2012CB932500-G-肝癌治疗的新型纳米药物研究.doc

项目名称：肝癌治疗的新型纳米药物研究首席科学家：杨祥良 华中科技大学起止年限：2012.1至2016.8依托部门：教育部一、关键科学问题及研究内容1、拟解决的关键科学问题 肝癌被称为“癌中之王”，严重危害我国人民的生命健康，近几十年来，肝癌的药物治疗仍未取得突破性进展。本项目围绕新型纳米药物改善肝癌治疗效果这一中心目标，拟解决以下三个关键科学问题：（1）设计与构建新型纳米药物，突破肝癌生理屏障，提高肝癌细胞靶向性肝癌组织不规则脉管系统、组织间液高压、以及肝癌特殊的肝硬化病理特征产生的纤维化样胞外基质构成了肝癌复杂的生理屏障，导致抗肝癌药物不易穿透到离血管较远的组织细胞，并且抗肝癌药物的非选择性杀伤对正常肝功能的破坏严重影响治疗效果。因此，设计、构建能突破肝癌生理屏障、对肝癌细胞具有良好靶向性的新型纳米药物是改善肝癌药物治疗效果的第一个关键科学问题。（2）发展新型纳米药物，降低肝癌细胞耐药性肝癌细胞膜上固有的高表达ABC蛋白及肝脏独特的代谢解毒机制，使肝癌对化疗药物普遍具有耐药性。最近研究表明，肝癌中存在的癌干细胞也是导致耐药的重要原因之一。因此，针对肝癌的耐药机理，设计、构建能降低肝癌细胞耐药性的新型纳米药物是改善肝癌药物治疗效果的又一个关键科学问题。（3）发展新型纳米药物，调控肝癌免疫微环境肝脏先天具有免疫抑制特征，同时肝癌细胞分泌抑制性细胞因子，抑制树突状细胞（DC）的活化以及CTL和NK细胞的功能，躲避免疫攻击，并且肝癌组织招募大量抑制性免疫细胞Treg等，进一步造成了肝癌免疫逃逸。因此，发展多靶点调控肝癌免疫微环境的新型纳米药物，改善肝癌药物治疗效果是本项目拟解决的第三个关键科学问题。2、主要研究内容本项目紧紧围绕新型纳米药物改善肝癌治疗效果这一中心目标，针对亟待解决的关键科学问题，设计、合成新型的功能化纳米材料，构建安全、高效的新型纳米药物；揭示新型纳米药物突破肝癌生理屏障、靶向肝癌细胞、降低肝癌细胞耐药性、调控肝癌免疫微环境的机制；研究新型纳米药物的体内过程，评价其肝癌治疗效果与生物安全性；发展具有降低肝癌细胞耐药性的新型化疗纳米药物和具有调控肝癌免疫微环境的新型免疫治疗纳米药物，并与现代医疗技术相结合，改善肝癌药物治疗效果。运用纳米科学、化学、材料学、生物学、临床医学、药理学和肿瘤免疫学等研究手段，从分子、细胞、组织和动物四个层次上开展以下研究工作： （1）突破肝癌生理屏障新型纳米药物的构建与表征 新型纳米材料的设计、合成与表征针对肝癌组织异常的脉管系统与肝硬化背景下纤维化样胞外基质，采用有机化学、高分子化学、超分子化学以及生物材料学等的方法和原理，设计、合成对肝癌组织和肝癌细胞特殊微环境刺激具有响应能力，且具有长循环与EPR效应的新型纳米材料，包括对热、pH、酶和氧化还原环境等快速响应或降解的两亲性嵌段聚合物，如二硫键桥联的聚酯和聚乙二醇（或聚乙撑乙基磷酸酯）的嵌段聚合物、腙键桥联的聚乳酸和聚乙二醇的嵌段聚合物、生物可降解纳米凝胶、脂质材料等，并进行化学组成和结构的鉴定及理化特性的表征。 新型纳米药物的构建与表征运用分子/粒子自组装、外场诱导组装（如微流控-乳液溶剂挥发法、Pickering乳化界面组装法）等先进技术，构建新型纳米药物载体（如纳米凝胶、聚合物胶束、纳米脂质体、固体脂质纳米粒、聚合物纳米粒和纳米泡等），负载突破生理屏障的辅助药物、化疗增敏剂、化疗药物或候选药物、免疫治疗药物等，发展具有突破肝癌生理屏障、靶向肝癌细胞、降低肝癌细胞耐药性的新型化疗纳米药物和调控肝癌免疫微环境的新型免疫治疗纳米药物，并对其粒径、形貌、表面电荷等理化特性进行表征，研究药物在不同介质条件下的释放特性。 新型纳米药物靶向肝癌细胞的机制研究针对肝癌细胞表面特征分子，通过偶联特异性配体（如AFP受体单抗、iRGD多肽、Tf及其受体单链抗体等），构建靶向肝癌细胞的纳米药物，研究这些靶向分子的种类、密度等对纳米药物生物活性的影响，并阐明其对肝癌细胞的粘附、摄取过程的影响和规律，揭示其作用机制。 