细胞生物学实验ppt课件.ppt

实验内容 实验一 细胞的形态结构与显微测量实验二 细胞生理活动的实验观察实验三 细胞核与线粒体的分级分离实验四 细胞分裂的形态观察实验五 细胞原代培养实验六 细胞计数及死活细胞的鉴定实验七 综合设计性实验 1 实验一细胞的形态结构与显微测量 2 一 观察并了解细胞的基本形态 二 掌握临时制片和显微绘图的方法 三 了解显微测微尺的原理及使用方法 实验目的 3 一 材料 人口腔上皮细胞 自取 蛙血细胞涂片人血涂片单层柱状上皮细胞永久制片骨骼肌纵切片 实验用品 4 二 器材 载玻片盖玻片牙签擦镜纸吸水纸纱布永久制片镜台测微尺 5 实验内容 6 usingofthemicroscope I Useoflowobjectivelens II Useofhighobjectivelens 7 Structureofthemicroscope MechanicalpartOpticspartLightingpart 8 9 一 临时制片 口腔上皮细胞标本的制备 取载玻片一张 揩净 加一滴生理盐水 取材 口腔内颊部上皮细胞 涂于生理盐水中 盖盖玻片 染色 甲基蓝 1 观察 10 二 显微测量 1 显微测量计 11 1 目镜测微尺 1 外形是一圆形玻片 装入目镜镜筒中 用于测量标本用 2 刻度标记0 100 实际分为200等份 每一个格的长度需用镜台测微尺标定 12 2 镜台测微尺 1 外形是一载玻片 上有一带精细刻度的标尺 2 总长度为1mm 分为100等份 每一个格的长度为0 01mm 10 m 13 3 标定方法 将镜台测微尺置镜台上 低倍下找到镜台测微尺 使之与目镜测微尺平行且左端对齐 0刻度重合 14 由左向右找到目镜测微尺与镜台测微尺重合的位点 分别记录两尺重合处的刻度 计算目镜测微尺每小格的长度 如镜台测微尺1mm处 全长 与目镜测微尺75刻度 150小格 重合 则 目镜测微尺每小格的实际长度 mm 0 0067mm 6 7 m 15 同样的方法标定高倍镜下目镜测微尺每小格的实际长度计算公式如下 目镜测微尺每小格的实际长度 16 4 测量细胞并计算核质比 口腔上皮细胞标本片 低倍镜下选无重叠 伸展良好 结构完整的细胞 换高倍镜测量 口腔上皮细胞为扁平形 近似椭圆形 测细胞的长半径 直径 短半径 直径 计算细胞体积 以同样方法测核并计算核体积 或将核近似看作球形 按公式计算核质比 17 椭圆V 4 ab2 3 a长半径 b短半径 圆V 4 3R3 R半径 V Vn Vc Vn Vn细胞核体积Vc细胞体积 18 三 永久制片的观察 19 Observationofcellmorphologicalstructure humanbloodsmeartoadbloodsmearmousesmallintestinepillarepidermalcellskeletonmuscleslide 20 10 x10 21 22 23 24 erythrocytes leucocyte Bloodplatelet 25 Pillarcell 10 x40 columnar dense elliptical shapednuclear Chalice shaped 26 27 Skeletonmusclecell fibrous havemanymyofibril nuclei 28 四 作业 1 绘制口腔上皮细胞 点线绘图法 2 低倍镜 高倍镜下测微尺的标定方法及结果3 计算核质比 29 镜台测微尺 30 目镜测微尺 200小格 