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液体芯片飞行时间质谱技术在分子诊断研究中的应用 生物技术世界第2007-02期字体大小： 日期:2007-2-28 文/马庆伟 程肖蕊 博扬生命科技有限公司 分子诊断是遗传学、分子生物学和病理学相结合的产物，它是以分子生物学理论为基础，利用分子生物学的技术和方法研究人体内源性或外源性生物大分子和大分子体系的存在、结构或表达调控的变化，为疾病的预防、预测、诊断、治疗和转归提供信息和决策依据。通过对DNA和蛋白质分析来评估个体的生理/病理状态是分子诊断的主要内容。分子诊断的基础是分析被筛查者的组织细胞、毛发、抗凝血或干血迹，甚至甲醛固定、石蜡包埋组织中的基因或蛋白。 目前用于分子诊断的技术主要包括基于PCR的方法如PCR-STR、RT-PCR、原位PCR、PCR-RFLP、实时定量PCR等；DNA测序；异源双链分析；化学裂解和酶裂解错配分析；蛋白截断测验；质谱法以及DNA芯片等。这些方法各有其优缺点，如PCR在医学检验学应用最为广泛，但却需要明确被检测病原体、肿瘤和遗传病等基因的序列。又如DNA芯片为快速检测病原体和疾病组织中的突变序列提供了手段，并可实现高通量、大规模的操作，但是其准确性和重复性尚待提高。目前，分子诊断存在的问题，主要集中在准确性、稳定性和复杂性上。液体芯片飞行时间质谱技术（CLINPROTTMMALDI-TOF MS）采用不同功能表面的磁珠（即液体芯片），对复杂体液如血清、血浆、尿液、唾液或脑脊液、组织裂解液、细胞培养上清液进行处理，利用基质辅助激光电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）发现潜在的生物标志物，并能够鉴定单个的生物标志物候选物，具有准确性高、稳定性好、灵敏度高、重复性好、高通量、可自动化等特点，在卵巢癌、肺癌、胃癌、白血病、神经系统疾病等疾病中得到应用，并取得明显的进展。下面就将液体芯片飞行时间质谱技术的原理和工作流程以及在分子诊断中的应用作一简要综述。 液体芯片飞行时间质谱技术概述 液体芯片飞行时间质谱技术的原理 液体芯片飞行时间质谱技术主要用于从复杂体液如血清、血浆、尿液、唾液或脑脊液、组织裂解液、细胞培养上清液中发现潜在的生物标志物。一方面，该技术能够在生物液体中检测指示特异疾病的生物标志物模式或生物标志物谱，另一方面，该技术还可以鉴定单个的生物标志物候选物。液体芯片飞行时间质谱由3部分组成：磁珠部分即液体芯片部分：目前有疏水作用磁珠、金属螯合磁珠、离子交换磁珠、糖蛋白磁珠和免疫亲和磁珠。飞行时间质谱仪即芯片阅读仪，用于获取磁珠捕获的蛋白质质量和含量。分析软件。 液体芯片飞行时间质谱技术的原理是：为解决在不损害功能及不增加背景的条件下分离蛋白质的难题，根据色谱及探针的原理，磁珠（液体芯片）表明经化学（疏水、亲水、阳离子、阴离子及金属离子螯合等）或生物化学（抗体、受体、配体、酶、DNA等）处理，并经过选择性清洗，与加入的能量吸收分子（EAM）结合，形成晶体，样品被送入质谱仪，在特异的激光照射后，带电分子在通过电场时加速，记录仪记录飞行时间的长短，不同质荷比的蛋白质在长度一定的真空管中飞行所需时间不同，蛋白质的质荷比（M/Z）与离子飞行时间的平方成正比。信号由高速的模拟数字转化并记录，被测定的蛋白质以一系列波锋的形式出现，并由此绘制出待测蛋白的质谱图。再采用软件进行质谱图的比对和分析，即可发现各样本间的蛋白质表达和含量的异同。 液体芯片飞行时间质谱技术的工作流程 液体芯片飞行时间质谱技术的工作流程因研究的目的不同而不同，通常分为两类：用于蛋白质/肽表达谱检测研究；用于发现和鉴定生物标志物的临床蛋白质组表达谱研究。 用于蛋白质/肽表达谱检测研究的工作流程为：应用磁珠法（MB）和AnchorChipTM技术对血清样品进行质谱检测前的分级分离和制备；应用基质辅助激光解析电离飞行时间（MALDI-TOF）质谱技术进行检测，得到线性和反射模式的蛋白质表达谱；应用MALDI-TOF/TOF质谱技术对同一检测样品斑或重新点样以识别低分子量（MW）质谱峰；应用ClinProToolsTM软件进行数据的筛选，蛋白质组指纹的生成和可视化。