高级微生物作业.doc

1、 胡克、列文虎克、科恩的贡献一、 胡克：1665年设计了结构复杂的显微镜；观察软木片的构成，命名“细胞”并沿用至今。观察了大量的矿物、植物、动物，发表了显微图集。将显微镜应用于生物研究，引发了人们对于细胞学的研究。二、 列文虎克：磨制透镜，放大率达到270倍；显微观察细菌、原生动物并测算大小；首次描述昆虫、狗和人的精子；描述红细胞并证明马尔皮基的毛细血管真实存在；观察到轮虫，追踪低等动物及昆虫的生活史。对细菌学和原生动物学的研究发展起奠基作用。三、 科恩：2、 第二次世界大战以来微生物的重要进展：一、 青霉素的发现和大规模生产；微生物发酵工程；二、 基因工程操作使重组细菌产生新的物质；三、 微生物的研究进入分子水平；微生物基因组工程，发现功能基因并研制疫苗；从分子水平对微生物进行基因组研究，为探索微生物个体与群体间作用提供新的线索和思路。四、 人类病原微生物基因组研究设计新型疫苗开发新型抗微生物药物；五、 工业微生物基因组研究不断发现新的特殊酶基因和功能基因；六、 农业微生物基因组研究认清致病机制发展控制病害的新对策；七、 环境保护微生物基因组研究找到关键基因降解不同污染物；八、 极端环境微生物微生物基因组研究深入认识生命本质应用潜力极大1941年，GW比德尔和EL塔特姆用X射线和紫外线照射链孢霉，使其产生变异，获得营养缺陷型。他们对营养缺陷型的研究不仅可以进一步了解基因的作用和本质，而且为分子遗传学打下了基?944年，OT埃弗里第一次证实了引起肺炎球菌形成荚膜遗传性状转化的物质是脱氧核糖核酸（DNA）。1953年，JD沃森和FHC克里克提出了DNA分子的双螺旋结构模型和核酸半保留复制学说。H富兰克尔-康拉特等通过烟草花叶病毒重组试验，证明核糖核酸（RNA）是遗传信息的载体，为奠定分子生物学基础起了重要作用。其后，又相继发现转运核糖核酸（tRNA）的作用机制、基因三联密码的论说、病毒的细微结构和感染增殖过程、生物固氮机制等微生物学中的重要理论，展示了微生物学广阔的应用前景。1957年，A科恩伯格等成功地进行了DNA的体外组合和操纵。近年来，原核微生物基因重组的研究不断获得进展，胰岛素已用基因转移的大肠杆菌发酵生产，干扰素也已开始用细菌生产。现代微生物学的研究将继续向分子水平深入，向生产的深度和广度发展。1949年，S A瓦克斯曼在他多年研究土壤微生物所积累资料的基础上，发现了链霉素。此后陆续发现的新抗生素越来越多。这些抗生素除医用外，也应用于防治动植物的病害和食品保藏。5、基因组是什么？真核和原核生物基因组排布有何不同？你知道现在测基因组的方法和过程。一、基因组：生物所携带的遗传信息的总和。二、真核生物基因组特点：1.基因组较大。真核生物的基因组由多条线形的染色体构成，每条染色体有一个线形的DNA分子，每个DNA分子有多个复制起点。 2.不存在操纵子结构。真核生物的同一个基因簇的基因，不会像原核生物的操纵子结构那样，转录到同一个mRNA上。 3.存在大量的重复序列。真核生物的基因组里存在大量重复序列，通过其重复程度可将其分成高度重复序列、中度重复序列、低度重复序列和单一序列。 4.有断裂基因。大多数真核生物为蛋白质编码的基因都含有“居间序列”，即不为多肽编码，其转录产物在mRNA前体的加工过程中被切除的成分。 三、原核生物基因组特点1.基因组较小，通常只有一个环形或线形的DNA分子。 2.基因组的大部分序列是用来编码蛋白质的，基因之间的间隔序列很短。 3.功能相关的序列常串连在一起，由共同的调控元件调控，并转录成同一mRNA分子，可指导多种蛋白质的合成，这种结构称操纵子。四、测序技术：荧光标记的Sanger 法 在分子生物学研究中，DNA的序列分析是进一步研究和改造目的基因的基础。目前用于测序的技术主要有Sanger（1977）发明的双脱氧核糖核酸链末端终止法，目前Sanger测序法得到了广泛的应用。