31 实验二 细胞生理活动的实验观察 32 通过制片与观察加深理解细胞吞噬等生理活动掌握死活细胞鉴别的原理及方法 实验目的 33 1 材料 小白鼠2 器材和仪器 光学显微镜 2ml注射器 载玻片 盖玻片 解剖器材 滴管 牙签 吸水纸3 试剂 1 鸡血悬液 6 淀粉肉汤 0 3 台盼兰 酵母悬液 生理盐水 0 2 亚甲基兰染液 实验用品 34 一 细胞的吞噬活动 二 细胞活性的鉴定 酵母菌 实验内容 35 白细胞是机体防御系统中能游走的单位 它分为粒细胞系 单核细胞系 淋巴系三类 游走性 变形运动 趋化性 吞噬异物 在白细胞中 以粒细胞 单核细胞的吞噬活动较强 故称此二类细胞为吞噬细胞 单核细胞由血液进入组织后逐渐演变成巨噬细胞 吞噬细胞主要靠吞噬来处理异物 吞噬细胞首先由于趋化作用而向异物游走 然后伸出伪足包围异物 并发生内吞作用形成吞噬泡将异物吞入细胞 继而溶酶体与吞噬泡融合消化异物 1 原理 36 37 2 方法a 实验前二天 每天向小鼠腹腔注射6 淀粉肉汤0 5 1ml 含O 3 台盼兰 起标记作用 以刺激腹腔产生较多的巨噬细胞 b 实验时 每组取一只经上述处理的小鼠 腹腔注射1 鸡血悬液0 5 1ml 注射后轻揉小鼠腹部以使红细胞悬液分散均匀 c 1小时后 用颈椎脱位法处死小鼠 迅速剖开小鼠腹壁 向腹腔注入0 5ml 1ml生理盐水 用牙签轻轻搅拌使生理盐水与腹腔液混匀 d 用注射器抽取腹腔液 滴片 然后盖上盖片 e 镜检 高倍镜下画图记录所见结果 38 在高倍镜下 数量较多 体积较大 圆型或不规则的细胞 其表面有许多似刺状的小突起 伪足 胞质中有许多数量不等的蓝色颗粒 为吞入的含台盼蓝淀粉肉汤形成的吞噬泡 即为吞噬细胞 3 结果 39 二 细胞活性的鉴定 酵母菌1 原理许多酸性染料不易穿过活细胞的质膜进入细胞内 却能渗入死亡的细胞内 使其着色 以此来鉴别死活细胞 40 2 方法取酵母悬液一滴于洁净玻片上 滴一滴0 2 亚甲基蓝染液 加盖片 2分钟后于显微镜下观察细胞 3 结果死细胞被染成蓝色 活细胞不着色 41 实验作业 画图记录细胞吞噬实验所见结果 42 实验三细胞核与线粒体的分级分离 43 一 材料和标本小白鼠二 器材和仪器玻璃匀浆器 普通离心机 台式高速离心机 普通天平 光学显微镜 载玻片 盖玻片 刻度离心管 高速离心管 滴管 10ml量筒 25ml烧杯 玻璃漏斗 解剖剪 镊子 吸水纸 纱布 螬盘 平皿 三 试剂0 25mol L蔗糖 0 003mol L氯化钙溶液 1 甲苯胺兰染液 0 02 詹纳斯绿B染液 0 9 NaCl溶液 实验用品 44 1 了解分步离心分离细胞成分的方法原理 2 学习 熟悉高速离心机的使用方法 实验目的 45 离心分离的原理 一 实验原理先用研磨 超声振荡 低渗等方法将组织或细胞破碎 匀浆化 释放出细胞中的各种亚组分 再利用不同的离心条件将它们分离出来 以供进一步分析研究之用 46 1 差速离心法 从低速到高速逐级沉淀分离 使较大的颗粒先在较低转速中沉淀 再用较高转速将原先悬浮在上清液中的较小颗粒分离沉淀下来 从而使各种亚细胞组分得以分离 但由于样品中各种大小和密度不同的颗粒在离心时是均匀分布于整个离心介质中的 各每级分离得到的第一次沉淀必然不是纯的最重颗粒 须经反复悬浮和离心加以纯化 差速离心法主要用于分离细胞器和病毒 其优点是 操作简单 离心后用倾倒法即可将上清夜与沉淀分开 并可使用容量较大的角式转子 缺点是 分离效果差 不能一次得到纯颗粒 壁效应严重 特别是当颗粒很大或浓度很高时 在离心管一侧会出现沉淀 