气液色谱分析.doc

色谱分类方法：1. 按固定相外形： 柱色谱（填充柱、空心柱毛细管柱色谱）、平板色谱（薄层色谱和纸色谱）。2. 按组分在固定相上的分离机理： 吸附色谱：不同组分在固定相的吸附作用不同； 分配色谱：不同组分在固定相上的溶解能力不同； 离子交换色谱：不同组分在固定相（离子交换剂） 上的亲和力不同；凝胶色谱（尺寸排阻色谱）不同尺寸分子在固定相上的渗透作用.3. 按两相状态分类方法固定相平衡类型适用气相色谱气液色谱固定液吸附于惰性载体（担体）气液间分配小分子量气体及烃类，如大气成分分析气体试样或能被气化的固体和液体试样气固色谱固体吸附剂吸附、解吸气相键合色谱有机组分键合于固体表面气体和键合体表面间的分配液相色谱液液色谱固定液吸附于惰性载体不相溶液体间的分配高沸点、热稳定性差、相对分子质量大得有机物液固（吸附）色谱固体吸附剂吸附、解吸液相键合色谱有机组分键合于固体表面液体和键合体表面间的分配离子交换色谱离子交换树脂离子交换离子对色谱法空间排阻色谱法/凝胶渗透色谱法液体附于多孔聚合物分配/筛析（多孔性物质对不同大小分子的排阻作用不同）超临界色谱有机组分键合于固体表面超临界流体和键合相间分配4.HPLC液相色谱中按固定相和流动相极性大小分为：正相色谱（固定相极性大于流动相，极性小的先流出，适于极性组分分离）、反相色谱（固定相极性小于流动相，极性大的先流出，适于非极性组分分离）GC毛细管柱气相色谱的特点：(i) 渗透性好：可使用较长的色谱柱；(ii) 相比率大：有利于提高柱效；加上保留因子k小，渗透性好，可使用很高的载气流速，因而分析速度快；(iii) 柱容量小：因而进样量小。需采用分流技术并使用更高灵敏度的检 测器；(iv) 总柱效高：尽管毛细管柱效比填充柱大，但仍处于同一数量级。但 毛细管柱长很大，因而总柱效高，分离复杂混合物能力强。色谱分离方法的选择试样分子量水溶性、离解性方法流动性物质种类2000溶于水排阻色谱水不溶于水排阻色谱非水2000不溶于水正/反相色谱同系物吸附色谱异构体多功能团排阻色谱分子大小差异溶于水，不解离反相色谱排阻色谱（小孔）水溶于水，可解离阳离子交换色谱碱阴离子交换色谱酸溶于水，离子与非离子反相离子对色谱固定相：固体吸附剂、固定液+载体固定液：1。要求：a) 热稳定性好、蒸汽压低流失少；b) 化学稳定性好不与其它物质反应；c) 对试样各组分有合适的溶解能力（分配系数K适当）；d) 对各组分具有良好的选择性 2.固定液与组分的作用力：a) 色散力非极性分子之间b) 诱导力极性与非极性分子之间c) 取向力极性与极性分子之间d) 氢键力静电吸引，亦属取向力。3.固定液的选择：固定液的特性参数：相对极性0P100； 固定液特性常数DI：罗氏常数、麦氏常数固定液选择：按“相似相溶”原理选择固定液。 非极性组分非极性固定液沸点低（小分子物质）的物质先流出； 极性物质极性固定液极性小的物质先流出； 各类极性混合物极性固定液极性小的物质先流出； 氢键型物质氢键型固定液不易形成氢键的物质先流出； 复杂混合物两种或以上混合固定液极性：正己烷环己烷苯甲苯按化学基团相似原则选择；按组分主要性质差别选择HPLC的流动相：HPLC流动相为溶剂（其极性、粘度、PH值、浓度等均可改变，可调节样品在两相间分配的差异），它既有运载作用，又和固定相一样，参与对组分的竞争，因此溶剂的选择对分离十分重要。 