Sanger法是根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，并且在每个碱基后面进行荧光标记，产生以A、T、C、G结束的四组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测，从而获得可见的DNA碱基序列。 Sanger法测序的原理就是，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)使之扩增，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)使之终止。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止，终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几个至千以上个，相差一个碱基一系列片断。它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。 第2 代测序技术循环阵列合成测序法 述第2 代测序技术中, 序列都是在荧光或者化学发光物质的协助下, 通过读取DNA 聚合酶或DNA 连接酶将碱基连接到DNA 链上过程中释放出的光学信号而间接确定的. 除了需要昂贵的光学监测系统, 还要记录、存储并分析大量的光学图像.这都使仪器的复杂性和成本增加. 依赖生物化学反应读取碱基序列更增加了试剂、耗材的使用, 在目前测序成本中比例相当大. 直接读取序列信息, 不使用化学试剂, 对于进一步降低测序成本是非常可取的.在一个正在发生突破瓶颈巨变的领域内, 很难准确预测未来将发生什么. 第3 代测序技术直接测序将基因组DNA 随机切割成大约100 kb 左右的片段,制成单链并与六寡聚核苷酸探针杂交. 然后驱动结合了探针的基因组文库片段通过可寻址的纳米孔阵列. 通过每个孔的离子电流均可独立测量. 追踪电流的变化确定探针杂交在每个基因组片段上的精确位置. 利用基因组片段上杂交探针的重叠区域将基因组片段文库排列起来, 建立一组完整的基因组探针.Margulies等人发明了一种平行的而且简单的DNA测序系统。这种测序系统能够在4小时左右的时间里以99以上的准确率测定250万碱基对。在技术水平上，这种方法的测序速度比传统的Sanger测序法提高了大约100倍。这种方法的一个重要的技术优势在于样品的制备。通过断裂基因组得到的短的DNA随机片断的文库被吸附在念珠上，然后被乳化（emulsified），进入发应孔（reaction wells）中扩增和测序，因此不需要亚克隆（subclone）每个片断。为了验证这种方法的准确性，研究者用鸟枪法（shotgun sequencing）测序并重新拼接了生殖器支原体的基因组（Mycoplasma genitalium genome）（0.58megabase）。新方法测序结果覆盖了96，准确率达到了99.96%。在以肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）的基因组（2.1megabase）为样本时得到了同样的结果。6、 什么是内共生理论？有哪些证据？一、内共生学说(endosymbiont hypothesis)关于线粒体起源的一种学说。认为线粒体来源于细菌，即细菌被真核生物吞噬后,在长期的共生过程中,通过演变,形成了线粒体。该学说认为:线粒体祖先原线粒体(一种可进行三羧酸循环和电子传递的革兰氏阴性菌)被原始真核生物吞噬后与宿主间形成共生关系。在共生关系中,对共生体和宿主都有好处：原线粒体可从宿主处获得更多的营养,而宿主可借用原线粒体具有的氧化分解功能获得更多的能量.