酵母人工染色体.doc

2009-08-04 22:22人类人工染色体HAC人类人工染色体研究进展人类人工染色体研究进展摘要：本文主要介绍了人类人工染色体（HAC）的结构、构建及其在基因治疗、转基因动物等方面的应用，对HAC的最新研究进展作了简要介绍，同时总结了当前HAC研究面临的问题。关键词：HAC 基因治疗 转基因动物酵母人工染色体（YAC）1,2、细菌人工染色体(BAC)等人工染色体相继构建成功以后，1997年，科学家成功构建了第一条人类人工染色体（Human Artificial Chromosome，HAC）3。与YAC、BAC等相比，HAC不整合到细胞的基因组中,而是以一个独立的功能性染色体单位而存在，可以同细胞中正常的染色体一样复制、分裂、稳定遗传，并且不会对受体产生毒害，这使得HAC有可能解决基因治疗中的一些难题3,4。HAC具有容量大、不容易导致基因沉默、可随细胞周期表达或关闭等优点，开创了人工染色体研究的新纪元，其研究受到广泛关注。1. HAC的基本结构HAC包含构成人工染色体的所有基本结构，即端粒（TEL）、复制起点（Origin）及着丝粒（CEN）。1.1 端粒端粒是人工染色体中了解得比较清楚的一个基本功能单位。端粒是DNA-蛋白质复合物，能阻止染色体末端相互连接，并防止染色体复制时DNA丢失5。端粒DNA由长5-20kb的(TTAGGG)n重复的排列串组成；将长度超过1 kb的(TTAGGG)n重复序列导入体外培养的人类细胞后,可在70%的转染细胞中发挥端粒功能6。Farr将克隆的端粒DNA导入人-鼠杂种细胞，证明端粒DNA可以形成具有完整功能的端粒7 。1.2 复制起点人基因组DNA中约每50-300kb为一个复制子，每个复制子有一个独立的复制起始点以启动DNA合成8。一些基因位点的复制起始点已被定位，如-球蛋白基因、二氢叶酸还原酶基因等，但将这些位点的DNA片段转入细胞后就失去了复制起始点的功能。现在仍不知一个复制起始点到底需要多大，因为当DNA片段太短时则不具有复制起始点的功能8,9。也不知道构造哺乳动物人工染色体时是否要求特定的复制起点序列。1.3 着丝粒目前还不知道着丝粒的精确的DNA序列，具有着丝粒功能的DNA序列又难以在体外进行操作10，因此，着丝粒结构成为当前HAC研究中的一大难点和热点。人类染色体上具具有一段171bp的-卫星DNA重复序列11，是人类着丝粒的主要组成元件，该序列单体可以不同方式排列成几Mb的片段12。由于人类染色体均含有一定数量的-卫星DNA11，而且大多数人类染色体-卫星DNA均具有着丝粒功能13,因此可以认为，着丝粒功能是以这种重复序列为结构基础的。用含70 kb 21号染色体-卫星DNA序列的DNA或1个85 kb含X染色体来源的-卫星DNA序列的结构进行转染，可以有效地形成HACs，这进一步证实了-卫星DNA在构造人工染色体中的重要作用。2. HAC的构建2.1 天然染色体改造法构建HAC构建HAC的策略之一是以天然染色体的断裂片段为基础，构建新的HAC，如构建HACs14。通过低剂量辐射、端粒定位染色体截断技术、外源性DNA片段定点插入后扩增等都可以获得天然染色体的断裂片段。这种方法通过含有端粒片段和选择标记、有时也通过含有靶染色体同源片段的打靶载体将特定染色体连续截为更小的微型染色体，所获得的微型染色体是自由的，也是可以正常分离的15。图1显示HAC的构建方法及外源基因导入方法。HACs是通过对人21号染色体的长臂（q arm）和短臂（p arm）进行部分序列切除而构建成14，通过cre-重组酶介导的Cre/loxP系统插入待转移的目的基因。图 1 The HAC system14. (a) Generation of the 21DpqHAC vector. (b) Loading of transgene to the 21pqHAC vector.2.2 组装法构建HAC这种方法可以称为组装法或从下到上法，即通过将已成功克隆的着丝粒和端粒DNA导入人类培养细胞来形成从头构造的HACs，所获HACs的长度为1-10 Mb。利用此方法Harrington等在HT1080细胞中得到了第一个HAC3. 他们将大于1 Mb的人17号染色体的-卫星DNA、人端粒DNA、人基因组DNA随机片段用脂质体共转染HT1080细胞,。经过重组，那些同时含有着丝粒、端粒、复制起点且按照正常染色体结构顺序的重组连接产物以染色体的形式稳定保存下来，而那些不完整或未按照正常顺序连接的产物因其不能稳定地进行有丝分裂而丢失、降解。由此通过有丝分裂而自然筛选出HAC16,17。其他研究者利用HT1080细胞导入含有人-卫星序列结构的环状YAC、PAC或BAC结构和端粒序列，这些细胞中产生了从头构造的环状人工染色体18。3. HAC载体表达体系目前，目的基因的插入主要基于如下几种策略:(1)共转染；(2)应用Cre/loxP和FLP-FRT系统进行位点特异性重组；(3)染色体克隆技术14,19,20。Kuroiwa等20将Cre/LoxP介导的位点特异性重组技术同端粒定位染色体截断技术相结合,发展了染色体克隆技术(图2),使精确地插入特定染色体区段成为可能。Auriche等将囊性纤维化跨膜转导调节因子基因(CFTR)全序列及其上游调控序列插入HAC中，成功地检测到了该基因的转录和翻译产物21。Ikeno等22将携带三磷酸鸟苷酸环化水解酶基因(GCH1)全序列(包括编码序列和调控区)的BAC,与包含-卫星DNA序列的BAC共转染，进入人类成纤维细胞内，筛选出携带GCH1基因的HAC克隆，分析结果表明，这些HAC表现出很高的有丝分裂稳定性，且GCH1水平明显提高，并对IFN-的刺激高度敏感。图2 染色体克隆技术4. HAC的应用4.1 基因治疗过去的基因治疗方案中，所用载体在转染宿主细胞后,目的基因可能会出现不表达，或通过非同源重组而插入宿主细胞染色体，造成宿主细胞的癌化等结果，这严重影响了基因治疗的效果23。