新型纳米药物突破肝癌生理屏障的机制研究基于肝癌血管和肝硬化组织的结构特点，建立体外肝癌血流模型，模拟肝癌组织胞外基质，系统研究纳米药物的扩散和传输过程，探讨纳米药物的理化特性（尺寸、形貌和电荷等）、辅助性药物等对纳米药物在模拟血管和模拟胞外基质中扩散、传输行为的影响，揭示纳米药物突破肝癌生理屏障的规律；研究现代医疗技术（如射频技术、超声技术等）联用对纳米药物突破肝癌生理屏障的作用和协同效应。（2） 新型纳米药物降低肝癌细胞耐药性的机制和药效学研究 新型化疗纳米药物降低肝癌细胞耐药性的机制研究以国家新药筛选中心候选药物库中的Y31等和临床上治疗肝癌的一线药物阿霉素等构建的新型化疗纳米药物，选择肝癌的典型耐药细胞株，考察新型纳米药物对肝癌耐药细胞增殖、凋亡和细胞周期等的影响，从细胞水平阐明纳米药物的组成、结构和理化特性与降低肝癌细胞耐药性之间的关系。采用肝癌耐药细胞株及肝癌耐药动物模型，经新型纳米药物处理或治疗，测定耐药细胞及肿瘤组织中药物浓度等变化，测定ATP酶、葡萄糖神经酰胺合成酶（GCS）和谷胱甘肽S转移酶（GST）等的活性，检测多药耐药转运蛋白、细胞凋亡相关蛋白及其编码基因的改变，探讨新型纳米药物的组成、结构和理化特性等对药物的外排、细胞解毒途径和信号转导等的影响。 新型化疗纳米药物的胞内动力学过程研究研究新型纳米药物与肝癌敏感细胞、耐药细胞的结合/粘附、摄取、胞内滞留及转运等过程和经时变化规律，研究其入胞速度与程度、胞内分布与动力学行为，揭示新型纳米药物的组成、结构和理化特性对其入胞过程及胞内行为的影响，阐明其与降低肝癌细胞耐药性之间的关系。 新型化疗纳米药物对肝癌干细胞的作用研究研究纳米药物的组成、结构和理化特性对肝癌干细胞的自我更新、分化和成瘤能力的影响；研究经新型纳米药物治疗后肝癌组织中癌干细胞的比例和“干性”变化；在体内研究新型纳米药物如何通过杀伤肝癌干细胞和干扰肝癌干细胞的自我更新、分化来影响肝癌的发展、复发和转移等。 新型化疗纳米药物降低肝癌细胞耐药性的体内药效学评价建立肝癌耐药动物模型，进行体内药效学评价，包括动物存活时间、瘤重变化，并对肿瘤组织进行病理学分析，从动物水平上评价新型纳米药物降低肝癌细胞耐药性的效果。（3） 新型纳米药物调控肝癌免疫微环境的机制和药效学研究 新型免疫治疗纳米药物清除Treg等的机制研究以清除Treg的环磷酰胺等构建的新型免疫治疗纳米药物为对象，研究其对模型小鼠肝癌组织中抑制性免疫细胞Treg等的清除作用及机理；研究新型纳米药物的组成和理化特性等对清除作用的影响；揭示抑制性免疫细胞的清除对肝癌组织中DC、CTL和NK细胞等的数量及功能变化规律；阐明抑制性免疫细胞的清除对肝癌组织抑制性免疫因子表达的影响；观察荷瘤小鼠的存活时间及瘤重变化，并对肿瘤组织进行病理学分析，评价其肝癌治疗效果。 新型免疫治疗纳米药物中和免疫抑制因子的机制研究以负载抗TGF-等的中和抗体的新型免疫治疗纳米药物为对象，研究其对免疫抑制因子TGF-等的中和作用与机理，测定肝癌组织中TGF-等的表达与组织分布；研究新型纳米药物的组成和理化特性等对中和作用的影响；阐明免疫抑制因子中和对肝癌组织中DC、CTL和NK细胞等及免疫抑制细胞Treg等的数量及功能变化影响的规律；观察荷瘤小鼠的存活时间及瘤重变化，并进行肿瘤组织病理学分析，评价其肝癌治疗效果。 新型免疫治疗纳米药物和化疗纳米药物协同增效的机制研究建立小鼠肝癌模型，研究上述多靶点的免疫治疗纳米药物与化疗纳米药物联合用药，对肝癌组织内DC、CTL和NK细胞及抑制性免疫细胞Treg等数量及功能的影响，检测免疫正向相关因子IL-12、IFN-、IL-2和免疫抑制因子TGF-、IL-10和VEGF等的水平变化，阐明免疫治疗纳米药物与化疗纳米药物联合用药协同增效的机理；观察荷瘤小鼠的存活时间及瘤重变化，并进行肿瘤组织病理学分析，评价其对肝癌治疗效果的影响。 