重组人锰超氧化物歧化酶的抗肿瘤作用研究.doc

重组人锰超氧化物歧化酶的抗肿瘤作用研究陈车生1，庞怀宇2，李素霞2，袁勤生2*1上海富海科申药业有限公司，2华东理工大学生物工程学院，上海200237摘要：论文主要研究了rhMnSOD的体内抗肿瘤作用、对荷瘤小鼠的体内单独使用的抗肿瘤作用、与化疗药物合用的抗肿瘤作用以及抗肿瘤作用机制探讨。关键词：重组人锰超氧化物歧化酶，抗肿瘤，化疗药物，荷瘤小鼠前言 MnSOD是哺乳动物体内的一线抗氧化酶，其在体内的生理代谢过程中不仅是一个氧化还原调节剂，其还是一个肿瘤抑制子。已经在黑色素瘤、乳腺癌等多个肿瘤模型中发现，通过cDNA转染使得肿瘤细胞中MnSOD过表达，肿瘤细胞的恶性表型发生逆转，肿瘤细胞分化增加。而rhMnSOD的作用机制可能与其他抗肿瘤药物作用有所不同，因为到目前为止，没有研究证据证明MnSOD具有有细胞毒作用，因此其抗肿瘤作用应该是间接的。我们对此进行了研究。最近有报道给予小鼠服用rh MnSOD后产生积极的抗氧化作用，并且增加小鼠的体液免疫能力。因此，很可能给予rh MnSOD治疗能够保护小鼠的免疫系统免受自由基的氧化损伤，同时能够促进T淋巴细胞募集进入肿瘤组织杀死肿瘤细胞，从而增强抗肿瘤免疫应答。对于rhMnSOD的抗肿瘤作用还需要在更多种类的肿瘤中进行验证，也需要检测其与更多的化疗药物的协同作用，并对其作用机制进行更为深入的研究。根据目前已经发表的结果我们可以预期rhMnSOD和ADR合用能够降低ADR的心脏毒性等副反应，因此，作为抗肿瘤的辅助治疗药物，rhMnSOD具有很大的开发潜力。1 材料RPMI-1640培养基，美国GIBCO公司；小牛血清，杭州四季青物工程公司；MTT，美国Sigma公司；PI/RNase Staining Buffer ，美国Becton Dickinson公司；AnnexinV-EGFP双染试剂盒，南京凯基生物科技发展有限公司；注射用盐酸阿霉素，10 mg/瓶，批号：060705浙江海正药业股份有限公司；注射用环磷酰胺，200 mg/瓶，批号：06060121江苏恒瑞医药股份有限公司；羊抗人CD4多克隆抗体、兔抗人CD8多克隆抗体，羊抗人肌动蛋白多克隆抗体，美国Santa Cruz 公司；IRDyeTM800结合二抗，美国Rockland Inc；SP试剂盒、DAB显色剂 ， 北京中杉金桥公司。动物：ICR清洁级小鼠，18-22g，雌雄各半，由中国药科大学动物室提供；2 实验方法2.1 rhMn-SOD单用及与环磷酰胺（CTX）、阿霉素（ADR）合用对小鼠移植瘤EAC的抑制作用按全国抗癌药物筛选规程及新药临床前研究指导原则，选取健康且肿瘤生长旺盛（无坏死）EAC荷瘤小鼠拉断颈椎处死，经消毒后置于超净台中，在无菌条件下取出肿瘤组织，剪碎，加入生理盐水在研磨器中研磨制成细胞悬液，计数肿瘤细胞，将瘤细胞悬液调节成1108/ml备用。取ICR小鼠90只，按移植性肿瘤研究法，接种EAC实体型瘤，每只小鼠右前肢腋窝皮下接种0.2 ml。接种后24 h称鼠重，并随机分为9组，每组10只，雌雄各半。实验设：对照组(0.2 ml生理盐水)，rhMnSOD 2个剂量组（7500、15000 U/kg rhMnSOD），ADR组（2 mg/kg ADR），ADR联合用药2个剂量组（上述rhMnSOD剂量分别与ADR 2 mg/kg联用），CTX组（10 mg/kg CTX），CTX联合用药2个剂量组（上述rhMnSOD剂量分别与CTX 10 mg/kg联用）。ADR和CTX用0.2 ml生理盐水溶解，经小鼠尾静脉给药，rhMnSOD用生理盐水稀释后腹腔注射，在联合用药组中，ADR和CTX给药后6 h腹腔注射rhMnSOD。于接种后24 h给药，每天1次，连续6次。停药后第2天处死并称重荷瘤小鼠，分离瘤块称瘤重，计算抑瘤率。2.2 rhMnSOD单用及与CTX合用对小鼠移植瘤S180的抑制作用实验方法同上，实验设：对照组(0.2 ml生理盐水)，rhMnSOD为5个剂量组（1000、3000、9000、15000、30000 U/kg rhMnSOD），CTX组（10 mg/kg CTX），CTX联合用药5个剂量组（上述rhMnSOD剂量分别与CTX 10 mg/kg联用）。CTX用0.2 ml生理盐水溶解，经小鼠尾静脉给药，rhMnSOD用生理盐水稀释后腹腔注射，在联合用药组中，CTX给药后6 h腹腔注射rhMnSOD。于接种后24 h给药，每天1次，连续6次。停药后第2天处死并称重荷瘤小鼠，分离瘤块称瘤重，计算抑瘤率。