二、（1）共生是生物界的普遍现象，例如根瘤菌与豆科植物的共生关系，蓝藻或绿藻与真菌共生形成地衣等。有一种草履虫（Paramoeciumbursaria），其体内有小的藻类与之共生，并能进行光合作用；过去说澳洲白蚁消化道内生活着一种所谓混毛虫（Mixotricha paradoxa），实际由两种螺旋体、两种真细菌和一种纤毛虫组成，它们能分泌有关的酶，消化纤维素。特别是近年发现的灰孢藻（Glancocystis），它本身并无叶绿素，但有许多叶蓝小体（cyanella）生活在体内，进行光合作用制造食物。这种共生关系看来建立不很久，因为叶蓝小体在细胞内还不大固定。灰孢藻的发现是对“内共生假说”的有力支持。 叶绿体（2）叶绿体和线粒体都有其独特的DNA，可以自行复制，不完全受核DNA的控制。线粒体和叶绿体的DNA同细胞核的DNA有很大差别，但同细菌和蓝藻的DNA却很相似。蓝藻的核糖体RNA（rRNA）不仅可以与蓝藻本身的DNA杂交，而且还可与眼虫叶绿体的DNA杂交，这些都说明它们之间的同源性。 蛋白质合成系统（3）线粒体和叶绿体都有自己特殊的蛋白质合成系统，不受核的合成系统的控制。原核生物的核糖体由30S和50S两个亚基组成，真核生物的核糖体由40S和60S两个亚基组成。线粒体和叶绿体的核糖体分别与细菌和蓝藻的一致，也是由30S和50S两个亚基组成，这说明细菌和线粒体、蓝藻和叶绿体是同源的。抗生素可以抑制细菌和蓝藻的生长，也可以抑制真核生物中的线粒体和叶绿体的作用，这也说明线粒体与细菌、叶绿体与蓝藻是同源的。 外膜（4）线粒体、叶绿体的内、外膜有显著差异，内、外膜之间充满了液体。研究发现，它们内、外膜的化学成分是不同的。外膜与宿主的膜比较一致，特别是和内质网膜很相似；内膜则分别同细菌和蓝藻的膜相似。总之，“内共生假说”得到了多方面的实验支持，因而被越来越多的人所接受。但它也有不足之处，主要是：第一，它没有说明细胞核是怎样起源的；第二，它认为螺旋体进入后能形成真核细胞的鞭毛，这种看法显然不对，因为螺旋体是一种原核生物，其鞭毛没有“9+2”结构，而真核生物如草履虫的纤毛或眼虫的鞭毛却是有“9+2”结构的。螺旋体进入变形虫状原核细胞后如何形成具有“9+2”结构的鞭毛，“内共生学说”并没有加以具体说明。7、微生物学家已经分离培养了大量的微生物，但他们知道还有大量未被培养的微生物，为什么？VBNC(viable but non-culture)指的是有些微生物可以在它们的栖息地被检测到存在，但不能在实验室进行人工培养。这不是绝对的，随着微生物技术的不断发展和人们对微生物认识的不断深入，那些过去不能被培养的现在或者不久的将来则可以被培养。这个现象反应了人们对科学认知的局限性和阶段性。 细菌处于不良环境条件下,其细胞通常缩成球形(最近许多研究中发现还有些细菌表现为体积增大,细胞伸长),用常规方法培养不能使其生长繁殖,但仍然具有代谢活性,在DNA合成抑制剂的作用下,添加一定量的营养物培养时,这些细胞虽然不能分裂,但仍可以伸长生长,证明其仍然存活,并非死亡.处于VBNC状态的细菌,在一定的条件下可以复苏,并具有潜在的致病性。 采用广泛的扩增16S rDNA并进行测序，可以发现某一环境中大量的微生物种类，其中可能有很多没有被分离得到。8、 比较“单体”和“多聚体”含义。举出生物学中三种重要的多聚体，并说明他们由哪些单体组成，哪种大分子在细胞中含量最丰富。单体：能形成聚合体的单一分子多聚体：分子量很高(通常为104106)的一类化合物，其分子链是由许多简单的、结构相同或不相同的结构单元通过共价键重复连接而成。如生物大分子中的核酸、蛋白质、多糖等。淀粉：葡萄糖；核酸：核苷酸；蛋白质：氨基酸。细胞中含量最丰富的大分子：蛋白质。9、 盐杆菌的蛋白中富含哪两种氨基酸，为何？ 天冬氨酸和谷氨酸；因为这两种氨基酸为酸性氨基酸。酸性氨基酸残基在蛋白表面形成负电荷，促进蛋白在高盐的环境中保持稳定。 