理想的溶剂应有下列特性：1）对待测物具一定极性和选择性；2）使用UV检测器时，溶剂要匹配 ；使用折光率检测器，溶剂的折光率要与待测物的折光率有较大差别；3）高纯度。否则基线不稳或产生杂峰；4）化学稳定性好；5）适宜的粘度。粘度过高，柱压增加；过低，易产生气泡。为防止固定相的流失，流动相与固定液应尽量不互溶，或者说二者的极性相差越大越好。固定相（P77,70色谱法）HPLC通常按固定相的不同分为多种类型各种色谱方法如液液色谱法、液固色谱法、离子交换色谱法、离子对色谱法等1、液液分配色谱 根据各待测物在互不相溶的两溶液中的溶解度不同，因而具不同的分配系数。在色谱柱中，随着流动相的移动，这种分配平衡需进行多次，造成各待测物的迁移速率不同，从而实现分离的过程。2、离子交换色谱原理：利用不同待测离子对固定相的亲和能力（或离子交换能力）的差别来实现分离的。3、离子对色谱法（IPC）将与待测物离子A电荷相反的离子B（称为对离子或反离子）加入到流动相中，使待测离子与对离子形成离子对AB，该AB离子对的性质与A离子或B离子的性质不同，即间接改变了待测离子的保留特性。4、尺寸排阻色谱法固定相为化学惰性的多孔凝胶，它类似于分子筛，但孔径更大。凝胶内有一定大小的空穴，分子体积大的待测物不能渗入孔穴中而被排阻，较早地被淋洗出来，中等的部分渗透，小分子则完全渗透，最后流出色谱柱。即待测物分子按分子大小(分子量大小)先后从柱中流出。一、色谱分析的基本原理：借在两相间分配原理而使混合物中各组分分离。根据组分与固定相与流动相的作用力不同，当两相做相对移动时，各组分在两相中反复多次分配（/吸附解吸）而相互分离，依次流出色谱柱，进入检测器进行检测二、气相色谱的理论基础：色谱的分离行为应从热力学和动力学两方面进行研究、解释。1.试样中各组分在两相间的分配情况，由组分在两相间的分配由分配系数（热力学性质）、各物质（试样中的组分、固定相、流动相）的分子结构和性质决定，它使得各组分在不同时间流出峰间距，由各个色谱峰在柱后出现的时间（保留值）反映；2.各组分在色谱柱中的运动（分散）情况，由传质和扩散（动力学性质）决定，它使得各组分峰有一定的宽度峰宽，由峰宽反映。描述分配过程的参数： 1.分配系数K与组分和两相的性质、柱温、柱压有关，与两相体积、柱管特性和所用仪器无关。2. 分配比 反映了组分在柱中的迁移速率，是衡量色谱柱对组分保留能力的重要参数。与组分和两相的性质、柱温、柱压和相比有关。（b 称为相比率，是反映色谱柱柱型及其结构的参数）3. 选择因子(相对保留值r21) a 色谱柱对A、B两组分的选择因子a 为A为先流出的组分，B为后流出的组分。K 或 k 反映的是某一组分在两相间的分配；而 a 是反映两组分间的分离情况！两组分在两相间的分配系数不同，是色谱分离的先决条件。色谱分离的基本理论：（GC）1. 塔板理论（将色谱柱当作精馏塔，用塔板概念来描述组分在柱中的分配行为 ）理论塔板数：有效塔板数有效塔板高度 （普通柱的为0.1cm）塔板理论描述了组分在柱内的分配平衡和分离过程、导出流出曲线的数学模型、解释了流出曲线形状（呈正态分布）和位置、提出了计算和评价柱效的参数（说明柱效柱分离能力的发挥程度时，必须注明该柱效是针对何种物质、固定液种类及其含量、流动相种类及流速、操作条件等），但该理论是在理想情况下导出的，未考虑分子（纵向）扩散因素、其它动力学因素对柱内传质的影响。