新型免疫治疗纳米药物对肝癌免疫炎症反应的调控研究研究新型免疫治疗纳米药物对肝癌组织中促炎因子（IL-1、IL-6、IL-17、IL-23、CCL2、TNF-、IFN-、iNOS和COX-2等）以及抑炎因子（IL-10、TGF-、PGE2和lipoxin A4等）的表达和（或）分布的影响；测定肝癌组织中调节炎症的转录因子（NF-B和AP-1等）的活性变化，揭示对肝癌免疫微环境中抑制性免疫细胞和因子的调节作用。（4） 新型纳米药物体内过程研究与生物安全性评价 新型纳米药物突破肝癌生理屏障的体内过程研究建立原位肝癌动物模型，研究新型纳米药物突破肝癌生理屏障的效果，包括新型纳米药物对肝癌组织血流动力学的改善作用及对纤维化样胞外基质的降解作用；研究新型纳米药物在模型动物肝癌内部的传输行为，包括纳米药物从肿瘤血管进入细胞间质的过程和纳米药物在肝癌细胞间质内的传输过程；考察新型纳米药物的理化特性对其在肝癌组织内部扩散和穿透的影响；研究辅助药物共输送技术、现代医疗技术（如射频治疗、超声技术等）联用等克服肝癌生理屏障的效果。 新型化疗纳米药物的药物动力学研究新型化疗纳米药物经静脉注射或介入栓塞治疗后，在动物水平上研究纳米药物载体和化疗药物在体内的分布、代谢和排泄过程，以及在组织的蓄积情况，评价其靶向肝癌组织的效果；从局部组织层次研究新型化疗纳米药物在肝癌组织中转运和释药的动力学过程，揭示其药物动力学特征；研究新型化疗纳米药物的理化特性对其整体和局部药物动力学行为的影响；在整体动物和局部组织层次上建立新型化疗纳米药物的动力学模型。 新型免疫治疗纳米药物的药物动力学研究新型免疫治疗纳米药物经静脉注射或介入栓塞治疗后，在动物水平研究纳米药物载体和免疫治疗药物在体内的分布、代谢和排泄过程，以及在组织的蓄积情况，评价其靶向肝癌组织的效果；从局部组织层次研究新型免疫治疗纳米药物在肝癌组织中转运和释药的动力学过程，揭示其药物动力学特征；研究新型免疫治疗纳米药物的理化特性对其整体和局部药物动力学行为的影响。 新型纳米药物的生物安全性评价在动物水平上开展新型化疗纳米药物和免疫治疗纳米药物的急性毒性、长期毒性和一般药理学等安全性研究，考察其在正常动物体内长期蓄积所产生的潜在毒性；研究新型纳米药物对各正常组织和器官的损伤作用，包括对正常肝功能和正常肝细胞的影响；在细胞水平上研究新型纳米药物对免疫系统的影响，以及其对机体的免疫毒性；评价新型纳米药物的组织相容性和血液相容性。二、预期目标1、总体目标 针对改善肝癌治疗效果亟待解决的关键科学问题，设计、合成新型功能化纳米材料，构建具有自主知识产权、安全、高效的新型纳米药物；在分子、细胞、组织和动物水平上系统揭示抗肝癌新型纳米药物突破肝癌生理屏障、靶向肝癌细胞、降低肝癌细胞耐药性、调控肝癌免疫微环境的机制；研究新型纳米药物的体内过程，评价其治疗肝癌的药效与生物安全性，发展具有降低肝癌细胞耐药性的新型化疗纳米药物和调控肝癌免疫微环境的新型免疫治疗纳米药物，并与现代医疗技术相结合，改善肝癌药物治疗效果。在新型纳米药物改善肝癌治疗现状的应用基础研究方面，取得一批重要的原创性成果；培养一批具有国际影响的学术带头人，提高我国纳米生物医药技术的国际竞争力。2、五年预期目标（1）突破性进展通过本项目的实施，将在纳米药物改善肝癌治疗效果的理论、材料、方法和技术等方面取得一系列突破性进展： 设计合成具有突破肝癌生理屏障、靶向肝癌细胞的新型纳米材料，为构建改善肝癌治疗效果的新型纳米药物奠定基础； 构建具有降低肝癌细胞耐药性的新型化疗纳米药物和调控肝癌免疫微环境的新型免疫治疗纳米药物，并与现代医疗技术相结合，在改善肝癌治疗效果上取得突破； 揭示新型纳米药物突破肝癌生理屏障、靶向肝癌细胞、降低肝癌细胞耐药性、调控肝癌免疫微环境的机制，在纳米技术改善肝癌治疗效果的理论上取得突破。