嗜盐菌要在高盐环境下生存， Na+ 对维持细胞膜、细胞壁构造和功能有特别重要的作用。Na+ 与细胞膜成分发生特异作用而增强了膜的机械强度，有利于维持细胞膜的构造，对阻止嗜盐菌的溶菌起着重要作用。在细胞膜的功能方面，嗜盐菌中氨基酸和糖的能动运输系统内必需有Na+ 存在，而且Na+ 作为产能的呼吸反应中一个必需因子起着作用。实验证明，对于氨基酸的吸收是间接地通过光来驱动，一种氨基酸- Na+ 泵运输系统用于运载氨基酸。Na+ 被束缚在嗜盐菌细胞壁的外表面，起着维持细胞完整性的重要作用。嗜盐杆菌的细胞壁以糖蛋白替代传统的肽聚糖，这种糖蛋白含有高量酸性的氨基酸(如天门冬氨酸和谷氨酸)，形成负电荷区域，吸引带正电荷的Na+ ，维持细胞壁稳定性，防止细胞被裂解。“过量”的酸性氨基酸残基在蛋白表面形成负电屏蔽，促进蛋白在高盐环境中的稳定。10、 分辨率的定义；计算用数值孔径为1.3的100倍油镜在600nm光线下观察样品的最小分辨率？用同样的镜头如何提高分辨率。一、 分辨率：能清楚区分被检测物体细微结构最小间隔的能力，即相邻两个物点间最小距离的能力。二、 计算公式是=/NA;式中为最小分辨距离；为光线的波长；NA为物镜的数值孔径。所以分辨率与目镜没有关系，取决于物镜 可见光波长（4*10-7m-7*10-7m。提高光的波长，如采用长波长光，红光。11、 描述鞭毛的结构和功能，细菌如何感受引诱剂的方向并向它移动？一、 某些细菌菌体上具有细长而弯曲的丝状物，长度超过菌体若干倍。在某些菌体上附有细长并呈波状弯曲的丝状物，少则1-2根，多则达数百根。二、 细菌的运动器官，与运动、摄食有关。与细菌的致病性有关；可用细菌的鉴定和分类。三、 1、膜传感蛋白：负责感受化学效应物刺激的传感蛋白分布于细胞膜上；膜传感蛋白可直接作为化学效应物受体和胞外化学效应物结合蛋白反应儿作为间接受体。4种传感蛋白：Tsr蛋白；Tar蛋白；Trg蛋白；Tap蛋白。 2、胞质内调节蛋白：将膜传感蛋白所接受的化学刺激转变为有效的鞭毛运动信号，CheA;CheW;CheY和CheZ等调节蛋白负责将感受到得刺激从膜传感蛋白转移到鞭毛的发动器；并启动相应的鞭毛运动。 3、磷酸化与化学趋向性信号的传递；磷酸化的级联系统的普遍性（双组份调节系统）十二、在生命体中，能否用砷元素代替磷元素？科学家是如何设计实验证明的 1、可以部分代替。磷是人体遗传物质核酸的重要组分，也是人类能量转换的关键物质三磷酸腺苷(ATP)的重要成分，磷还是多种酶的组分，生物膜磷脂的组分，是构成骨骼、牙齿的重要成分，对人体生命活动有十分重要的作用。磷是机体极为重要的元素之一，因为它是所有细胞中的核糖核酸、脱氧核糖核酸的构成元素之一，对生物体的遗传代谢、生长发育、能量供应等方面都是不可缺少的。磷也是生物体所有细胞的必需元素，是维持细胞膜的完整性、发挥细胞机能所必需的。磷脂是细胞膜上的主要脂类组成成分，与膜的通透性有关。它促进脂肪和脂肪酸的分解，预防血中聚集太多的酸或碱，磷的功能也影响血浆及细胞中的酸碱平衡，促进物质吸收，刺激激素的分泌，有益于神经和精神活动。磷能刺激神经肌肉，使心脏和肌肉有规律地收缩。磷帮助细胞分裂、增殖及蛋白的合成，将遗传特征从上一代传至下一代。磷离子对于碳水化合物、脂类和蛋白质的代谢是必需的，它作为辅助因子作用于广大的酶体系，也存在于高能磷酸化合物中。如有机磷酸盐、ATP、磷酸肌酸等具有储存和转移能量的作用。在骨的发育与成熟过程中，钙和磷的平衡有助于无机盐的利用。磷酸盐能调节维生素D的代谢，维持钙的内环境稳定。2、采用放射性标记的磷和砷。具体参考文献。15，何为Taq聚合酶，为何它在生物技术上有巨大的用途？Taq聚合酶是一种耐热的DNA聚合酶，由于发现于水生栖热菌（Thermus aquaticus）内，故命名为Taq聚合酶（Taq polymerase），也称为TaqDNA聚合酶，简称Taq酶或Taq。