它不能解释：峰形为什么会扩张等动力学问题，也不能预言分离的可能（由K和柱效决定），不能解释同一色谱柱在不同载气流速下柱效不同的原因。（GC/HPLC）2. 速率理论（GC、HPLC）van Deemter方程： 曲线的最低点对应最佳线速 下的最小板高；u 为流动相线速度； A，B，C为常数，其中A分别表示涡流扩散系数；B分子扩散系数； C传质阻力系数（包括液相和固相传质阻力系数）。从动力学角度很好地解释了影响板高（柱效）和峰扩张的各种因素GC、HPLC定义减小措置说明各因素相互制约涡流扩散项A受到填装不均大小不一的固定相颗粒的阻碍，组分在迁移过程中随流动相不断改变方向，形成紊乱的“涡流”，导致同一组分运行路线长短不同流出时间不同峰形展宽。细粒的固定相并填充均匀。对于空心毛细管柱，无涡流扩散，即A=0。分子（纵向）扩散项B/u当样品被注入色谱柱时，它呈“塞子”状且不充满色谱柱而产生浓度梯度。随着流动相的推进， “塞子”因浓度梯度而向前后自发地扩散，使谱峰展宽。球状颗粒；大分子量流动相；适当增加流速；短柱；低温。流速低时主导（GC）HPLC可忽略传质阻力项Cu因传质阻力的存在，使分配不能“瞬间”达至平衡，因此产生峰形展宽。气相传质阻力和液相传质阻力均有A:流动相传质阻力（流动的流动相中的传质和滞留的流动相中的传质）B：固定相传质阻力（从两相界面到固定相内部的质量交换，在液液分配色谱中取决于固定液的液膜厚度）减小填充颗粒直径；采用分子量小的流动相；减小液膜厚度，但此时k减小（增加担体表面积，固定液越多；但比表面积过大会因吸附过强而使峰型拖尾）增加柱温（但k值也减小）GC流速高时、HPLC主导（流速不宜快）流动相传质阻力：a流动的流动相中的传质：流动相通过色谱柱内的固定相时，靠近固定相颗粒的流动相流动稍慢而对较远的稍快的液体产生的阻力；b滞留的流动相中的传质：固定相由于多孔性造成部分流动相在局部滞留，而流动相中的试样分子要与固定相进行质量交换，则会受到滞留区的阻力3. 分离度及色谱分离方程 （GC）分离度（同时反映色谱柱效能和选择性的综合指标），定义为：R 越大，相邻组分分离越好。当R=1.5时，分离程度可达99.7%，通常用作是否分开的判据色谱分离方程：、将 R 与影响其大小的因素：柱效n（由知增加柱长可提高R，但使分析时间）、选择因子a（a柱的选择性R；降低柱温、改变固定相和流动相的性质和组成） 和保留因子 k （kR，但需在一定范围；增加柱温、固定相和流动相性质和组成、固定相的量）联系起来气相色谱分离分析条件 1. 固定相的选择 相似原理2. 柱长L3. 载气及流速u4.柱温：在固定液最高使用温度和最低使用温度（固定液的凝固点点）之间 在使最难分离的组分尽可能好的分离的前提下，采取较低的温度。对于沸点范围较宽的试样，宜采用程序升温，使低沸点及高沸点组分都能在各自适宜 的温度下得到良好的分离。5. 载体粒度及筛分范围 载体粒度越小，柱效越高。但粒度过小，则阻力及柱压增加。6. 进样方式及进样量 要以“塞子”的方式进样，以防峰形扩张；进样量，也要以峰形不拖尾为宜。改善分离效果方法：1.程序升温：使柱温按预定的加热速率，随时间做线性或非线性的增加，使低沸点及高沸点组分都能在各自适宜的温度下得到良好的分离，以保持较好峰型（宽沸点试样）2.