雌二醇检测.doc

雌二醇检测步骤用ACCESS免疫分析系统定量检测血清雌二醇的浓度 内容表原理2标本采集2试剂和仪器3定标5质量控制5检测步骤5检测结果6开始检测6检测注意事项7参考文献8Beckman Instruments, Inc. Chaska, MN 55318原理检测原理Access 雌二醇的检测是一种使用了延时加入酶结合物的竞争结合的酶免疫检测。样品和包被了羊抗兔抗体：兔抗雌二醇捕捉抗体的磁性颗粒，以及含蛋白的Tris 缓冲液一起被加入到反应管中，20min以后，加入雌二醇-碱性磷酸酶结合物。样品中的雌二醇与雌二醇-碱性磷酸酶结合物竞争结合有限的特异性雌二醇抗体的结合位点，最后抗原-抗体复合物通过捕捉抗体结合到磁性颗粒表面。而后，反应管被传送到磁性分离区域进行多次冲洗，去处未和固相结合的其它成分。最后在反应管中加入化学发光底物（Lumi-Phos* 530）, 该反应所产生的光子并被光电比色计所检测。光子的产量与样品中的雌二醇的浓度呈反比，最后，对照仪器中储存的多点定标曲线中所描述的光量子与标准品雌二醇的对应关系而计算出样品中的雌二醇浓度。 概述雌二醇是一种分子量为272.3道尔顿的天然雌性激素。血循环中大多数的雌二醇与蛋白质结合，大约有13%的雌二醇以游离（未结合）形式存在与血清中。在非孕期的妇女中，雌二醇由卵巢和黄体分泌。肾上腺和睾丸（男性）也能分泌少量的雌二醇。月经期的雌二醇的水平最低，在卵泡期的早期开始上升，并在卵泡期的晚期先于hLH（人体黄体生成素）出现一个高峰，开始进入排卵期，hLH出现高峰时，雌二醇的水平在黄体期再次升高。雌二醇和孕激素刺激子宫内膜的增生，为受精卵的种植作准备。如果未受孕，黄体分泌的雌二醇和孕激素分泌减少，开始进入月经期。雌二醇的水平对于监测卵巢的状态有用，因为雌二醇的水平能反映卵泡的成熟，雌二醇的测定对于评估性发育水平，闭经病因，不孕和停经的原因是一个有价值的工具。男性雌二醇的异常高水平则预示女性化综合征如男性乳房发育。标本采集A. 血清是推荐的样品类型。B.遵循以下标本处理、运行和储存步骤(8，9)：1、真空采样管采集所有血液标本时须遵守常规注意事项。2、离心前使标本完全自然形成凝块。3、全程保证样品管的密闭状态。4、离心获得血清后的两小时内，至少将500 ml血清或血浆转移到一个密闭的储存试管中备用。5、储存样品，保持样品管完全密闭，在室温(15 到 30C)条件下不超过8小时。6、如果8小时内不能完成检测即应将标本放入2 到 8C冰箱冷藏。7、如果24小时内不能完成检测即应将标本放入-20C冰箱冻藏。 8、标本只能复融一次。C. 如果血清中的雌二醇浓度约为950pg/ml时，样品中至多含有10mg/dl (171 mol/l) 的胆红素，脂血样品中含甘油三脂1800mg/ml（20.32mmol/L）和溶血标本含有最多1 g/dl(10g/l)的血红蛋白外时不影响雌二醇浓度的测定。试剂和必须品Beckman Instruments, Inc.4300 Harbor BlvdFullerton，Ca 92834A.R1:Access Estradiol 试剂盒： 2 盒装货号：33540， 100 个测试，50测试/盒现成可用；在2到 10C冰箱中顶端朝上存放；试剂盒必须在2到 10C冰箱保存2小时后才能放入仪器中使用或保存；210C保存，试剂在有效期内稳定；试剂盒被吸取使用后，在2 到10C条件下可稳定14天；出现橡胶层破坏或质控结果超出范围等现象出现即代表试剂盒失效。所有抗血清均为多抗，除非有专门说明。1.R1a:含包被有羊抗兔IgG 的磁性颗粒，含兔抗雌二醇的Tris缓冲液，小牛血清白蛋白(BSA)， 0.1% 的叠氮钠。2.R1b:Tris缓冲液，氯化钠，小牛或羊血清白蛋白(BSA)， 0.1% 的叠氮钠。3.R1c:雌二醇-碱性磷酸酶结合物，兔血清白蛋白(BSA) ， 0.1%的叠氮钠。B.Access 雌二醇定标品货号：33545， S0：4.0 ml/瓶；S1S5：2.5ml/瓶；定量检测的定标是用已知分析浓度的标本进行检测以观察光量子值。光量子值和已知浓度之间的数学关系就构成了定标曲线。定标曲线储存于仪器中，可将样本检测中得到的光量子值转化成特定的分析浓度。 现成可用，使用前轻轻颠倒混匀，避免产生气泡，在210环境可稳定到定标品瓶标签上标出的失效 期。质控结果落到允许的范围之外是定标品失效的信号。定标操作步骤请参见Access免疫分析系统的操作指南和参考手册。1.S0: 人血清， 0.1% 的叠氮钠和0.0125% Cosmocil* CQ ，含有0.0 ng/ml (nmol/l) 的雌二醇。2.S1, S2, S3, S4, S5:：人血清中含雌二醇浓度大概为100，500,，1500，2500， 及3600 pg/ml (大概367，1836，5507，9178和13216 pmol/l)， 0.1% 的叠氮钠和0.0125% Cosmocil* CQ ，准确浓度详见瓶上标签。3. 定标卡：1C.Access 底物货号为 81906: 4 瓶x 130 ml/瓶。现成可用，下表注明了储存条件和稳定性，底物本底检测值的增高提示底物的不稳定。