PCR技术原理与操作.ppt

PCR技术原理与操作 主要内容 核酸的种类与功能DNA复制原理PCR发展简史PCR基本原理PCR体系各组分及作用PCR操作步骤及分析PCR技术的优缺点 脱氧核糖核酸 核糖核酸 核酸 核酸是细胞内携带遗传信息的物质 在生物体的遗传 变异和蛋白质的生物合成中起着极其重要的作用 种类 功能 简称DNA 简称RNA 一核酸的种类与功能 3 微生物分类 按核酸类型 1 DNA微生物 细菌 寄生虫类 附红细胞体 弓形体 衣原体 支原体DNA病毒疱疹病毒科 伪狂犬病毒 马立克病毒 传染性喉气管炎病毒和鸭瘟病毒 圆环病毒科 猪圆环病毒 鸡传染性贫血病毒 细小病毒科 猪细小病毒 犬细小病毒 番鸭细小病毒 鹅细小病毒 痘病毒科 鸡痘 山羊痘和绵羊痘 腺病毒科 减蛋综合征病毒和犬传染性肝炎病毒 2 RNA微生物 RNA病毒正粘病毒科 流感病毒副粘病毒科 新城疫病毒 犬瘟热病毒 小反刍兽疫病毒弹状病毒科 狂犬病病毒 牛流行热病毒冠状病毒科 鸡传染性支气管炎病毒 猪传染性胃肠炎病毒 猪流行性腹泻病毒 SARSV黄病毒科 猪瘟 乙型脑炎病毒 牛病毒性腹泻病毒小核糖核酸病毒科 口蹄疫病毒披膜病毒科 猪繁殖与呼吸综合征病毒双RNA病毒 传染性法氏囊病毒反转录病毒 禽白血病 牛白血病 马传染性贫血病毒 二DNA复制原理 半保留复制 三PCR发展简史 KaryB Mullis 1944 在Cetus公司工作期间 发明了PCR 他原本是要合成DNA引物来进行测序工作 却常为没有足够多的模板DNA而烦恼 1983年春夏之交的一个晚上 他开车去乡下别墅的路上萌发了用两个引物 而不是一个引物 去扩增模板DNA的想法 三PCR发展简史 Mullis开车的时候 瞬间感觉两排路灯就是DNA的两条链 自己的车和对面开来的车象是DNA聚合酶 面对面地合成着DNA 三PCR发展简史 四PCR基本原理 类似于DNA的体内复制 首先待扩增DNA模板加热变性解链 随之将反应混合物冷却至某一温度 这一温度可使引物与它的靶序列发生退火 再将温度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸 这种热变性 复性 延伸的过程就是一个PCR循环 PCR就是在合适条件下的这种循环的不断重复 模板DNA PCR原理 PCR的基本原理 PCR反应条件PCR过程PCR的特点 引物1 引物2 PCR的基本原理 PCR反应条件PCR过程PCR的特点 引物1 引物2 Taq酶 Taq酶 PCR的基本原理 PCR反应条件PCR过程PCR的特点 第1轮结束 第2轮开始 PCR的基本原理 PCR反应条件PCR过程PCR的特点 Taq Taq Taq Taq PCR的基本原理 PCR反应条件PCR过程PCR的特点 第2轮结束 PCR的基本原理 PCR反应条件PCR过程PCR的特点 模板DNA 第1轮扩增 第2轮扩增 第3轮扩增 第4轮扩增 第5轮扩增 第6轮扩增 重复1 3步25 30轮 目的DNA片段扩增100万倍以上 DNA双螺旋 DNA单链与引物复性 DNA变性形成2条单链 子链延伸DNA加倍 四PCR基本原理 1 PCR体系组分 引物 primer 酶 TaqDNApolymerase dNTP dATP dGTP dCTP dTTP 模板 template Mg2 magnesium 五PCR体系各组分及作用 1 模板模板作为DNA合成时的初始链 可以是DNA或cDNA分子 模板需要量一般为102 105拷贝 2 扩增缓冲液缓冲液有助于酶的稳定 是给聚合酶提供一个最适合酶催化反应条件 10 50mmol LTris Hcl pH8 3 8 8 3 耐热DNA聚合酶催化PCR反应 该酶是从Thermusaquaticus细菌中提取的特殊的耐热DNA聚合酶 可以耐受90 以上的高温而不失活 不需要每个循环加酶 使PCR技术变得非常简捷 同时也大大降低了成本 具有5 3 方向的聚合活性和外切活性 2 各要素作用 五PCR体系各组分及作用 美国Yellowstone公园的热泉 嗜热水生细菌Thermusaquaticus 1988年saiki从嗜热水生菌ThermusaquaticsYT 1株中直接分离出来 该菌株于1969年从美国黄石国家森林公园火山温泉中分离到 4 4种dNTP混合物四种脱氧核苷酸 是DNA的原料 dNTP的通常使用浓度为20 200 mol L 5 引物作为合成起始的识别点 从引物末端开始延伸 合成整条链 通常使用浓度为0 1 0 5 mol L 6 Mg2 Mg2 是DNA聚合酶的激活剂 Mg2 与dNTP以及DNA模板结合形成复合体 只有这种复合体才能被DNA聚合酶识别 通常使用浓度为0 5mmol L 2 5mmol L 五PCR体系各组分及作用 六PCR操作步骤与结果分析 1 RNA DNA提取2 RNA的反转录3 PCR扩增4 电泳分析产物 1 RNA DNA提取 1 异硫氰酸胍法和Trizol提取法 RNA 2 酚 氯仿提取法和DNAzol提取法 DNA 3 柱子提取法 4 全自动核酸提取法 1 Trizol提取RNA法 取1 