颗粒被挤压 离心力过大 离心时间过长会使颗粒变形 聚集而失活 47 48 五 实验操作 1 取猪肝1g 放入小烧杯中 加4ml0 25M蔗糖缓冲液 将组织剪成约1mm立方的小块 2 将剪碎的组织移入匀浆器的外管中 再将内管 带柄的活塞 插入外管中 缓慢而均匀地施力 上下旋转拉动 匀浆7 10分钟 然后用六层纱布过滤回洗净的原烧杯中 这两步操作略 3 每组取1个5ml离心管 加入匀浆液2ml 2000rpm离心10分钟 每组1管 接下去的操作见下面的流程图 健那绿染色 各取10 lD4悬浮液和健那绿染液在载玻片上混合 10分钟后加盖玻片 观察线粒体 改良苯酚品红染色 取10 lD6涂片 滴10 l改良苯酚品红染液 5分钟后加盖玻片 观察细胞核 49 2 细胞核的分离提取 处死小白鼠 取出肝脏 剪成小块 在盛有0 9 NaCl的烧杯中洗涤 将湿重约1g的肝组织放在平皿中 量筒量取8ml0 25mol L蔗糖 0 003mol L氯化钙溶液 先加少量该溶液于平皿中 剪碎肝组织后 再全部加入 剪碎的肝组织倒入匀浆管中研磨3 5次 用3层纱布过滤匀浆液于离心管中 将装有滤液的离心管放入离心机2500rpm离心15分钟 缓缓取上清液 移入高速离心管中 保存于有冰块的烧杯中 余下的沉淀物进行下一步骤 用6ml0 25mol L蔗糖 0 003mol L氯化钙溶液悬浮沉淀物 2500rpm离心15分钟 弃上清 将残留液体用吸管吹打成悬液 滴一滴于载玻片上 自然干燥 l 甲苯胺兰染色后盖片即可观察 50 3 高速离心分离提取线粒体 操作步骤装有上清液的高速离心管 17000rpm离心20分钟 弃上清 留取沉淀物 加入0 25mol L蔗糖 0 003mol L氯化钙液1ml 用吸管吹打成悬液 17000rpm离心20分钟 将上清吸入另一试管中 留取沉淀物 加入0 1ml0 25mol L蔗糖一0 003mol L氯化钙溶液混匀成悬液 取上清液和沉淀物悬液 分别滴于载玻片上 各滴一滴0 02 詹纳斯绿B染液盖上盖片染20分钟 油镜下观察 颗粒状的线粒体被詹纳斯绿B染成蓝绿色 51 作业 1 简要说明分级分离细胞的原理及意义2 描述显微镜下所见结果 52 实验六 细胞分裂的形态观察 53 通过标本制备和观察了解生物体细胞的无丝分裂 有丝分裂形态特征及生殖细胞的减数分裂过程 实验目的 54 一 材料和标本 鸡血涂片 马蛔虫子宫切片 固定的蝗虫精巢 二 器材和仪器 显微镜 擦镜纸 解剖针 眼科镊子 载玻片 盖玻片 吸水纸 培养皿 冰箱 三 试剂 Carnoy固定液 70 乙醇 醋酸洋红染液 45 醋酸 二甲苯 实验用品 55 一 动物细胞无丝分裂的观察 鸡血涂片 一 原理雷马克 Remak 于1841年最早在鸡胚血细胞中发现血细胞分裂过程中没有出现纺锤丝和染色体的变化 故称无丝分裂 Amitosis 实验内容 56 二 结果与观察 处于分裂过程不同阶段的鸡血红细胞 核仁先行分裂 向核的两端移动 细胞核伸长呈杆状 进而 在核的中部从一面或两面向内凹陷 使核成肾形或哑铃形改变 最后 从细胞中部直接收缩成两个相似的子细胞 57 二 细胞有丝分裂的观察 马蛔虫子宫切片 一 原理细胞有丝分裂 Mitosis 的现象是分别由施特拉斯布格 Strasburger 1880 在植物细胞和弗勒明 Flemming 1882 在动物细胞中发现 有丝分裂过程包括一系列复杂的核变化 染色体和纺锤体的出现 以及它们平均分配到每个子细胞的过程 马蛔虫受精卵细胞 6条染色体 58 二 观察 59 60 