前提储存稳定性未开瓶2 到8C可一直保存到标签注明的失效期使用前的平衡(未开瓶)15 到30C (室温条件)至少18 小时最长 14天使用中(已开瓶)内部底物支持位置最长 5天使用中 (已开瓶)外部液体架的底物位置最长14天R2 底物：Lumi-Phos 530 (缓冲液中包含有 dioxetane Lumigen* PPD,荧光素和离子表面活性剂量)。按照Access仪器操作指南中介绍的使用方法使用。D. Access 冲洗缓冲液货号：81907 4 x 1950 ml/箱现成可用。在室温条件下(15 到 30C)可稳定到包装上注明的失效期。底物本底检测值的增高或在“双抗”体夹心法中的0点定标品的相关发光值的增高则提示冲洗缓冲液的不稳定。R3 冲洗缓冲液：Tris 盐缓冲液，离子表面活性剂， 0.1 %的叠氮钠和 0.1% ProClin 300。按照Access仪器操作指南中介绍的使用方法使用。E.质控品：商用质控血清（不正常浓度和正常浓度值）F.Access 免疫分析系统和消耗品G.警告和注意点 1.只可用于体外诊断。2.病人样品和血制品应按照阐述的最底危险性的常规操作进行操作，将这些物品当作潜在的传染物品，按照常规操作注意点和优秀实验室的操作常规进行处理，无论该些物质是原型、处理物或离得到保证前。用合适的消毒剂进去污。按照各实验室规定和操作规程存放和处理该些物品及其容器。3.试剂中所含的叠氮钠可以和铅和铜反应形成有高度腐蚀性的重氮金属盐，如果被溅到含该物质的液体，则可用大量水冲洗来防止重氮的堆积(4)。4. 底物暴露在空气中容易衰变，应保持瓶口紧盖，不要将不同瓶的底物相混后使用。5. 用作准备定标品的每个混合血清/血浆以作检测，未发现含纤维蛋白。6.用来制备定标品的人源性物质已作检测，未发现已肝病毒抗原(HBsAg)、丙肝抗体(HCV-Ab)和人免疫缺陷病毒抗体(HIV1-Ab 和HIV2-Ab)存在。因为没有一个测试方法的阴性能完全保证没有感染源，因此处理试剂和样品时应视为在传递感染性疾病样品一样(9)。7.ProClin 300 是潜在的皮肤过敏物质，避免溅到或洒到皮肤和衣服上，如果发生，用清水彻底冲洗。定标每个测试均需有效的定标曲线，雌二醇的定标曲线有效期为14天，参见操作向导和参考手册来了解定标步骤。操作指南中的6.1章节阐述了暂时的重定标需要和系统选择定标的需要。Access 雌二醇测试提供了6个浓度点的定标品，0 和大概100，500，1500，2500和3600 pg/ml (大概为367，1836，5507，9178和13216 pmol/l)，由合成的雌二醇和人血清按称重法合成，Access Estradiol定标曲线参考了USP指标，有效期为14天。质控质控品与样品的性质类似，是监测免疫化学分析正常工作的必须品。因为样品可在有随机检测能力的仪器中随机检测而非批量检测，所以质控品应该包含在整个24小时的时间段内。商用质控品将包括至少三个浓度质控品，按照厂家规定进行复溶和保存。在正式使用前每个实验室均应建立各自得平均值和可接受范围，质控结果没有落在可接受范围提示检验结果无效。重新检查位于上一次有效质控值到这次无效质控值之间所有得检测结果。参见操作指南来了解如何回顾质控结果。步骤A.Access 仪器 参见 Access 免疫分析系统的操作向导来准备和操作。B.分析步骤1. 从主菜单进入测试要求屏幕。2. 对每个样品，设置一个样品架上的位置，输入样品信息和需检测的测试名称。3. 将样品管（杯）放入样品架中已设定的位置。4. 按下运行键（ Run）开始检测。5. 仪器会提醒操作者运行所需的定标。 6. 系统会自动计算检测结果。结果A.系统软件会按照四参数曲线计算模式（four-parameter logistics curve math model）自动计算病人结果。样品中检测到的光量子值会与储存的标准曲线对应求得相应结果，病人检测结果可通过“样品结果菜单”（ Sample Results screen）回顾，如何回顾结果请参见操作规程。B.正常参考范围1.每个实验室应均应针对各种有代表性的特殊人群建立自己的参考范围。2.用Access 雌二醇检测方法检测对健康成年男女性的血清中雌二醇的浓度下面表格中的雌二醇浓度范围就是代表了一个群体。指示人群N中位值(pg/ml)95% 可信区间 (pg/ml)男性绝经前期的女性*9791312520 - 7520 - 88* 不包括激素治疗.指示人群N中位值(pg/ml)样品范围(pg/ml)未怀孕的女性- 卵泡中期*- 排卵前期*- 黄体中期*3731336428614224 - 11462 - 53480 - 273*范围指hLH出现高峰日-6，-7，-8；*范围指hLH出现高峰日-1； *范围指hLH出现高峰日后6，7，8。操作规程解释A.关于安装介绍、开机、操作原理、系统主要特点、操作指导、定标步骤、操作限制和注意事项、危险事项、保养和故障的排除等请参见操作向导和参考手册。B.在装入仪器前，将试剂轻轻的颠倒混匀几次，不要颠倒已用试剂，通过轻轻旋转的方式混匀试剂。C.每次测试使用55mI的样品，但要考虑到样品杯和样品管的死体积，各种容器的死体积大小请参见操作手册中的的样品容器章节。