5mL灭菌Eppendorf管 每管加入300 L裂解液 然后分别加入待测样品 阴阳性对照各100 L 吸头反复吸打混匀 一份样品换用一个吸头 室温放置2 5min 再加入100 L氯仿 充分颠倒混匀 不宜过于强烈 于4 条件下 12000r min离心15min Trizol使细胞结构降解 核蛋白迅速与核酸分离 加入氯仿 有变性蛋白质的作用 主要用处是用来分相 加速有机相和水相的分层 吸取离心后各管中的上清液150 L转移至新的1 5mL灭菌Eppendorf管中 注意不要吸出中间层 要缓慢出 加入150 L 20 预冷的异丙醇 颠倒混匀 室温放置15min 异丙醇沉淀 优点是容积小且速度快 主要沉淀核酸 1 Trizol提取RNA法 4 条件下12000r min离心15min Eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置 轻轻倒去上清 倒置于吸水纸上 吸干液体 不同样品应置于吸水纸不同地方沾干 加入1mL75 乙醇 轻轻颠倒洗涤 4 条件下12000r min离心5min Eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置 轻轻倒去上清液 倒置于吸水纸上 沾干液体 不同样品应在吸水纸不同地方沾干 乙醇主要是洗涤异丙醇 也可以溶解一部分蛋白 1 Trizol提取RNA法 4 条件下12000r min离心30s 将管壁上的残余液体甩到管底部 用微量加样器尽量将其吸干 一份样本换用一个吸头 注意 滴头勿接触沉淀 真空抽干3 5min或室温干燥10min 不宜过于干燥 以免RNA不溶 加入11 LDEPC水 轻轻吹打混匀 溶解管壁上的RNA 2000r min离心5s 冰上保存备用 提取的RNA须在2h内进行RT PCR扩增或放置于 70 冰箱备用 注意事项 RNA提取时 要戴口罩 手套 所用EP管 滴头及相关容器等要清洁 用0 1 DEPC水处理12h以上再经高压处理 烘干后方可使用 要有专用操作台 在超净工作台或生物安全柜进行操作 所有试剂应在规定的温度储存 使用后立即放回 异丙醇和75 乙醇要放在 20 预冷 加样和混匀时一份样品要换用一个吸头 不同样品加同一试剂时吸头要悬空加入 避免交叉污染 加入Trizol试剂后要作用一定时间 5min 使其充分裂解释放RNA 吸取水相RNA时 要避免吸到中间液面 蛋白质层 从而保证RNA纯度 要小心 细致 晃动及每次移液要轻 这样做的目的 一是小心RNase的污染降解RNA 二是动作过大会破坏RNA的完整性 要勤换手套 操作过程速度要快 2 DNA提取 样品采集 取病死或扑杀的动物组织 活体动物可取血清 咽喉或鼻腔拭子 样品处理 每份样品分别处理 组织样品处理 称取待检病料0 2g置组织研磨器中剪碎并研磨 加入600 L裂解液继续研磨 取已研磨好的待检病料离心后取上清100 L加入1 5mL灭菌离心管中 再加入500 L裂解液和10 L蛋白酶K 混匀后 置55 水浴中30min 1h 全血样品 咽喉或鼻腔拭子的处理 血凝后 8000rpm离心5min 取血清100 L 咽喉或鼻腔拭子向其中加入300 500 L的PBS混悬液 10000rpm离心5min 取上清100 L 加入500 L裂解液和10 L蛋白酶K 混匀后 置55 水浴中30min 1h 裂解液使组织变性 释放DNA 蛋白酶K主要降解组织中的天然蛋白 2 DNA提取 样品DNA的抽提自水浴锅中取出已处理的样品 加500 L酚 氯仿 异戊醇 用之前不要晃动 不要吸到上层保护液 颠倒混匀 12000rpm离心10min 酚 氯仿 异戊醇 使DNA从组织中游离到水相 与蛋白分开 取约500 L上清置于灭菌离心管中 加入500 L异丙醇 混匀 室温沉淀10 20min 异丙醇主要沉淀DNA 取出样品管 13000rpm离心15min 弃上清 加入700 L70 乙醇 轻弹管壁以使沉淀充分悬浮 12000rpm离心5min 弃上清 将离心管倒扣于吸水纸上1min以吸干残液或10000rpm空离30sec后用移液器吸去残液 注意 滴头勿接触沉淀 再将离心管50 烘干或真空抽干15min 以无乙醇味为准 乙醇主要是洗涤异丙醇 也可以溶解一部分蛋白 取出样品管 用10 20 L灭菌的去离子水溶解沉淀 作为模板DNA备用 32 全自动提取核酸 实现自动化 提高了RNA提取效率和纯度 适合高通量检测 32份样品 时间35min 全自动核酸提取仪 3 RNA的反转录 cDNA的合成 取RNA10 L加入反转录反应体系中 37 水浴1h后 直接用于下面的PCR反应或 20 冻存备用 4 PCR扩增 取RNA反转录产物或提取的DNA DNA直接进行扩增 2 L加入PCR反应体系中 总体系25 L 扩增条件为95 5min后 94 45sec 56 45sec 72 45sec共35个循环 最后72 延伸10min 取TAE缓冲液50倍稀释后用于配制1 5 的琼脂糖凝胶及作电泳缓冲液用 取10 LPCR产物 混于2 L6 上样缓冲液液中 电泳分析PCR产物 以DN