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浅谈PCR技术学生：柴娟娟 学号：21014087 专业：土壤学1 PCR技术概述聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction ,PCR)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究 的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研 究和检测鉴定。过去几天几星期才能做到的事情，用PCR几小时便可完成。PCR技术是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑。1.1 PCR技术的简史核酸研究已有100多年的历史，本世纪60年代末、70年代初人们致力于研究基因的体外分离技术，Korana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想：“经过DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因”。 1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。其原理类似于DNA的体内复制，只是在试管中给 DNA的体外合成提供以致一种合适的条件-摸板DNA，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合适的缓冲体系，DNA变性、复性及延伸的温度与时间。 Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌DNA聚合酶I的 Klenow片段，其缺点是：Klenow酶不耐高温，90会变性失活，每次循环都要重新加。引物链延伸反应在37下进行，容易发生模板和引物之 间的碱基错配，其PCR产物特异性较差，合成的DNA片段不均一。此种以Klenow酶催化的PCR技术虽较传统的基因扩增具备许多突出的优点，但由于 Klenow酶不耐热，在DNA模板进行热变性时，会导致此酶钝化，每加入一次酶只能完成一个扩增反应周期，给PCR技术操作程序添了不少困难。这使得 PCR技术在一段时间内没能引起生物医学界的足够重视。1988年初，Keohanog改用T4 DNA聚合酶进行PCR，其扩增的DNA片段很均一，真实性也较高，只有所期望的一种DNA片段。但每循环一次，仍需加入新酶。1988年Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermus aquaticus) 中提取到一种耐热DNA聚合酶。此酶具有以下特点：耐高温，在70下反应2h后其残留活性大于原来的90%，在93下反应2h后其残留活性是原来的 60%，在95下反应2h后其残留活性是原来的40%。在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶。大大提高了扩增片段特异性和扩增效 率，增加了扩增长度(2.0Kb)。由于提高了扩增的特异性和效率，因而其灵敏性也大大提高。为与大肠杆菌多聚酶I Klenow片段区别，将此酶命名为Taq DNA多聚酶(Taq DNA Polymerase)。此酶的发现使PCR广泛的被应用。 1.2 PCR技术的原理类似于DNA的 天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：模板DNA的变性：模板DNA经加 热至93左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；模板DNA与引 物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；引物的延伸：DNA模板-引物结合 物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需 24分钟，23小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。 PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。反应最终的DNA 扩增量可用Y(1X)n计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平(Y)均每次的扩增效率，n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%， 但在实际反应中平均效率达不到理论值。反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进 入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应”，这种效应称平台期数、PCR扩增效率及DNA聚合酶PCR的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素。大多数情 况下，平台期的到来是不可避免的。 PCR扩增产物 可分为长产物片段和短产物片段两部分。短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5端之间，是需要扩增的特定片段。