三 蝗虫精巢减数分裂压片标本的制备与观察 一 原理减数分裂 Meiosis 是配子发生过程中的一种特殊有丝分裂 即染色体复制一次 而细胞连续分裂两次 结果使染色体数目减半的过程 减数分裂过程中体现了遗传三大定律 所以说减数分裂在稳定种的遗传性状和繁殖中均起着重要作用 是生物遗传与变异的细胞学基础 蝗虫精巢取材方便 标本制备方法简单 染色体数目较少 蝗虫初级精母细胞染色体数2n 22 X 经过减数分裂形成四个精细胞 每个精细胞的染色体数为n ll X或n 11 61 二 蝗虫精巢压片标本的制备 l 采集2 取材用大头针把雄虫固定在木板或纸盒上 沿腹部背中线剪开体壁 见消化管背侧的浅黄色结构即是精巢 用镊子分离出来 3 固定把取出的精巢立即放入Carnoy固定液中 固定1小时 移入70 乙醇中存放于4 冰箱备用 4 染色取固定好的精细管2 3条 置于干净载玻片中央 用45 醋酸处理5分钟 用吸水纸吸干后 加1 2滴醋酸洋红染色15分钟 5 压片在染色材料上盖上盖玻片 再在盖玻片上放一块吸水纸 用大拇指垂直在盖玻片上适力下压 压片时不要滑动盖片 使精细管破裂细胞平展开 吸去溢出的染液 即可观察 62 图蝗虫精巢 63 偶线期 细线期 间期 64 双线期 粗线期 65 终变期 66 中期 67 后期 68 末期 前期 69 中期 后期 70 末期 71 作业 1 绘制马蛔虫受精卵有丝分裂的各期细胞图像 并注明结构名称2 小结有丝分裂与减数分裂过程的异同点 72 实验五 细胞原代培养 73 实验目的 掌握哺乳动物细胞的原代培养的基本操作过程了解原代培养细胞的观察方法 74 材料 乳鼠试剂 含10 小牛血清的DMEM培养液 PBS 0 25 胰蛋白酶 0 02 EDTA混合消化液 75 乙醇器材 无菌室 超净工作台 普通显微镜 倒置相差显微镜 CO2培养箱或恒温培养箱 冰箱 离心机 液氮罐 高压消毒锅 水纯化装置 水浴锅 分析天平 普通天平 电炉 酸缸 镊子 解剖剪 试管架 橡皮球 橡皮塞 工作服 帽子 口罩 包装消毒用品的牛皮纸 容量瓶 移液管 试管 离心管 吸管 培养皿 培养瓶 注射器 小烧杯 滤器 青霉素小瓶 实验用品 75 用直接从机体获取的细胞进行的培养称为原代培养 在无菌操作的条件下 把组织从动物体内取出 经胰酶消化处理成单个细胞 在人工条件下培养 使其不断的生长繁殖 原代培养细胞离体时间短 性状与体内相似 适用于研究 实验原理 76 1 取材 用颈椎脱位法使乳鼠迅速的死亡 然后把整个动物侵入盛有75 的乙醇的烧杯中数秒钟消毒 取出后放在大平皿中携入超净台 用消过毒的剪刀剪开用碘酒和乙醇两次消毒后的皮肤 刨腹取出肝脏或肾脏 置于无菌的平皿中 实验步骤 77 2 切割 用灭菌的PBS将取出的脏器清洗3次 然后用眼科手术剪刀仔细将组织反复剪碎 直到成1mm3左右的小块 再用PBS清洗 洗到组织块发白为止 移入无菌离心管中 静置数分钟 使组织块自然沉淀到管底 弃去上清 78 3 消化 接种培养 吸取0 25 胰蛋白酶 0 02 EDTA混合消化液1ml 加入离心管中 与组织块混匀后 加上管口塞子 37 水浴中消化8 10分钟 每隔几分钟摇动一下离心管 使组织与消化液充分接触 静止 吸取上清 向离心管中加入5 10ml含有10 小牛血清的DMEM培养液 用吸管吹打混匀 移入两个培养瓶中 置于二氧化碳培养箱中培养 79 1 用75 洗手乙醇消毒 进入培养室要穿鞋套 戴口罩 戴帽子 2 操作前20 30分钟启动超净台吹风 3 操作时 严禁说话 严禁用手直接拿无