（2）研究成果 获得用于构建抗肝癌新型纳米药物、具有自主知识产权的新型纳米材料10-15种；获得能突破肝癌生理屏障、靶向肝癌细胞、降低肝癌细胞耐药性、调控肝癌免疫微环境，且具有良好开发前景的纳米药物5-8种；改善5-8个候选药物对肝癌的治疗效果； 完成1-2个抗肝癌新型纳米药物的临床前研究，力争1个获得临床批件； 取得一批具有国际影响的原创性成果，在国际重要学术刊物，包括在Science或Nature系列期刊上发表高质量论文100篇以上；申请国内外发明专利20-30项； 培养一批有国际影响的中、青年学术带头人和学术骨干，培养硕士研究生40 - 50名、博士研究生30 - 40名和博士后10 - 15名。三、研究方案1、学术思路 针对肝癌药物治疗面临的肝癌生理屏障复杂、药物细胞选择性差、肝癌细胞多重耐药机制以及肝癌免疫抑制微环境等挑战，分别以肝癌异常血管和纤维化样胞外基质、肝癌细胞特征分子、耐药相关蛋白和胞内解毒系统及肝癌干细胞、抑制性免疫细胞和免疫抑制因子等为切入点，发展智能分子设计、纳米特性控制、靶向分子修饰和多成份共输送等纳米药物技术，在突破肝癌生理屏障、靶向肝癌细胞的基础上，构建降低肝癌细胞耐药性的新型化疗纳米药物和调控肝癌免疫微环境的免疫治疗纳米药物，并运用化疗纳米药物与免疫治疗纳米药物联用、纳米药物与现代医疗技术相结合等策略，实现改善肝癌药物治疗效果的目标。见图1。图1 项目的总体学术思路2、研究方案(1） 突破肝癌生理屏障新型纳米药物的构建与表征 新型纳米材料的设计、合成与表征采用活性/可控聚合、乳液聚合、点击（Click）化学等高分子合成和有机合成等方法，合成对肝癌组织和肝癌细胞特殊微环境具有刺激响应能力，且具有长循环与EPR效应的新型纳米材料，包括对热、pH、酶和氧化还原环境等快速响应或降解的两亲性嵌段聚合物、生物可降解纳米凝胶、脂质材料等，并进行化学组成和结构的鉴定及理化特性的表征。采用NMR、FT-IR和质谱（MALDI-TOF）等手段对上述合成的材料进行化学结构鉴定；采用GPC等方法测定高分子材料的分子量及其分布；采用动/静态光散射、小角X射线散射（SAXS）、冷冻透射电镜等手段对其粒径及分布、微观结构进行表征；通过扫描电镜（SEM）、透射电镜（TEM）等手段对这些纳米材料的微观形貌进行表征；采用DSC、微量热技术和偏光显微技术对其微观聚集行为进行表征；测定电导率、表面张力等，并计算临界胶束浓度和聚集数等参数；采用高级流变扩展系统测定相关材料的流体力学行为。 新型纳米药物的构建与表征采用微流控辅助乳化溶剂挥发法、自组织沉淀法、膜乳化法、Pickering乳化法等，负载不同化疗药物或候选药物、改变血流动力学特性或降低耐药性的辅助药物、以及免疫治疗药物，构建具有不同粒径、形貌和微观聚集结构的纳米药物，包括纳米凝胶聚集体、聚合物胶束、纳米脂质体、固体脂质纳米粒、聚合物纳米粒和纳米泡等；研究纳米载体的纳米特性和介质条件对纳米药物组装行为的影响；对纳米药物的内部结构进行表征；采用透析法、超速离心法等，结合HPLC-MS、ELISA法等研究纳米药物在不同介质条件下的释药行为与机制。 新型纳米药物靶向肝癌细胞的机制研究采用EDC偶联法、点击化学或纳米组装技术，将AFP受体单抗、iRGD多肽、Tf及其受体单链抗体等与上述相应的纳米药物载体进行化学偶联或物理组装；采用1H-NMR、13C-NMR、圆二色谱（CD）、微量热技术、石英微天平（QCM）和原子力显微镜（AFM）等技术研究靶向分子的种类及其偶联密度和生物活性；采用激光共聚焦显微镜、全内反显微镜观察以及流式细胞分析等手段研究肝癌细胞对靶向修饰纳米药物的特异性粘附和摄取的影响，阐明靶向分子种类、偶联特征等对纳米药物靶向肝癌细胞作用的影响规律。 