D.样品结果的报告单位为ng /ml，但是，系统也可报告国际系统单位(SI 单位，nmol/l)，参见参考手册的“系统设置”章节来了解单位的互换。手工换算将ng /ml乘以1.281即可得到国际单位。E.由于在体外诊断中可能出现干扰反应，因此可通过两次检测来确定完整的分析结果。检测注意事项A.在可报告范围内（约203600pg/ml）样品的浓度可精确检测，如果样品中的雌二醇浓度高于Access 雌二醇定标S5，以超出正常值报告结果，或着用S0对样品作一比一稀释，在得出稀释样品结果后对测定值乘2。具体的操作和稀释前样品的处理见操作指南，如果样品的雌二醇浓度低于下限，则报告低于20 pg/ml。B.Access 雌二醇的检测结果的解释应结合病人所有的临床表述，包括病史，另外测定的结果及其他适当的信息。C 妇体内的雌二醇浓度受高浓度雌三醇的影响，特别是出现在怀孕的中，末三个月。质控原料或取得的样品如果出现高浓度雌三醇，也会造成同样的结果。Access is a trademark of Beckman Instruments, Inc.*Lumi-Phos 530 and Lumigen are trademarks of Lumigen, Inc.*Cosmocil CQ is a trademark of Zeneca Ltd.*ProClin 300 is a trademark of Rohm and Haas Company, or of its subsidiaries or affiliates.参考文献Beckman Coulter, Inc. Access Estradiol product insert, Fullerton, CA 92834, 105234.Beckman Coulter, Inc. Access Substrate product insert, Fullerton, CA 92834, 170279.Beckman Coulter, Inc. Access Wash Buffer product insert, Fullerton, CA 92834, 170278.1. Tietz Textbook of Clinical Chemistry, 2nd Edition. 1994. Edited by Burtis, C.A. and Ashwood, E.R. Philadelphia, PA: W.B. Saunders Co., 1857-1863.2.Yen, S.S.C. 1991. The Human Menstrual Cycle- Neuroendocrine regulation. In Reproductive Endocrinology. Edited by Yen, S.S.C. and Jaffe, R.B. Philadelphia, PA: W.B. Saunders Co., 273-308.3.Carr, B.R. 1992. Disorders of the ovary and female reproductive tract. In Williams Textbook of Endocrinology, 8th edition. Edited by Wilson, J.D. and Foster, D.W. Philadelphia, PA: W.B. Saunders Co., 733-798.4.Hall, J.E. 1993 Polycystic ovarian disease as a neuroendocrine disorder of the female reproductive axis. In Endocrinology and Metabolism Clinics of North America, Neuroendocrinology II. Edited by Veldhuis, J.D. Philadelphia, PA: W.B. Saunders Co., 75-92.5.Reyes-Fuentes, A. and Veldhuis, J.D. 1993. Neuroendocrine physiology of the normal male gonadal axis. In Endocrinology and Metabolism Clinics of North America. Edited by Velduis, J.D. Philadelphia, PA: W.B. Saunders Co., 22:93-124.6.HHS Publication No. 93-8395, 3rd ed. May 1993. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Washington, DC: U.S. Department of Health and Human Services.7.Manual Guide - Safety Management No. CDC - 22. Decontamination of Laboratory