Taq聚合酶常见于PCR技术，用于大量扩增DNA片段。16、描述Fts蛋白在细胞分裂过程中的作用。Fts蛋白在细菌的细胞骨架上被发现，Fts聚集入Z圆环，在细胞分裂期间，Fts移动向分裂点，并且吸收生产新的其他蛋白质，构成细胞壁划分在细胞之间。在细胞分裂中，Fts的角色类似于真核细胞中肌动蛋白，但又不同于真核中的肌动蛋白-肌球蛋白。划分叶绿体、线粒体，进一步建立他们的初核质祖先。17、目前已知的自然氨基酸有多少种？第22种氨基酸发现过程。一、已知的自然氨基酸有22种。第21种为硒代半胱氨酸；第22种为吡咯赖氨酸。二、第22种氨基酸的发现来自于产甲烷菌如何将含甲基化合物转化为甲烷的基础生化研究。巴氏甲烷八叠球菌，能够将一甲铵、二甲铵和三甲铵转化成二氧化碳、甲烷等气体。发现基因一个叫框内琥珀密码子的成分行为异常。这个密码子本应发出停止蛋白质合成的信号，但没有。将蛋白质降解为多肽小片段，并进行测序。推算其晶体结构，发现插入新氨基酸所需的特异tRNA，插入过程必需的酶。18、什么事限制酶？其再细胞中可能的功能是什么？一个细胞中的限制酶为何不引起自身DNA的降解？一、限制性核酸内切酶：可以识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。I型既能催化宿主DNA甲基化，又能催化非甲基化的DNA水解；II型只催化非甲基化的DNA水解。III型同时具有修饰及认知切割的作用。二、在细胞中的功能：细菌容易被噬菌体感染，需要利用切割外来DNA的方法进行自我保护，一旦发现外来DNA便将其切割，因而有效地限制了噬菌体对细菌的感染。三、每种限制酶特异识别专一DNA序列，并在切割位点将其准确切割。细菌将自身的DNA甲基化修饰，防止了被自身核酸内切酶降解。这些甲基化基团被装到DNA大沟的腺嘌呤或胞嘧啶上，使限制酶不能与DNA序列结合，但又不影响这些DNA序列上遗传信息的正常识别与表达。噬菌体DNA没有这些保护性的甲基化基团，所以会被降解。每种细菌都有一种或几种用来切割特异DNA序列的限制酶，还有与限制酶配对的甲基转移酶，用来防止限制酶降解细菌基因中的相应序列。20、写出大肠杆菌DH5和BL21(DE3)的基因型，解释每个基因型的含义。大肠杆菌DH5菌株的基因型里面，lacU169(f80 lac ZM15)lacZ基因是大肠杆菌中lac操纵子的结构基因，表达-半乳糖苷酶，分解乳糖为半乳糖苷。-半乳糖苷酶是由四个相同的亚基组成的，每个亚基又包含两个片断，即片断和片断，只有这两种片断同时存在时，-半乳糖苷酶才表现出活性。lacZ基因的变异或缺失将直接导致-半乳糖苷酶活性缺失，细胞在只有乳糖作为碳源的培养基中不能生长，由此可以进行菌株的筛选和纯化。lacZM15是表达-半乳糖苷酶片断的一段基因，当M15缺失（M15）时，lacZ基因虽然能表达片断，但不能表达片断，-半乳糖苷酶没有活性。当带有lacZ（片断）基因的lac操纵子通过载体DNA（如pUC19 DNA）转化到lacZM15基因型的细胞 (如E.coli JM109）时，在有IPTG (异丙基-D-1-硫代半乳糖苷) 存在的情况下, -半乳糖苷酶表现出活性,它能分解X-gal (半乳糖类似物)，使其呈现蓝色。因此可以通过平板上的蓝白菌落进行克隆体的鉴定。80是指 lambdoid 噬菌体基因80delta 是缺失的意思 后面是缺失的基因lacu169是指lacZYA到argF之间的基因，大约100,000 bpBL21(DE3)的基因型F_ ompT hsdS B(rB_mB_)dcm gal (DE3)BL21(DE3)菌株基因型：F ompT gal dcm lon hsdSB(rB- mB-) (DE3 lacI lacUV5-T7 gene 1 ind1 sam7 nin5)。