而 HACs 作为载体则可以避免对宿主细胞染色体的负面影响，并由于其具有携带大片段基因的优点，可以将目的基因调控序列一并导入细胞内，从而实现目的基因时空特异性的表达，大大提高了基因治疗的有效性和安全性,显示出了良好的应用前景。人类人工染色体可以作为表达载体，通过在人类细胞中表达目的蛋白以修补有缺陷的基因，从而可以达到治疗由基因缺陷所致疾病的目的24。有研究表明,携带有全长40 kb、含调控区域、编码次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT1)基因的HACs,可以补偿HPRT缺陷型HT1080细胞的代谢缺陷25。4.2 构建转基因动物生产蛋白质Kuroiwa 等26应用同源位点特异性 Cre2/LoxP 重组，在鸡 DT40 细胞中将 10Mb 含Ig 位点的人 22 号染色体片段，连接到截断的人 14 号染色体上,随后将其转入小鼠胚胎干细胞,获得了可表达人 Ig 的嵌合体小鼠。这预示着可以把利用HAC技术构建转基因动物，使动物成为生产某些对人类有益的生物大分子（如抗体等）的生物反应器。5. 目前研究中存在的问题尽管目前已经成功构建一些HAC系统，并且研究显示其具有极大的应用潜能，但也还有许多问题需要解决。一是关于HAC结构的问题。不同类型的HAC的成功构建为研究人染色体的结构和功能带来了新的视野和新的观点，但究竟哪一种更适合作为基因表达的载体还没能下定论。各种不同方法构建的HAC各有其优劣，需要更多的研究以明确定其应用的价值。二是HAC标准化的问题。目前有关HAC的标准还没用比较具体的标准，只提出了HAC标准化的一些基本条件，Kuroiwa等27对此进行了深入的研究，利用同一载体SC20制作了5种不同的HAC；Katoh M等也在此方面做了大量工作28。三是HAC的转移方法问题。目前较成功的转移方法有显微注射27、脂质体介导28和微细胞融合(microcell fusion)或微细胞介导的染色体转移( microcell-mediated chromosome transfer, MC-MT)2931等,由于HAC较大，用前两种方法易于导致HAC损伤，所以现在常用微细胞融合法。微细胞融合法转移HAC的效率比较低14。目前针对HAC还没用既高效又快速的转移方法，这是限制其应用的一个问题，是科学家需要努力解决的挑战。6. 结语从第一个HAC构建成功至今虽然只有短短十年，还有很多问题需要解决，但HAC已表现出极重要的应用潜能。随着HAC的理论和技术不断完善，HAC必定在基因治疗等领域来发挥巨大的作用。参考文献1 MURRY AW, SZOSTAK JW. Construction of artificial chromosome in yeast. Nature, 1983, 305: 189-193.2 BURKE D T, CARLE G F, OISON M V. Cloning of large fragments ofexogenousDNA into yeastbymeans of artificial chromosome vectors J. Science, 1987, 236:801-811.3 Harrington J J, Van Bokkelen G, Mays R W, Gustashaw K, Wil-lard H F. Formation of de novo and construction of first-genera-tion human artificial microchromosomes.Nat Genet, 1997, 15(4): 345-355.4 Auriche C, Carpani D, Conese M, Caci E, Zegarra-Moran O, Donini P, Ascenzioni F. Functional human CFTR produced by a stable minichromosome.EMBO Rep, 2002, 3(9): 862-868.5 Tyler-Smith C, et al. Curr Opin Genet Devel 3, 390 - 397(1993).6 Ebersole T A,Ross A,Clark E. et al. Mammalian artificial chromosome formation from circular alphoid input DNA does not require telomere repeatsJ.Hum Mol Genet,2000,9(11):1623-1631.7 Farr C,et al.Proc Natl Acad Sci USA 88,7006-7010(1991).8 Kitsberg D,et al.Nature 366,588-590(1993).9 Caddle MS,et al.Nucl Acids Res 20(22),5971-5978(1992).10 Brown W R,Mee P J,Hong S M,et al.Artificial chromosomes:ideal vectors? J.Trends Biotechnol,2000,18(2):218-223.11 Rudd M K,Schueler M G,Willard H F.Sequence organization and functional annotation of human centromeres J. Cold Spring Harb Symp Quant Biol,2003,68:141-149.12 Willard H F,wevrick