2.3 rhMnSOD与ADR合用的抗肿瘤作用2.3.1 rhMnSOD与ADR合用对小鼠移植瘤S180的抑制作用取ICR小鼠100只，按移植性肿瘤研究法，接种S180实体瘤，接种24 h后称鼠重，并随机分为10组，每组10只，雌雄各半，实验设：对照组(0.2 ml生理盐水)，ADR组（2 mg/kg ADR），rhMnSOD为4个剂量组（7500、15000、30000、60000 U/kg rhMnSOD），ADR联合用药4个剂量组(上述rhMnSOD剂量分别与ADR 2 mg/kg联用)。ADR经小鼠尾静脉给药，rhMnSOD用生理盐水稀释后尾静脉注射，在联合用药组中，ADR给药后6 h给予rhMnSOD。于接种后24 h给药，每天1次，连续6次。停药后第2天由小鼠眼眶静脉取血，镜检外周血白细胞总数，然后处死并称重荷瘤小鼠，分离瘤块称瘤重，计算抑瘤率与增效率。抑瘤率和增效率按照下式计算：抑瘤率（1给药组平均瘤重/空白对照组平均瘤重）100%增效率（1联合给药组抑瘤率/阳性对照组抑瘤率）100%2.3.2组织病理学检查上述动物实验结束后，处死小鼠取出移植瘤，每组随机选取3个瘤块。瘤块经10%甲醛溶液固定12 h-24 h，常规取材，梯度乙醇和二甲苯脱水，石蜡包埋，制片（4 m厚），苏木精-伊红（hematoxylin and eosin，H&E）染色后作病理检查，根据病变轻重程度不同，依次标记为“-”、“+”、“+”、“+”、“+”表示，其中“-”为无明显改变，“+”为严重的病理改变。2.3.3 免疫组织化学染色检查每组随机选取6个石蜡包埋的组织切片于系列二甲苯中浸泡脱蜡后， 免疫组织化学染色检查。结果判断：观察CD4、CD8表达已出现棕黄色颗粒为阳性细胞。2.3.4 Western Blot分析小鼠处死取出移植瘤，每组随机选取三个瘤块，用眼科剪剪为1 mm3左右组织块。匀浆后离心收集上清液，测定蛋白含量，SDS-PAGE及蛋白电转移，电转后的硝酸纤维素膜免疫杂交检测靶蛋白。 3 实验结果及分析3.1 rhMn-SOD单用及与环磷酰胺（CTX）、阿霉素（ADR）合用对小鼠移植瘤EAC的抑制作用与对照相比，所有用药组对EAC肿瘤的生长具有显著的抑制作用。单用rhMnSOD对EAC肿瘤的生长具有显著的抑制作用，且抑制作用随rhMnSOD剂量的增加而增强。与CTX组相比，rhMnSOD两个剂量与CTX合用均没有增效作用。rhMnSOD与ADR合用有增效作用，与ADR组相比，15000U/kg rhMnSOD剂量的联合用药组的增效作用具有统计学意义（P0.05）。实验期间所有的动物存活且无明显行为异常。3.2 rhMnSOD单用及与CTX合用对小鼠移植瘤S180的抑制作用与对照相比，所有用药组对S180肿瘤的生长具有显著的抑制作用。单用rhMnSOD对S180肿瘤的生长具有显著的抑制作用，且抑制作用随rhMnSOD剂量的增加而增强。与CTX组相比，rhMnSOD 5个剂量与CTX合用均没有增效作用。3.3 rhMnSOD与ADR合用的抗肿瘤作用3.3.1 rhMnSOD与ADR合用对小鼠移植瘤S180的抑制作用与对照相比，rhMnSOD对S180肿瘤的生长具有显著的抑制作用，且抑制作用随rhMnSOD剂量的增加而增强。实验期间所有的小鼠均存活切无行为异常，给药组和对照组相比，体重和白细胞计数结果均无明显差异。与对照组相比，所有联合用药组对肿瘤生长都具有显著抑制作用（P0.01），且抑制作用随rhMnSOD剂量的增加而增强。与ADR组相比，除2 mg/kg rhMnSOD联合用药组对肿瘤生长抑制没有明显增效外，其余三个用药组均有增效作用，且8 mg/kg和16 mg/kg rhMnSOD剂量的两个联合用药组的增效作用具有统计学意义（P0.05）。Fig.1 Effect of rhMnSOD alone or in combination with ADR on the expression of CD4 and CD8 protein in tumors. Actin was used as a loading control. Representative immunoblots are shown as in (A). Results are expressed as means SD (n=3). (B, C)4、结论与讨论在这个实验中可以看到，单用rhMnSOD能够显著抑制EAC和S180肿瘤的生长，且抑制作用随rhMnSOD剂量的增加而增强，说明直接使用rhMnSOD可以达到MnSOD基因治疗的类似的抗肿瘤效果，不过两者的机制可能有所不同。与化疗药物的协同作用表明，rhMnSOD与CTX对EAC和S180肿瘤的抑制均无协同作用，而与ADR合用，对两种肿瘤的抑制均有协同作用，且对肿瘤的抑制作用随rhMnSOD剂量的增加而增强。这种差别可能与两种药物自身的作用机理不同有关，ADR的作用机制中涉及自由基的产生，而CTX的作用机制则不涉及自由基