特点：该菌株用于以T7 RNA聚合酶为表达系统的高效外源基因的蛋白表达宿主。T7噬菌体RNA聚合酶基因的表达受控于噬菌体DE3区的lacUV5启动子，该区整合于BL21的染色体上。该菌适合于非毒性蛋白的表达。用途：蛋白质表达21、为什么大多数生物合成操纵子仅需要负调控就能很有效地调控，而大多数的分解代谢操纵子则需要正调控和负调控来调控？22、大肠杆菌乳糖操纵子和麦芽糖操纵子的调控机制，图示加说明。一、大肠杆菌乳糖操纵子包括4类基因：结构基因，能通过转录、翻译使细胞产生一定的酶系统和结构蛋白，这是与生物性状的发育和表型直接相关的基因。乳糖操纵子包含3个结构基因：lacZ、lacY、lacA。LacZ合成半乳糖苷酶，lacY合成透过酶，lacA合成乙酰基转移酶。操纵基因O，控制结构基因的转录速度，位于结构基因的附近，本身不能转录成mRNA。启动基因P，位于操纵基因的附近，它的作用是发出信号，mRNA合成开始，该基因也不能转录成mRNA。调节基因i：可调节操纵基因的活动，调节基因能转录出mRNA，并合成一种蛋白，称阻遏蛋白。操纵基因、启动基因和结构基因共同组成一个单位操纵子（operon）。 调节乳糖催化酶产生的操纵子就称为乳糖操纵子。其调控机制简述如下：抑制作用：调节基因转录出mRNA，合成阻遏蛋白，因缺少乳糖，阻遏蛋白因其构象能够识别操纵基因并结合到操纵基因上，因此RNA聚合酶就不能与启动基因结合，结构基因也被抑制，结果结构基因不能转录出mRNA，不能翻译酶蛋白。诱导作用：乳糖的存在情况下，乳糖代谢产生别乳糖（alloLactose），别乳糖能和调节基因产生的阻遏蛋白结合，使阻遏蛋白改变构象，不能在和操纵基因结合，失去阻遏作用，结果RNA聚合酶便与启动基因结合，并使结构基因活化，转录出mRNA，翻译出酶蛋白。负反馈：细胞质中有了半乳糖苷酶后，便催化分解乳糖为半乳糖和葡萄糖。乳糖被分解后，又造成了阻遏蛋白与操纵基因结合，使结构基因关闭。三、 大肠杆菌的lac i基因与乳糖操纵子(lactose operon)的作用是典型的负控诱导系统。在这个系统中，i基因是调节基因，当它的产物-阻遏蛋白与操纵区(lacO)结合时，RNA聚合酶便不能转录结构基因，因此，在环境中缺乏诱导物(乳糖或IPTG)时，乳糖操纵子是受阻的。而当环境中存在有乳糖时，进入细胞的乳糖在细胞内尚存在的极少量的-半乳糖苷酶的作用下而发生分子重排，由乳糖(galactose-1,4-glucose)变成异乳糖(alloactoes, galactose-1,6-glucose)，异乳糖作为诱导物与阻遏蛋白紧密结合，使后者的构型发生改变而不能识别 lacO，也不能与之结合，因而RNA聚合酶能顺利转录结构基因，形成大分子的多顺反子 mRNA(polycistronic mRNA)，继而在翻译水平上合成三种不同的蛋白质：-半乳糖苷酶、透性酶以及乙酰基转移酶。四、 在正控诱导系统中，调节蛋白为激活蛋白，促进RNA聚合酶的结合，从而增加mRNA的合成。大肠杆菌麦芽糖操纵子(maltose operon)的调控是典型的例子，这里麦芽糖是诱导物，激活蛋白只有与麦芽糖结合时才能与DNA的特殊结合位点结合，促使RNA聚合酶开始转录(图9-7)，该结合位点称为激活蛋白结合位点，与启动区毗邻或在相隔几百个碱基对处。五、23、如果调节蛋白的结合区被删除，那么负调控控制下的启动子调节会怎样？正调控下的启动子调节又会怎样？24、列举病毒、朊病毒、类病毒之间的异同。一、病毒包括真病毒和亚病毒，真病毒就是我们通常意义上所讲的病毒，以DNA或者RNA为遗传物质，外面有衣壳粒包裹。亚病毒则包括类病毒，拟病毒和朊病毒，类病毒只有独立侵染性的RNA所组成，拟病毒一般仅有裸露的RAN,或者DNA所组成，是在真病毒中寄生的一种有缺陷的病毒。