新型纳米药物突破肝癌生理屏障的机制研究采用血管显影剂或血管栓塞剂灌注的方法，结合超薄切片和数字仿真技术等，获得真实肝癌血管网模型；并采用分形理论、渗透理论等研究肝癌血管网的空间拓扑结构和渗透特性，设计具有特定尺寸和结构、能模拟肿瘤血管的微装置；通过改变生物大分子凝胶网络的交联密度模拟正常肝组织、肝硬化组织和肝癌组织的胞外基质。通过显微观察追踪载有纳米磁球或荧光量子点等的纳米药物载体在模拟血管、生物大分子凝胶网络中的运动情况，实时监测凝胶网络的粘度变化；系统研究纳米药物的理化特性、凝胶网络性质、外界环境对纳米药物载体在模拟血管、模拟胞外基质中传输行为的影响；阐明外场调控下纳米药物传输及凝胶网络剪切变稀的关键影响因素和内在规律；揭示纳米药物有效穿越肝癌生理屏障的机制，并对纳米药物共输送技术、现代医疗技术如超声技术、射频消融技术（热效应）等与新型纳米药物联合应用克服肝癌生理屏障的效果进行体外评价。（2） 新型纳米药物降低肝癌细胞耐药性的机制和药效学研究 新型化疗纳米药物降低肝癌细胞耐药性的机制研究选择肝癌典型耐药细胞株，从细胞水平研究新型化疗纳米药物的组成、结构和理化特性与降低肝癌细胞耐药性之间的关系。采用MTT法考察新型化疗纳米药物对肝癌耐药细胞株细胞增殖的影响；通过形态学观察、DNA 损伤和修复能力检测、流式细胞分析等方法检测新型化疗纳米药物对肝癌耐药细胞凋亡、细胞周期的影响，并对现代医疗技术（超声、射频消融等）与新型化疗纳米药物联用降低肝癌细胞耐药性的效果进行评价。以肝癌耐药细胞及其建立的肝癌动物模型为对象，研究新型化疗纳米药物对耐药相关蛋白、胞内解毒系统和细胞凋亡信号转导等的影响。通过测定新型化疗纳米药物在肝癌耐药细胞和肝癌组织中的药物浓度、ATP酶活性、肿瘤耐药转运蛋白（P-gp、MRP、BCRP和LRP等）及编码基因的表达，阐明耐药相关蛋白与新型化疗纳米药物降低肝癌细胞耐药性的关系；通过测定肝癌耐药细胞及肝癌组织中GSH的含量及GST、P450酶的活性变化，揭示胞内解毒系统与新型化疗纳米药物降低肝癌细胞耐药性的关系；通过测定GSC的活性与肿瘤细胞凋亡相关蛋白（BCL-2，BCL-XL等）及编码基因的表达，阐明细胞凋亡信号转导与新型化疗纳米药物降低肝癌细胞耐药性的关系。 新型化疗纳米药物的胞内动力学过程研究以肝癌典型耐药细胞株（HepG2/Dox、SMMC-7721/Dox等）及相应的敏感细胞株为模型，采用激光共聚焦显微镜观察研究新型化疗纳米药物与肝癌耐药细胞和敏感细胞的结合/粘附能力；采用内吞特异性抑制剂及分子生物学手段干预特定的内吞途径，研究新型化疗纳米药物的细胞摄取机制；采用共聚焦显微镜观察及流式细胞仪实时检测新型纳米药物的入胞速度与程度，并使用荧光探针标记溶酶体、内质网、线粒体和细胞核等，实时监测新型化疗纳米药物进入细胞后的胞内分布情况，揭示新型化疗纳米药物的组成、结构和理化特性等对其进入肝癌耐药细胞和敏感细胞中的过程及胞内行为的影响及其与降低肝癌细胞耐药性之间的关系。 新型化疗纳米药物对肝癌干细胞的作用研究通过检测肝癌干细胞球囊形成率、克隆形成率、体内成瘤能力等，研究新型化疗纳米药物对肝癌干细胞自我更新及分化能力的作用；通过测定肝癌干细胞及其肝癌组织中干细胞相关基因的表达，揭示新型化疗纳米药物进入肝癌干细胞的能力对肝癌干细胞“干性”变化的影响；通过划痕试验、Matrigel transwell试验及体内研究等，揭示新型化疗纳米药物对肝癌干细胞从原发瘤解离，向周围侵润、迁移、生长繁殖和形成转移瘤等能力的影响，探讨新型化疗纳米药物通过杀伤或干扰肝癌干细胞的自我更新、分化来抑制肝癌转移与复发的效果。 新型化疗纳米药物降低肝癌细胞耐药性的体内药效学评价构建肝癌耐药细胞的原位肝癌模型和皮下植入模型，研究新型化疗纳米药物对模型动物的体重变化、肝功能、肿瘤生长抑制情况和生存期等的影响，从动物水平上评价新型化疗纳米药物降低肝癌细胞耐药性的效果，并对现代医疗技术（超声、射频消融、介入栓塞等）与新型化疗纳米药物联用降低肝癌细胞耐药性的效果进行评价。