该工作流程可用图1表示。 用于发现和鉴定生物标志物的临床蛋白质组表达谱研究的工作流程为：基于磁珠的样本制备；MALDI-TOF质谱采集；数据库检测和生物信息学的比较；复杂生物标志物模式模型的发现。该工作流程可用图2表示。 分析以上两方面的技术流程可以看到，采用液体芯片飞行时间质谱技术进行蛋白质/肽谱的研究和生物标志物谱发现的研究具有共同的本质，即都包括样品的制备、MALDI-TOF质谱和数据的生物信息学分析软件，不同的目的所选用的软件不同，主要有用于生物标志物检测和评价的软件（ClinProTools）和用于确认和鉴定生物标志物（biomarker ID）的软件（BioTools）。 由于液体芯片飞行时间质谱技术具有准确度高、快速、高通量、灵敏度高、重复性好、分辨率高、检测费用低等特点，该技术已广泛应用于卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、脑胶质瘤、头颈鳞癌、膀胱癌等的早期诊断研究中。 液体芯片飞行时间质谱技术在分子诊断中的应用进展 与核酸相比，蛋白和多肽作为生物标志的一个优势是它们能够很容易的在血液、尿液和其他生物体液中找到。这些类型的样品很容易获得，并代表了含有丰富的具有潜在信息的生物学信息分子。 MALDI-TOF-MS是快速整合这些样品类型的关键工具。临床蛋白组的目标就是利用这个工具的强大能力来鉴定独特的条件特异的蛋白指纹，由此导致可以用在疾病诊断和疾病危险性评估、疾病进程和干涉效果的基本特异性生物标志物的阐明和应用。目前，液体芯片飞行时间质谱技术已在前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌、卵巢癌、肺癌、胃癌、白血病、神经系统疾病等疾病中得到应用，并取得明显的进展。 在前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌研究中，2006年Josep Villanueva等人对32例前列腺癌、21例乳腺癌和20例膀胱癌，以33例健康人为对照，共106个样品用C8磁珠分离纯化，液体工作站自动处理，将所得样品点在MALDI-TOF Anchor Chip上，进行自动质谱分析，系统的重复性用12个参照样品进行验证。结果表明，CLINPROT系统能够产生质量优良的蛋白质/肽谱图；在0.7-15Kda之间发现了651个差异表达的峰，经统计分析软件处理后，产生了68个可区分前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌和健康人的多肽峰，并且这些峰都经过质谱序列鉴定。其中有14个、10个和58个可分别作为前列腺癌、乳腺癌和膀胱癌的肿瘤标志物。 对另外的41例前列腺癌患者的血清的盲性测试表明，它的预测准确率为100%。对其中的61个特征肽的MS-MS序列分析表明，它们是血液中高丰度蛋白的分解产物。这表明在体外的血液凝固过程中，胞外的蛋白酶活性造成蛋白的酶切降解产生了不仅是癌症，而且是特定种类癌症的特征血清多肽。进一步对其中高离子丰度的47个峰的TOF/TOF或Q-TOF研究表明，它们来自11个前体蛋白，这些峰包括了血纤维蛋白肽A、补体C3f和血管舒缓激肽系统的全部的19个多肽。血清中的氨蛋白酶活性可分解人工合成的C3f蛋白。 卵巢癌是所有生殖系统恶性肿瘤中恶性程度最高的肿瘤，发病因素尚未完全明确，研究表明与生殖因素及遗传因素有关。大多数卵巢癌病例都是在晚期才被检测，患者很少还能治好。因此，迫切需要开发出一种早期临床诊断以提高存活率。