而朊病毒又称普利昂，或者蛋白质侵染子，是一种不含核酸的传染性的蛋白质分子，因能引起宿主体内的现成的桶内蛋白质分子发生与之相似的构象变化而致病。二、病毒 是一类个体微小，无完整细胞结构，含单一核酸（DNA或RNA）型，必须在活细内寄生并复制的非细胞型微生物。含有单一种核酸（DNA或RNA）的基因组和蛋白质外壳，没有细胞结构；在感染细胞的同时或稍后释放其核酸，然后以核酸复制的方式增殖，而不是以二分裂方式增殖；严格的细胞内寄生性。病毒缺乏独立的代谢能力，只能在活的宿主细胞中，利用细胞的生物合成机器来复制其核酸并合成由其核酸所编码的蛋白，最后装配成完整的、有感染性的病毒单位，即病毒粒。病毒粒是病毒从细胞到细胞或从宿主到宿主传播的主要形式。三、类病毒类病毒(viroid) 是目前已知最小的可传染的致病因子，比普通病毒简单。类病毒是无蛋白质外壳保护的游离的共价闭合环状单链RNA分子，侵入宿主细胞后自我复制，并使宿主致病或死亡。类病毒的分子量在0.51.2105，是已知的最小RNA卫星环死病毒大小的1/4。1971年首次报道的马铃薯纺锤形块茎病类病毒(PSTV)只有359个核苷酸，最小的草矮生类病毒(HSV)仅含290300个核苷酸，较大的柑桔裂皮病类病毒(CEV)亦只含371个核苷酸。目前关于类病毒的感染和复制机理尚不清楚。 四、朊病毒 病毒是一类个体极微小的生物，它没有细胞结构，其构成也很简单，一般只有蛋白质组成的外壳和由核酸组成的核心。核酸（DNA或RNA）在病毒的遗传上起着重要作用，而蛋白质外壳只对核酸起保护作用，本身并没有遗传性。这是人们对病毒的基本认识。然而，随着人们对一些疾病的深入研究，科学家们发现，还有一类生物与一般病毒不一样，它只有蛋白质而无核酸，但却既有感染性，又有遗传性，并且具有和一切已知传统病原体不同的异常特性。它就是朊病毒。25、埃姆斯实验的具体方案。沙门氏菌回复突变试验（亦称Ames试验）鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）的组氨酸营养缺陷型（his）菌株，在含微量组氨酸的培养基中，除极少数自发回复突变的细胞外，一般只能分裂几次，形成在显微镜下才能见到的微菌落。受诱变剂作用后，大量细胞发生回复突变，自行合成组氨酸，发育成肉眼可见的菌落。某些化学物质需经代谢活化才有致变作用，在测试系统中加入哺乳动物微粒体酶，可弥补体外试验缺乏代谢活化系统之不足。鉴于化学物质的致突变作用与致癌作用之间密切相关，故此法现广泛应用于致癌物的筛选。二、Ames试验的常规方法有斑点试验和平板掺入试验。 1菌株鉴定 用于测试的菌株，需经基因型和生物学性状鉴定，符合要求才能投入使用。 目前推荐使用的一套菌株是TA97、TA98、TA100和TA102。鉴定前先进行增菌培养。为鉴定结果可靠，需同时培养野生型TV菌株，作为测试菌基因型之对照。增菌培养用牛肉膏蛋白胨液体培养基，接种后于37，100rmin振荡培养12h左右，细菌生长相为对数期末，含菌数应为1109个ml2109个ml。 鉴定项目： （1）脂多糖屏障丢失（rfa）用接种环或一端挠起的接种针以无菌操作术取各菌株的增菌培养液，在营养琼脂平板上分别划平行线，然后用灭菌尖头镊夹取灭菌滤纸条，浸湿结晶紫溶液，贴放在平板上与各接种平行线垂直相交。盖好皿盖后倒置于37t温箱，培养24h后观察结果。 （2）R因子 划线接种，贴放滤纸条及培养等均同上，唯滤纸条浸湿的药液不同，为氨苄青霉素钠溶液。TA102除pKM101外，还有pAQ1，载有抗四环素的基因，故另用滤纸条浸湿四环素溶液后贴放于划线接种的平板上。 （3）紫外线损伤修复缺陷（uvrB）在营养琼脂平板上按上述方法划线接种后，一半接种线用黑玻璃遮盖，另一半暴露于紫外光下8sec，然后盖好皿盖并用黑纸包裹平皿，防止可见光修复作用。培养同上。 （4）自发回变 预先制备底平板；向灭菌并在水浴内保温45的上层软琼脂中注入0.1ml菌液；混匀后倾于底平板上并铺平。平皿倒置于37温箱培养48h。 （5）回变特性诊断性试验 上层软琼脂中除菌液外，还注入已知阳性物之溶液，需活化系统者并加入S9mix，余同上。 组氨酸营养缺陷型由自发回变即可知。 2斑点试验 吸取测试菌增菌培养后的菌液0.1ml，注入融化并保温45左右的上层软琼脂中，需S9活化的再加0.3ml0.4mlS9mix，立即混匀，倾于底平板上，铺平冷凝。用灭菌尖头镊夹灭菌圆滤纸片边缘，纸片浸湿受试物溶液，或直接取固态受试物，贴放于上层培养基的表面。同时做溶剂对照和阳性对照，分别贴放于平板上相应位置。平皿倒置于37温箱培养48h。在纸片外围长出密集菌落圈，为阳性；菌落散布，密度与自发回变相似，为阴性。 3平板掺入试验 将一定量样液和0.1ml测试菌液均加入上层软琼脂中，需代谢活化的再加0.3ml0.4ml S9mix，混匀后迅速倾于底平板上铺平冷凝。同时做阴性和阳性对照，每种处理做3个平行。试样通常设4个5个剂量。选择剂量范围开始应大些，有阳性或可疑阳性结果时，再在较窄的剂量范围内确定剂量反应关系。培养同上。同一剂量各皿回变菌落均数与各阴性对照皿自发回变菌落均数之比，为致变比（MR）。MR值2，且有剂量-反应关系，背景正常，则判为致突变阳性。26、IS的基本特征，图示和说明。一、IS：insertion sequence插入序列，能在基因或基因组内部或之间改变自身位置的一段DNA序列，通常是转座子的一种，一般长度为0.71.4Kb，只能引起转座效应而不含有其他任何基因。二、插入序列(insertion sequence，IS)是最简单的转座元件，因为最初是从细菌的乳糖操纵子中发现了一段自发的插入序列，阻止了被插入的基因的转录，所以称为插入序列(IS)。插入序列是编码转座所需的酶的一种转座子，它的两侧是短反向末端重复序列。转座子插入的靶序列在插入过程中被复制，在转座子两端先形成两个短正向重复序列。正向重复序列（DR，direct repeat）的长度为5-9bp，是任一转座子的特征。三、：能编码转座酶，自主进行转座。转座酶的编码起始点位于一端的反向重复序列内。终止点则正好位于另一端的反向重复序列之前或中间。插入位点一般是随机的，很少是位点专一的。插入后使宿主染色体的插入位置上产生短的正向重复序列。转座是罕见事件，与自发突变率处于同一数量级，约为每代10-6一10-7。插入片段精确切离后，可使IS诱发的突变回复为野生型，但这种概率很低，每代只有10-6一10-10。不精确切离可使插入位置附近的宿主基因发生缺失。27、图示说明cosmid文库的原理和构建过程。cosmid 是英文 cos site-carrying plasmid 的缩写, 也称粘粒、柯斯载体。本意是带有粘性末端位点的质粒, 因此, 柯斯质粒是人工建造的的含有DNA的cos序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体。这是一类用于克隆大片段DNA的载体，它是由噬菌体的cos（cohesive）末端及质粒（plasmid）重组而成的载体。cosmid载体带有质粒的复制起点、克隆位点、选择性标记以及噬菌体用于包装的cos末端等，因此该载体在体外重组后，可利用噬菌体体外包装的特性进行体外包装，利用噬菌体感染的方式将重组DNA导入受体细胞。但它不会产生子代噬菌体，而是以质粒DNA的形式存在于细胞内。 柯斯质粒的构建一般都是利用质粒的复制子、选择标记, 加上的cos位点序列及与包装有关的序列，构建的科斯质粒可以很好地用于基因克隆。 早期构建的科斯质粒载体有一些不足，如克隆位点较少，抗性标记单一，容栽能力不大，后来进行了一些改进，克服了这些不足。1.Isolate chromosomal DNA by using the CT