猪仔大肠杆菌的分离鉴定及药敏试验.doc

仔猪大肠杆菌的分离鉴定及药敏试验 廖娟 任小春 唐萌 伍超 王钢*（乐山师范学院化学与生命科学学院，四川 乐山） 猪仔大肠杆菌病俗称白痢、黄痢，是由致病性大肠杆菌引起的急性肠道传染病。该疾病是常见且危害性极大的传染病之一。目前，各养猪场防治猪仔大肠杆菌病常用的方法仍然是用抗生素类的药物，但由于猪仔服用大量的抗菌药物，易造成细菌耐药性的的产生，因此需对分离出的细菌进行药敏性试验，进而为临床用药提供理论依据。针对乐山某种猪场提供的腹泻严重的仔猪白痢病料，我们进行了细菌分离鉴定和药敏试验，以期为仔猪大肠杆菌病的有效防治提供一些技术参考资料。1. 材料与方法1.1 材料1.1.1 病料的采集 从乐山某养猪场采集患白痢的猪仔肛门拭子病料12份。1.1.2 主要试剂 培养基及细菌鉴定用的生化试剂等由乐山师范学院化学与生命科学学院实验室提供。1.1.3 供试药片 头孢氨噻肟、氟苯尼考、左氟沙星、庆大霉素等含药纸片，购自杭州微生物试剂责任有限公司。1.1.4 试验动物 清洁级昆明系小白鼠雌雄各半，共10只，购自乐山长征制药厂。1.2 试验方法1.2.1 病原菌的分离培养 从乐山裕龙养猪场采集患有白痢猪仔的肛门拭子病料，将其浸入到灭菌生理盐水中，充分洗脱，将其悬浮液分别划线接种于麦康凯琼脂培养基上，37培养24h,然后挑取麦康凯琼脂培养基上的粉红色、表面光滑的单个菌落接种到营养琼脂斜面上，37培养24h后，置冰箱保存备用。1.2.2 菌体形态观察 将上述培养基上所得的菌落进行涂片，革兰氏染色，镜检，观察细菌形态以及染色特征，将符合大肠杆菌形态特征的进行生化试验，否则弃之。1.2.3 生化试验 将上述分离出的纯培养物进行糖发酵试验、吲哚试验、MR试验、VP试验、枸橼酸盐试验，观察其变化并记录结果。1.2.4 致病性试验 将符合生化反应符合大肠杆菌特性的菌株接种营养琼脂平板，37培养18h后，用生理盐水洗下菌落制成菌悬液。将小白鼠随机分为两组，其中一组每只皮下注射0.2ml菌悬液,另一组注射相同剂量的无菌生理盐水。将24-48h左右死亡的小鼠立即解剖，并且用接种环取其心血接种于营养琼脂培养基上，并对分离出的菌株进行进一步鉴定。1.2.5 药敏性试验 将稀释好的菌液每个平板接种0.1ml，使菌液铺满整个平板，待平板干后，用无菌镊子取各种药片贴于平板上，每个平板5张药片，每个药片之间的距离不小于3cm,将贴好药片的平板置于37的恒温箱中培养24h后观察实验结果并测出个药片的抑菌圈直径，并按照标准判定敏感，中度敏感和耐药情况。 2. 结果2.1 分离培养特性 在麦康凯琼脂培养基上均呈粉红色、光滑湿润、边缘整齐的菌落；在普通琼脂培养基上呈灰白色、圆形、整齐、隆起、光滑湿润的菌落，与大肠杆菌的形态特征相符。*通讯作者：王钢（1979），讲师，主要从事预防兽医学研究。Email：2.2 染色镜检 分离菌株革兰氏染色为阴性小杆菌，两端钝圆，多单个存在，与大肠杆菌染色特性相符。2.3 生化鉴定 分离出的菌株均能发酵葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇，均能产酸产气，大多数菌株不利用蔗糖，少数缓慢发酵，实验、枸橼酸盐试验均为阴性，吲哚试验、MR试验均为阳性，以上试验结果可证明分离出的菌株为大肠杆菌。2.4 致病性试验 试验组的小白鼠在接种后出现精神萎靡，进而出现拉稀等临床症状，接种10h后开始死亡，24h内全部死亡，解剖死小白鼠，均能见其内脏充满淤血，肝脏肿大，并且在心血和肝脏中能分离出大肠杆菌，而对照组的小白鼠无明显变化，由此可见，从猪仔肛门处分离出的大肠杆菌具有较强的致病性。2.5 药敏性试验 对分离出的菌株进行药敏性试验，其结果如表1所示。表1 分离菌株的药物敏感性试验结果抑菌药物判断标准抑菌圈直径(mm)判定结果耐药中敏敏感氟苯尼考1213-17185耐药丁胺卡那1314-161818敏感阿莫西林1314-16175耐药庆大霉素1213-141510耐药阿奇霉素1213-161528敏感恩诺沙星1516-202120中敏新霉素1213-141514中敏先锋1415-171810耐药头孢噻肟1415-22235耐药环丙沙星1314-151614中敏复方新诺明1213-16175耐药先锋1213-151610耐药磺胺异恶唑1213-16175耐药氨苄青霉素1213-15165耐药罗红霉素1213-16209耐药痢特灵1213-151618敏感福利平1617-192012耐药培氟沙星1213-151620敏感淋必治1414-161714中敏卡那霉素1314-171818敏感氯霉素1213-171812耐药强力霉素1213-26185耐药上述结果表明，分离菌对氟苯尼考、阿莫西林、庆大霉素、先锋、头孢噻肟、复方新诺明、先锋、磺胺异恶唑、氨苄青霉素、福利平、氯霉素、强力霉素12种药物具有的耐药性，对丁胺卡那、阿奇霉素、痢特灵、培氟沙星、卡那霉素五种药物较为敏感，对其余的药物中度敏感。3. 讨论3.1通过以上实验研究可以证明分离出的菌株为大肠杆菌，而且有较强的致病性，从药敏性试验结果可以看出该猪场的猪仔致病性大肠杆菌对氟苯尼考、头孢噻肟、阿莫西林、复方新诺明、氨苄青霉素、磺胺异恶唑、强力霉素七种药物具有较强的耐药性，而对丁胺卡那、阿奇霉素、痢特灵、培氟沙星、卡那霉素五种药物较为敏感，这为预防和治疗该病提供了理论依据。从研究结果也可以看出该致病性大肠杆菌对很多药物产生了较强的耐药性，这可能是因为该猪场的猪长期服用这些药物从而产生了耐药性，因此饲养员在给猪用药时要合理搭配，不能长期服用一种或几种药物，要定期更换，以免产生耐药性，而且还应该定期进行药敏性试验，以便指导临床用药。3.2随着养猪业的逐渐发展，在大型集约化的养猪场饲养密度较大，猪缺少运动，造成猪抵抗力下降，如不注意环境卫生，猪很容易被细菌感染，因此应该注意定期清扫猪圈，定期消毒，为猪的生长创造