（3） 新型纳米药物调控肝癌免疫微环境的机制和药效学研究 新型免疫治疗纳米药物清除Treg等的机制研究 将小鼠肝癌细胞系H22肿瘤细胞直接注射入BALB/c小鼠肝组织，建立BALB/c小鼠原位肝癌模型，消化肝癌组织，采用免疫磁珠与流式细胞分离方法从肝癌组织中分选Treg等，通过检测其对CD3+ T细胞增殖的影响研究这些抑制性免疫细胞的免疫抑制功能，采用流式细胞术和免疫组化法分析Treg等的数量及在肝癌组织中的分布，探讨新型免疫治疗纳米药物对Treg等的清除作用；分别采用抗CD11c、CD3和CD56抗体从肝癌组织中分选DC、CTL和NK细胞，通过体外培养法分析DC的抗原提呈和CTL、NK细胞对肿瘤细胞的杀伤，多色流式细胞术分析DC、CTL和NK细胞的数量、流式细胞术检测CD80、CD86和MHCII表达以分析DC的成熟，检测IFN-活性来分析CTL、NK细胞功能，探讨抑制性免疫细胞的清除对肿瘤免疫细胞的影响；采用ELISA法检测TGF-、IL-10、VEGF、IL-12、IFN-和IL-2等的含量，荧光定量RT-PCR及免疫组化法检测这些免疫细胞因子的表达及在肝癌组织中的分布，探讨抑制性免疫细胞的清除对免疫细胞因子的影响。另外，观察荷瘤小鼠存活时间、肿瘤组织大小，结合肿瘤组织病理学分析手段，评价新型免疫治疗纳米药物的治疗效果。 新型免疫治疗纳米药物中和免疫抑制因子的机制研究 建立BALB/c小鼠原位肝癌模型，分别采用ELISA法、荧光定量RT-PCR及免疫组化法分析TGF-等的含量、表达及在肝癌组织中的分布，探讨新型免疫治疗纳米药物对这些免疫抑制因子的中和作用；采用流式细胞术和免疫组化分析Treg等的数量及其在肝癌组织中的分布，探讨免疫抑制因子的中和对抑制性免疫细胞的影响；采用多色流式细胞术分析DC、CTL和NK细胞的数量、DC的成熟及CTL、NK细胞功能，探讨免疫抑制因子的中和对肿瘤免疫细胞的影响；经中和免疫抑制因子TGF-等的免疫治疗纳米药物处理后，观察小鼠存活时间、肿瘤组织大小，结合肿瘤组织病理学分析手段，研究新型免疫治疗纳米药物对肝癌治疗效果的影响。 新型免疫治疗纳米药物和化疗纳米药物协同增效的机制研究建立BALB/c小鼠原位肝癌模型，采用上述针对抑制性免疫细胞和免疫抑制因子的新型免疫治疗纳米药物与化疗纳米药物序贯联合治疗，研究其对肝癌的协同增效作用。采用流式细胞术和免疫组化法分析Treg等的数量及其在肝癌组织中的分布，多色流式细胞术分析DC、CTL和NK细胞的数量、DC的成熟及CTL、NK细胞功能，探讨免疫治疗纳米药物和化疗纳米药物联用对抑制性免疫细胞和肿瘤免疫细胞的影响；采用ELISA法检测上清中TGF-、IL-10、VEGF、IL-12、IFN-和IL-2等的含量，探讨免疫治疗纳米药物和化疗纳米药物联用对免疫正向相关因子和免疫抑制因子的影响；探讨现代医疗技术（超声、射频消融和介入栓塞等）与新型免疫治疗纳米药物联用对肝癌治疗效果的影响。 新型纳米药物对肝癌免疫炎症反应的调控研究建立BALB/c小鼠原位肝癌模型，经新型纳米药物处理后，采用ELISA、RT-PCR和Western blot分析肝癌组织中炎症相关因子IL-1、IL-6、IL-17、IL-23、CCL2、TNF-、IFN-、iNOS、COX-2、IL-10和TGF-等的含量和表达，化学发光法及Western blot检测转录因子NF-B的p65和p50、AP-1的c-jun和c-fos的活性及表达，探讨新型纳米药物的组成、结构和理化特性对肝癌组织中促炎因子及抑炎因子的影响，进一步采用基因芯片揭示肝癌免疫微环境、炎症反应模式的变化规律。