梯度洗提（梯度洗脱）：流动相中含有两种（或更多）不同极性的溶剂，在分离过程中按一定的程序连续改变流动相中溶剂的配比和极性，通过流动相中极性的变化来改变被分离组分的容量因子和选择性因子，以提高分离效果。3.化学键合固定相：用化学反应的方法通过化学键把固定液有机分子结合到担体表面所形成的固定相。以化学键合相为固定相的色谱法为化学键合色谱法。4.其他：程序改变流速；组合柱等方法。GC载气系统进样系统柱分离系统检测系统（+记录系统）获得纯净、连续、流速稳定的载气将试样在进入色谱柱前瞬间气化，后快速定量转入色谱柱中TCD、FID、FPD、ECD把混合物中被分离的各组分的浓度或质量转换成电信号的装置温控系统：主要指对色谱柱室、气化室、检测器的温度控制：HPLC高压输液装置进样系统分离系统检测系统（+记录系统）增加高压泵以提高流动相的流动速度，克服阻力紫外检测器、荧光检测器及电化学检测器等各组分的分离可与MS等联用；结果为色谱流出曲线一、色谱流出曲线（色谱图）1.相关术语：基线、保留值表示试样中各组分在色谱柱中的滞留时间。包括死时间tM、保留时间tR、调整保留时间、死体积VM、保留体积VR、调整保留体积VR、相对保留值（r2,1只与柱温和固定相性质有关，而与柱内径、柱长L、填充情况及流动相流速无关 ）区域宽度：包括标准偏差、半峰宽度、峰底宽度 峰高、峰面积2.色谱流出曲线的意义：色谱峰数=样品中单组分的最少个数； 色谱保留值定性依据；色谱峰高或面积定量依据； 色谱保留值和区域宽度色谱柱分离效能评价指标（分离好坏）； 色谱峰间距固定相或流动相选择是否合适的依据。二、进样器：注射器（进样优点:死体积小结果精确度高；缺点：定量不准确重复性差）、六通阀/多通进样阀（与注射器相反）三、GC检测器 ：理想条件（1）适合的灵敏度S（单位样品量/质量的改变引起的信号改变）（2）稳定、重现性好；（3）线性范围（最大进样量与最小检出限的比值）宽，可达几个数量级；（4）响应时间短，且不受流速影响；（5）选择性好；（6）不破坏样品。（7）检出限D（D=3N/S，N为检测器的噪声）种类：1. 热导检测器TCD; 2. 氢火焰离子化检测器FID; 3. 电子捕获检测器ECD;4. 火焰光度检测器FPD;1. 热导检测器(TCD) 浓度型检测器 适用于各类气相物质原理：由于不同物质所具有的热传导系数不同，当它们到达处于恒温下的热敏元件（如Pt, Au, W, 半导体）时，其电阻将发生变化，将引起电阻变化通过某种方式转化为可以记录的电压信号，从而实现其检测功能。影响因素：较大的桥电流、较低的池体温度、低分子量的载气以及具有大的电阻温度系数的热敏元件可获得较高的灵敏度。2. 氢火焰离子化检测器（FID） 质量型检测器应用：含碳有机物如烃类，不用于不电离无机化合物，如水、永久性气体等含碳有机物在氢焰中燃烧时，发生化学电离反应产生的正负离子，在电场作用下定向移动形成微电流，经过高电阻产生电压，放大后被检测器检测。影响因素：载气和氢气流速：通常以N2为载气，其流速主要考虑其柱效能。但也要考虑其流速与H2流速相匹配。）空气流速：一定范围内，空气流速越大，灵敏度越大；操作温度3. 电子捕获检测器(ECD) 主要对含有较大电负性原子的化合物响应。特别适合于环境样品中卤代农药和多氯联苯等微量污染物的分析。4. 火焰光度检测器（FPD） 主要用于含硫和含磷的有机物定性分析