短产物片段和长产物片段是由于引物所 结合的模板不一样而形成的，以一个原始模板为例，在第一个反应周期中，以两条互补的DNA为模板，引物是从3端开始延伸，其5端是固定的，3端则没 有固定的止点，长短不一，这就是“长产物片段”。进入第二周期后，引物除与原始模板结合外，还要同新合成的链(即“长产物片段”)结合。引物在与新链结合 时，由于新链模板的5端序列是固定的，这就等于这次延伸的片段3端被固定了止点，保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列以内、形成长短一致的 “短产物片段”。不难看出“短产物片段”是按指数倍数增加，而“长产物片段”则以算术倍数增加，几乎可以忽略不计， 这使得PCR的反应产物不需要再纯化，就能保证足够纯DNA片段供分析与检测用。 1.2 PCR技术的特点1.2.1特异性强 PCR反应的特异性决定因素为： 引物与模板DNA特异正确的结合； 碱基配对原则； Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性； 靶基因的特异性与保守性。 其中引物与模板的正确结合是关键。引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的。聚合酶合成反应的忠实性及Taq DNA聚合酶耐高温性，使反应中模板与引物的结合(复性)可以在较高的温度下进行，结合的特异性大大增加，被扩增的靶基因片段也就能保持很高的正确度。再通过选择特异性和保守性高的靶基因区，其特异性程度就更高。 1.2.2 灵敏度高 PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克(pg=10-12g)量级的起始待测模板扩增到微克(ug=10-6g)水平。能从100万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的检测中，PCR的灵敏度可达3个RFU(空斑形成单位)；在细菌学中最小检出率为3个细菌。 1.2.3 简便、快速 PCR反应用耐高温的Taq DNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在DN扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应，一般在24 小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广。 1.2.4 对标本的纯度要求低 不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA 粗制品及总RNA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNA扩增检测。 2 PCR技术的应用前景2.1 PCR技术的应用实例PCR技术自从建立以来，由于其敏感、高效、操作简便，在分子生物学研究、临床医学和其他很多领域中得到了广泛的应用。2.1.1 分子生物学理论研究如：制备cDNA文库与筛选，既费钱费时，又需要较多的组织。但如果用PCR技术，只要很少的组织甚至几个细胞就可以构建cDNA文库，并且大大提高了工作效率。再如：DNA测序、检测突变碱基、基因重组与融合、用简并引物法扩增未知序列，无不是PCR技术在分子生物学中的应用。2.1.2 临床医学如：病原体诊断，利用PCR技术可以检测标本中的病毒、细菌、支原体，甚至寄生虫等病原生物，标本可以是组织、血液、细胞、分泌物、排泄物等。以后还发展了遗传病基因的诊断、组织器官移植的配型选择、肿瘤的诊断转移和确定、法医学和其他临床医学领域。2.1.3 考古学由于PCR技术对基因组的完整性要求不要，因而对分子考古学极为有帮助，可判定生物种类间的亲缘关系、进化途径等。如：1997年德国慕尼黑大学动物研究所科学家宣称，他们对欧洲原始人欧洲尼安德特人化石中的基因残余物进行分析，结果表示著名的欧洲原始人尼安德特人不是欧洲现代人的祖先，这一结果又得到了英国、俄罗斯和瑞典科学家的进一步证实，为现代人的起源提供了新的论据。2.1.4 其他领域 PCR技术还在动植物研究领域、组织和群体生物学等领域已经得到了广泛的应用。2.2 PCR技术的应用前景结合对以上PCR技术的了解，我认为PCR技术可以加快实现它的工程化、效益化，如：应用在现代环境工程污水处理工程的微生物载体研究上，PCR技术暂时只是致力于理论方面和研究方面，它并没有像其他微生物技术那样给人类社会带来大规模的经济利益，假如可以实现这一设想，那么不但PCR技术本身可以得到更加快速的发展，而且我们还可以促进经济的发展。比如说：在传统的生物发酵技术上可以结合PCR技术，利用DNA在体外的复制和杂交，并实现表达，可以实现基因工程的超远缘杂交的物种突破难进行的问题：再比如：可以通过PCR技术实现核酸杂交技术，核酸杂交法比抗原捕获特异、敏感，但半衰期短，放射性污染不易处理，显影时间长等缺点，目前国外常用的生物素检测标本中致癌物质。另外，还有很多微生物的PCR技术在工程上的应用，这里就不一一列举了。关键是怎样扩大在工程上的应用，以扩大经济效益。这是PCR技术的关键。PCR技术运用传统生物技术结合近代基因工程原理，包含反转录PCR技术、定量PCR技术、实时荧光定量PCR技术、重组PCR技术、反向PCR技术、多重PCR技术、不对称PCR技术等多种传统PCR技术和原位PCR技术、巢式PCR技术等一系列新兴PCR技术。最新的进展如：结核杆菌诊断PCR；病毒学PCR技术；HIV感染PCR；检测人COX病；DMS/BM