在卵巢癌的研究中，2003年美国哈佛医学院女子医院利用Clinprot系统的四类磁珠，即弱阳离子磁珠（WCX）、疏水性磁珠（C8）、金属亲和Fe（IMAC-Fe）、金属亲和Cu磁珠（IMAC-Cu）分离了8例I期卵巢癌病人和8个相应年龄段的健康人血清，采用Anchorchip样品靶，并用autoflex、ultraflex质谱仪获得质谱图，采用ClinproTools软件进行数据分析，研究了卵巢癌的蛋白生物标志物，结果表明，CLINPROTTM质谱系统能够产生高质量可重复的血清蛋白质表达谱；利用获得的蛋白组指纹区分癌症和正常人的准确率可达97100%；利用ClinPro Tools软件的可视化特点可以肉眼发现并证实候选的生物标记物；从血清蛋白质表达谱中识别低分子量肽；并鉴定了一个小分子量蛋白，该蛋白同人互补C3f同源。 在肺炎的研究中，2005年Ralf Ketterlinus等人利用ClinProtTM研究肺炎的生物标志物，其样品的处理使用疏水磁珠（MB-HIC8）、弱阳离子交换磁珠（MB-WCX）和铜离子免疫金属亲和色谱磁珠（IMAC-Cu），所得蛋白混合物经UltraflexTMTOF/TOF获得质谱图，并利用ClinProToolsTM软件分析获数据，结果表明，采用ClinProToolsTM软件提供的多种质谱图可视化方式，如虚拟凝胶图、堆叠图等，可以很方便的区分疾病和健康人之间的质谱峰和蛋白表达的差别。发现了一些差异质谱峰，如利用WCX磁珠在11524.9Da区域发现了很显著的差异。 在哮喘的研究中，2004年Xinyi Zhang等人整合MB-C8 、AnchorChip技术和MALDI-TOF-MS研究哮喘病人和健康人的血浆蛋白表征，结果表明，CLINPROT系统可产生很好重复性的蛋白/多肽特征谱。使用ClinProt Tools允许人血浆中潜在多肽/蛋白生物标志物的快速扫描，能够显现正常人和哮喘病人血浆间细微但显著的差别。而且利用这些潜在的差异，正常和哮喘病人血浆特征谱可以被100识别。 急性淋巴细胞白血病是白细胞的恶性增殖疾病，占儿科疾病的35，是儿童最常见的癌症。2004年Elke Schffeler等人利用CLINPROT系统，对37名急性淋巴性白血病（ALL）患者和40名对照人群的EDTA血清样本并进行分析，使用3种不同功能的磁珠（即：MB-HIC C8，MB-WCX，MB-IMAC Cu）制备样品，质谱结果表明具有高度的重复性。根据差异表达质谱峰，从每个组中抽取了30个样本建立起一个分类预测模型。该模型可成功地从7名急性淋巴性白血病患者和10名对照人群中区分出一个仅仅依靠CLINPROT判断的确诊病人。 在脑肿瘤的研究中，2003年Leung等人对8例脑肿瘤病人和8例良性疾病病人的脑脊液进行分析，结果表明，ClinProt系统可以生成高质量、可重复的脑脊液蛋白质表达谱，并且可以发现肿瘤组和正常对照组之间潜在的差异。除此之外，所发现的差异可以应用ClinPro Tools软件的直观可视化特性进行检查并验证。采用该方法还可以从脑脊液蛋白质表达谱中直接发现低分子量肽，显示出该系统中有关蛋白质表达谱检测和识别等单一工具的实用性。同时表明，ClinProt系统的主要优点在于允许科研人员使用单一、易于应用、集成的系统进行蛋白质表达谱的检测、蛋白质组指纹的发现以及蛋白质的识别。 在神经胶质瘤的研究中，2004年Josep Villanueva等人采用CLINPROT的磁珠纯化、自动液体处理工作站和飞行时间质谱仪系统，分析了22个对照正常健康人和34个神经胶质瘤病人的蛋白质表达谱，结果表明，利用谱图中274个在病人和正常人中差异表达的多肽建立谱模型，该模型对正常和病人诊断的特异性可高达96.4%。 展望 分子诊断的进展现已允许在单个试验中评估多个基因或蛋白，这一特点尤其在复杂性状疾病（如肿瘤、心脑血管疾病、代谢病、神经系统疾病、自身免疫性疾病等）的研究中更为明显。在筛选正常细胞和疾病细胞之间个别蛋白的差异表达、确定疾病发生的关键途径以及将疾病分成各种临床类型等方面，蛋白质组学具有振奋人心的潜能。随着更多的和全方位的诊断性、预测性、预后性分子检测进入疾病诊断和治疗,将会使患者从个性化诊疗中最大程度地获益。 质谱技术是蛋白质组研究中最重要的技术，在蛋白质组学研究中应用最广泛的质谱技术是MALDI-TOF质谱，基于MALDI-TOF的液体芯片飞