性核酸内切酶的分类 目前已发现的限制性核酸内切酶600余种 可分为三大类 类限制性核酸内切酶广泛用于基因工程 特点 识别切割位点比较专一 只有切割作用 无甲基化修饰作用 类和 类限制性核酸内切酶同时具有内切活性和甲基化修饰活性 且识别位点复杂 特异性差 不适用于基因工程 9 一 限制性内切酶的命名 Hind Hind 细菌属名的第一个字母 细菌种名的前两个字母 细菌菌株的第一个字母 同一菌株中发现的第三种酶 10 EcoRIEcoRI 细菌属名的第一个字母 细菌种名的前两个字母 该酶的基因位于R质粒上 该菌株发现的第一种内切酶 11 12 二 II型限制酶的识别特点 识别专一的核苷酸顺序 并在该顺序的固定位置切割 识别顺序为回文结构 Palindrome 客上天然居居然天上客 13 14 EcoRI PstI HpaI 5 stickyend5 粘末端 3 stickyend3 粘末端 bluntend平末端 三 限制性内切酶的切割方式 15 四 识别位点与切割方式 限制性内切酶识别序列一般为6个核苷酸 如EcoRI HindIII BamHI 居多数 也有少数限制性内切酶 识别序列为4个 5个 或更多的核苷酸如8个及8个以上 当识别序列核苷酸数为单数时 则以中间的核苷酸作为对称轴 如GTNAC N代表四种核苷酸 16 一般说来 在DNA分子中 识别序列短的出现概率大 识别序列长的出现概率小 有N个核苷酸的识别序列出现概率为1 4n 如识别4个核苷酸Sau3A 则间隔256 4 4 4 4 个核苷酸就有一次机会出现识别位点 如识别8个核苷酸的NotI 则需间隔65536个核苷酸才有一次机会出现识别位点 17 稀切酶 有些酶的识别位点在核苷酸序列中出现的几率很小 可称为稀切酶 为了获得大的DNA片段 需用稀切酶切割 个别限制性内切酶可识别两种以上的核苷酸序列 如AccI既可识别GTATAC 又可识别GTCGAC 18 位点偏爱 限制性内切酶识别序列两侧的核苷酸组成与酶切效率有关 比如NaeI在pBR322质粒上有4个识别位点 其中两个位点可迅速被NaeI切割 第三个位点稍慢 而位于1285处的第四个识别序列 切割的效率只有其他位点的1 15 19 同尾酶 两种酶识别不同的顺序 但切割产生的粘末端相同 叫做同尾酶 同尾酶产生的粘末端 可通过碱基互补连接 形成的位点称为 杂种位点 该位点不能再被原来的两种酶切割 20 例 AGATCTGGATCCTCTAGACCTAGG Bgl BamH ATCTAG GATCCG 连接酶 AGATCCTCTAGG 21 同位酶 识别相同的序列 但切割位点不同 同裂酶 又称异源同工酶 来源不同 但识别位点和切割位点相同 切割位点也可以不同 例如SamI CCC GGG 和XmaI C CCGGG 22 五 限制性内切酶的反应条件 反应温度一般为37oC反应体积20 lDNA含量0 5 1 g酶含量1 2uDNA纯度 OD260 280nm 1 7阳离子Mg2 反应时间1 1 5hpH7 5 23 限制性核酸内切酶的反应条件 各种限制性核酸内切酶反应条件相似 主要区别是对盐浓度的需求不同 据此可分为三组低盐组0 50mmol LNaCl中盐组50 100mmol LNaCl高盐组100 150mmol LNaCl 24 限制性核酸内切酶的星号活性 当酶切条件发生变化时 限制性核酸内切酶的专一性可能会降低 导致同种酶识别多种序列 这种现象称作限制性核酸内切酶的星号活性 25 例如EcoRI在正常条件下识别GAATTC 但在低盐 小于50mmol L 高pH 大于8 甘油大量存在时 识别序列增加了AAATTC GAGTTC 导致EcoRI在DNA分子上的切割位点大大增加 26 第二节其他工具酶 一 DNA聚合酶作用 依据模版 连接游离的单核苷酸 形成与模版互补的新链 27 1 大肠杆菌DNA聚合酶 该酶具有三种酶活性5 3 DNA聚合活性3 5 外切酶活性识别切除错配的核苷酸5 3 DNA外切酶活性 28 5 CCGATA OH3 3 GGCTATCGGA5 CCGATAGCCT3 3 GGCTATCGGA5 3 DNA聚合酶活性 DNA聚合酶 dNTP 29 5 CCGATA OH3 3 GGCDNA聚合酶 5 CCG3 GGC dA dT3 5 外切酶活性 30 2 大肠杆菌DNA聚合酶 大片段 该酶是用枯草杆菌蛋白酶或胰蛋白酶降解大肠杆菌DNA聚合酶 从全酶中切去5 3 外切活性的肽段后产生的一条多肽链 保留了5 3 聚合和3 5 外切活性 该酶称为Klenow酶 也称为Klenow片段 Klenowfragment 31 3 T4噬菌体DNA聚合酶 来源于T4噬菌体感染的大肠杆菌 具有5 3 DNA聚合酶活性3 5 外切酶活性 32 4 TaqDNA聚合酶 耐热的DNA聚合酶 最适反应温度75 80oC 主要用于聚合酶链反应 33 5 逆转录酶 reversetranscriptase 作用 以RNA为模版 合成cDNA ComplementaryDNA 该类酶有三种活性 RNA依赖的DNA聚合酶活性 DNA依赖的DNA聚合酶活性 外切RNA的活性 34 常用的逆转录酶有两种 AMV 来自于鸟类骨髓母细胞瘤病毒M MLV 来自于莫络尼鼠的白血病病毒 35 二 T4DNA连接酶 催化两个DNA片段的3 OH和5 P末端形成磷酸二酯键该酶是大肠杆菌T4噬菌体的DNA30编码的产物 分子量68kd 现已由基因工程菌表达 36 DNA连接酶 分子针线 37 DNA连接酶 连接的部位 磷酸二酯键 梯子的扶手 不是氢键 梯子的踏板 38 主要功能降解RNA由于RNA酶分布广泛 如唾液 皮肤分泌物中都含此酶 在涉及RNA的实验中谨防RNA酶污染 三 RNA酶 39 四 核酸酶SI