（4） 新型纳米药物体内过程研究与生物安全性评价 新型纳米药物突破肝癌生理屏障的体内过程研究分别测定透明质酸、胶原或葡萄糖胺聚糖等胞外基质成分在肿瘤组织中的含量，评价新型纳米药物对纤维化样胞外基质的破坏作用；测定肿瘤血管中的血流速率，考察新型纳米药物对血流动力学行为的影响；对纳米药物进行荧光标记，建立光漂白荧光恢复技术测定新型纳米药物在肝癌血管和肿瘤细胞间质的移动速度；建立激光共聚焦技术结合MATLAB分析，测定新型纳米药物在肝癌微环境的传输距离；采用上述方法研究新型化疗纳米药物的理化特性（如粒径、电荷、形貌和靶向修饰等）对其在肝癌微环境的运动速度和传输距离的影响，并对纳米药物共输送技术、现代医疗技术（超声、介入栓塞等）与新型纳米药物联用克服肝癌生理屏障的效果进行评价。 新型化疗纳米药物的药物动力学研究采用荧光标记或同位素标记技术对新型纳米药物进行标记，测定纳米药物载体在不同时间、不同器官和组织中的浓度；建立生物样本中不同形式化疗药物（游离药物、血浆蛋白结合药物和被包裹药物）浓度的测定方法，研究纳米载体和化疗药物在动物体内的分布、转运和排泄等动力学过程，计算化疗药物在不同组织的药时曲线下面积（AUC），评价新型化疗纳米药物的肝靶向效率。采用上述方法研究新型化疗纳米药物的理化特性对其体内过程的影响，阐明化疗纳米药物的理化特性与体内过程的相关性。通过对几个基元过程进行研究，用能够反映离散与随机特征的数学方法评价新型纳米药物静注后在模型动物上的动力学行为。建立活体荧光显微定量技术，定量测定新型纳米药物经静脉注射或介入栓塞治疗后在肝癌血管和胞外基质的分布，研究纳米药物在肿瘤血管、肿瘤间质和肝癌细胞转运的动力学行为；用微透析技术结合HPLC/LC-MS等分析方法研究新型化疗纳米药物在肝癌组织中的释药行为。按照上述方法研究新型化疗纳米药物的理化特性对其在肝癌组织中转运与释药过程的影响。根据原位肝癌的病理特征，在模型中引入药物释放常数、血流速率或细胞间质压力等参数，建立新型化疗纳米药物在模型动物肝癌组织中的动力学模型，阐明化疗药物浓度与上述参数之间的相关性。 新型免疫治疗纳米药物的药物动力学研究建立用于免疫治疗药物的生物样本预处理方法和药物浓度测定的免疫分析方法（ELISA）或色谱分析法，从动物水平研究免疫治疗纳米药物在模型动物体内分布、转运和排泄的动力学过程；在局部组织水平研究免疫治疗纳米药物在肝癌组织中转运的动力学过程和释药行为；考察新型免疫治疗纳米药物的理化特性对其整体和局部组织药物动力学行为的影响，阐明免疫治疗纳米药物的理化特性与其体内过程的相关性。 新型纳米药物的生物安全性评价对新型纳米药物及相关纳米载体，采用毒理学的方法，在动物（如小鼠、大鼠、兔和犬等）水平上进行包括急性毒性、长期毒性和一般药理学等安全性研究；采用形态观察如组织病理切片和生化检测等方法，考察其对分布较多的组织或器官（如淋巴组织、血液和骨髓等）和重要器官（如心、肝、脾、肺和肾等）的形态和功能的影响；采用NMR代谢组学技术对各组织器官损伤的标志物进行分析，对新型纳米药物是否存在潜在毒性进行评价。通过测定P450、细胞色素b5及参与药物代谢的主要亚型酶的活性，研究新型纳米药物及相关纳米载体对肝药酶活性的影响；通过细胞生物学和分子生物学手段，研究新型纳米药物对正常肝细胞形态、活性和功能的影响；通过测定免疫器官（如胸腺及脾）重量以及免疫细胞、免疫相关蛋白在外周血中数量的变化，研究新型纳米药物对免疫系统的影响；采用PFC法等手段开展体液免疫检测，研究体内特异性抗体产生、特异性T细胞反应等；采用荧光分光光度计和荧光显微镜分析巨噬细胞吞噬等特性，研究新型纳米药物对吞噬细胞吞噬功能影响。通过血小板血栓生成、溶血和白细胞减少等细胞水平反应、凝血系统、纤溶系统激活等血浆蛋白水平反应研究新型纳米药物的血液相容性；参照国家标准（GB/T 16886 系列）对新型纳米药物的组织相容性进行评价。