作业果胶酶的开发.doc

高产果胶酶菌株的开发一，酶的介绍 果胶酶(Pectinase)是世界四大酶制剂之一，是分解果胶质酶类的总称，从广义上来讲，果胶酶主要分为三类:（1）原果胶酶，可以把不溶于水的原果胶分解为可溶于水的高聚合体果胶。（2）果胶酯酶，脱去果胶中的甲氧基基团，促使果胶的脱甲酯作用。（3）解聚酶，促使果胶中的D-半乳糖醛酸的1,4糖苷键的裂解。天然来源的果胶酶广泛存在于动植物和微生物中，但动、植物来源的果胶酶产量低难以大规模提取制备，微生物则是生产果胶酶的优良生物资源，物中，细菌、放线菌、酵母和霉菌都能代谢合成果胶酶。我国学者对果胶酶菌种的选育始于上世纪80年代，研究领域主要集中在曲霉菌属。目前果胶酶广泛应用于工业生产尤其是果汁的提取及葡萄酒的制作，果胶酶的生产采取的主要方法是黑曲霉的固体发酵与液体发酵，两者在生产设备及节约成本方面仍有待改进。近年来随着果汁与果酒行业的迅猛发展，对果胶酶的需求日益增大。筛选果胶酶高产菌株，优化其发酵条件，是目前亟待研究的问题。本实验旨在诱变筛选果胶酶的高产菌株采用深层液体发酵法优化其发酵条件，为实现果胶酶的优质生产提供技术支撑。 二，研究内容 菌株的筛选菌株的鉴定酶的分离纯化酶学性质研究菌种的选育酶的改性酶反应器的设计 1，菌株的筛选 (1)初筛（初复筛平板培养基:1oomL查氏母液+0.5g果胶+2g琼脂糖)A.从曲阜师范大学果树下的泥土中取土样称取土样1土样2土样3进行三角瓶中灭菌,并在液体培养发酵基中35下富集培养12小时B.稀释涂布平板分别移取三个土样的富集培养液0.1mL,加入装有0.9mL无菌水的离心管中按101，102，103，104，105,106,进行稀释取稀释102-106的菌悬液各0.2mL涂平板,每个梯度涂两个平皿,三个土样共涂30个平皿35下恒温培养3天（2） 复筛A.平板复筛初筛平板张出后，用刚果红染色法进行平板染色后清洗观察透明水解圈（透明圈法较为较为简单，有效,是目前最为常用的产果胶酶菌株的筛选分离方法）测量菌落直径与透明圈直径，用接种针挑取水解圈较大若干菌落进行划线分离纯培养对划线菌落进行编号并记录其初筛水解圈直径及菌落直径水解圈直径划线平板于35恒温培养划线平板长出后,用接种针挑取单菌落点种与复筛平板上,在平板背面对点种菌落进行标记,35恒温培养2天,用0.05%刚果红溶液对复筛平染色,记录相应菌落的菌落直径与水解圈直径,同时接种到液体培养基中培养48h，测定发酵液中的果胶酶酶活2. 菌株的鉴定将筛选出的菌落直径与水解圈较大的菌进行纯种鉴定A.观察细胞的形态特征，观察其运动性，营养要求及生长条件。B.通过红外光谱，气相色谱和质谱等技术检测细胞组分。C.通过凝胶电泳的方法检测其蛋白质水平。D.通过16SRNA寡糖甘酸序列分析方法检测其基因或DNA水平。3. 酶的分离纯化A. 粗酶夜的制备由于产果胶酶菌是胞外酶产生菌，所以利用差速离心法去除培养液中的菌体B.硫酸铵盐析将制的的粗酶夜通过硫酸铵盐析沉淀（Kiyoshy等人采用85%饱和度的硫酸铵盐析从白绢病菌中提取了聚半乳糖醛酸酶,其纯化了 8倍,酶收率为52%。酶收率相对较高，故采用此法）C.层析果胶酶通过硫酸钱盐析之后,可以利用离子交换层析法对其进行更深一步的提纯。4. 酶学性质研究 A.最适作用pH分别用不同pH值(2.0一8.0)的磷酸氢二钠一柠檬酸缓冲液配制一定浓度的果胶溶液,按常规条件测定酶活。pH稳定性测定；将上述不同pH的缓冲液分别在设定的不同温度下处理2h后，再次测其酶活。B.最适作用温度试管中加入0.5ml,pH值4.2的l%果胶,预热5min,加入经适当稀释的酶液0.5ml,分别在35一65水浴条件下反应30min,测其酶活。50ml烧杯中加入4.0ml,pH值4.0的1%果胶,预热5min,加入经适当稀释的酶液1.0ml,分别在35一65水浴条件下反应60min,测定酶活。对热稳定性：粗酶液分别在3060C之间水浴中保温20min,立即冰浴,然后按常规条件测定三种果胶酶酶活。C.金属离子对酶活的影响在酶液中加入金属离子母液,使各金属离子的终浓度均为5mol/L,室温下静置30min,测定金属离子存在下的PG酶活力,以未加金属离子实验组的酶活力为100%。5. 菌种的选育结合山东省盛产梨的实际情况，将梨皮粉作为培养基的主要碳源进行菌株的选育将蛋白胨，无机离子，水，梨皮粉配制成液体培养基，将之前获得的透明圈直径较大的混合菌进行液体培养在三角瓶中摇床培养23天取出菌液再放入梨皮粉含量高的液体培养基中，并在摇床中培养2-3天，取出菌液。利用稀释涂布平板法将上述菌液接种到查式母液培养基上，使其在培养箱中培养，使其长出菌落。6. 对酶的改性利用蛋白工程方法对酶进行改造，使其能够适应发酵工厂的大规模生产。用此法可以有效快速地对酶进行改造，效果明显。7. 酶反应器的设计选用膜反应器进行酶膜反应器的设计，酶在反应容器中反应后，将反应液导出到膜分离器中，小分子的反应产物透过超滤膜排出，大分子的酶被超滤膜截留，再循环使用。一则可以将酶回收，循环使用；二则可以将产物及时的分离