R,warburton P E.Human centromere structure:organization and potential role of alpha satellite DNA. Prog Clin Biol Res,1989,318:9-18.13 Du Sart D,Cancilla M R,Earle E,et al.A functional neocentromere formed through activation of a latent human centromere and consisting of nonalpha-satellite DNA.Nat Gen-et,1997,16(2):144-153.14 Katoh M, Ayabe F, Norikane S, Okada T, Masumoto H, Horike S, Shirayoshi Y, Oshimura M: Construction of a novel human artificial chromosome vector for gene delivery. Biochem Biophys Res Commun 2004, 321:280-290.15 Itzhaki J E,Barnett M A,MacCarthy A B,et al.Targeted breakage of a human chromosome mediated by cloned human telomeric DNAJ.Nat Genet,1992,2(4):283-287.16 Grimes BRet al. EMBO Rep,2001, 2: 910-91.17 Ikeno Met al. Genes Cells,2002, 7(10): 1021-103.18 Mejia J E,Willmott A,Levy E,et al.Functional complementation of a genetic deficiency with human artificial chromosomesJ.Am J Hum Genet,2001,69(2):315-326.19 Kuroiwa Yet al. Nat Biotechnol,2000, 18: 1086-1090.20 Kuroiwa Yet al. Gene Ther,2002, 9: 708-712.21 Auriche Cet al. EMBO Rep,2002, 3(9): 826-82.22 Ikeno Met al. Genes Cells,2002, 7(10): 1021-103.23 Kawahara M,Inoue T,Ren X,et al.Antigen-mediated growth control of hybridoma cells via a human artificial chromosome. Biochim Biophys Acta, 2007,1770(2):206-212.24 Basu J,Willard H F.Human artificial chromosomes:potential applications and clinical considerations. Pediatr Clin North Am,2006,53(5):843-853.25 Mejia J E,Willmott A,Levy E,et al.Functional complementation of a genetic deficiency with human artificial chromosomes.Am J Hum Genet,2001,69(2):315-326.26 Kuroiwa Y, Tomizuka K,Shinohara T ,et al . Manipulation of human minichromosomes to carry greater t han megabasesized chromosome inserts. Nat Biotechnol ,2000 ,18 (10) : 1086-1090.27 Kuroiwa Y, Yoshida H, Ohshima T, Shinohara T, Ohguma A, Kazuki Y, Oshimura M, Ishida I, Tomizuka K. The use of chromosome-based vectors for animal transgenesis.Gene Ther, 2002, 9(11): 708-712.28 Katoh M, Ayabe F, Norikane S, Okada T, Masumoto H, Horike S, Shirayoshi Y, Oshimura M. Construction of a novel human artificial chromosome vector for gene delivery.Biochem Biophys Res Commun, 2004, 321(2):280-90.29 Co D O, Borowski A H, Leung J D, van der Kaa J, Hengst S, Platenburg G J, Pieper F R, Perez C F, Jirik F R, Drayer J I. Generation of Transgenic Mice and Germline Transmission of a Mammalian Artificial Chromosome Introduced into Embryos by Pronuclear Microinjection.Chromosome