3、技术途径 本项目以改善肝癌药物治疗效果为目标，将采用多学科交叉、相互渗透和有机结合的模式，以新型纳米药物突破肝癌生理屏障、靶向肝癌细胞、降低肝癌细胞耐药性和调控肝癌免疫微环境为主要研究内容，在设计、合成突破肝癌生理屏障的新型靶向功能性纳米材料基础上，构建降低肝癌细胞耐药性和调控肝癌免疫微环境的新型纳米药物；利用先进的纳米表征技术和体内外检测手段，系统研究新型纳米药物的组成成份、组装机制、结构特性和理化特性等对突破肝癌生理屏障、靶向肝癌细胞、降低肝癌细胞耐药性和调控肝癌免疫微环境的作用机制，为揭示纳米药物改善肝癌药物治疗效果提供研究方法和理论依据，具体技术途径见图 2。突破肝癌生理屏障新型纳米药物的构建与表征新型纳米材料的设计、合成与表征新型纳米药物的构建与表征突破肝癌生理屏障的机制研究新型纳米药物降低肝癌细胞耐药性的机制和药效学研究突破肝癌生理屏障的体内过程研究化疗纳米药物的药物动力学研究生物安全性评价新型纳米药物体内过程研究与生物安全性评价肝癌治疗的新型纳米药物研究新型纳米药物调控肝癌免疫微环境的机制和药效学研究机理研究降低肝癌细胞耐药性的机制研究对肝癌干细胞的作用研究胞内动力学过程研究降低肝癌细胞耐药性的体内药效学评价清除抑制性免疫细胞的机制研究中和免疫抑制因子的机制研究免疫治疗和化疗协同增效的机制研究对肝癌免疫炎症反应的调控研究免疫治疗纳米药物药物动力学研究靶向肝癌细胞的机制研究图2 肝癌治疗新型纳米药物研究的技术途径4、项目的创新性 本项目针对突破肝癌生理屏障和靶向肝癌细胞、降低肝癌细胞耐药性、调控肝癌免疫微环境的关键科学问题，在学术思路、材料、技术、纳米药物等方面具有显著创新性：（1）新思路 为改善肝癌药物治疗效果，提出新型纳米药物构建“需先突破肝癌生理屏障、靶向肝癌细胞，然后再降低肝癌细胞耐药性、调控肝癌免疫微环境”的新思路。（2）新材料 通过智能分子设计、纳米特性控制、靶向分子修饰等手段，合成一系列用于构建抗肝癌新型纳米药物且生物安全的新型纳米材料。（3）新技术 发展控制纳米特性的纳米组装技术、多种作用机制药物的共输送技术、化疗纳米药物与免疫治疗纳米药物联用、纳米药物与现代医疗技术相结合等新技术。（4）新药物 采用设计的新型纳米材料，在突破肝癌生理屏障、靶向肝癌细胞的基础上，构建具有改善肝癌治疗效果的新型纳米药物，如降低肝癌细胞耐药性的新型化疗纳米药物和调控肝癌免疫微环境的新型免疫治疗纳米药物等。5、项目的特色 （1）社会意义大 针对肝癌这一严重危害我国人民生命健康的重大疾病，利用纳米药物技术的集成创新，发展突破肝癌生理屏障、靶向肝癌细胞、降低肝癌细胞耐药性、调控肝癌免疫微环境的新技术、新方法，力争在改善肝癌药物治疗效果方面取得突破，社会意义重大。（2）多技术联用 针对肝癌发生、发展的复杂性，发展控制纳米特性的纳米组装技术、多种不同作用机制药物的共输送技术、化疗纳米药物与免疫治疗纳米药物联用、纳米药物与现代医疗技术相结合等新技术，改善肝癌药物治疗效果。（3）多学科交叉 以项目组的前期研究为基础，整合相关领域的优势力量，形成“从功能性纳米材料设计合成、新型纳米药物构建、体内过程研究到改善肝癌治疗效果与生物安全性评价”的完整研究技术链，促进多学科交叉与集成，建立和发展基于纳米技术改善肝癌治疗效果研究的新模式，聚焦项目总体目标，改善肝癌的治疗效果。（4）强强联合 研究队伍由项目所需学科领域的国内主要优势单位组成，成员单位已在相关领域进行了长期研究，积累了丰富的经验，并取得了一系列优秀成果。我们的科研队伍具有较强的临床研究和实践经验，为基础研究成果向临床应用转化奠定基础。研究队伍强强联手，将各自的优势聚焦于突破肝癌生理屏障、靶向肝癌细胞、降低肝癌细胞耐药性和调控肝癌免疫抑制微环境等关键科学问题，可望在改善肝癌治疗效果方面获得突破性的创新成果。6、取得重大突破的可行性分析 （1）目标明确、内容具体 设计自主创新的功能性纳米材料，构建具有自主知识产权、高效、安全的抗肝癌新型纳米药物，通过在分子、细胞、组织和动物水平上对新型纳米药物突破肝癌生理屏障、靶向肝癌细胞、降低肝癌细胞耐药性、调控肝癌免疫微环境的作用机制以及体内过程和生物安全性进行系统研究，实现改善肝癌治疗效果的目标。项目的主要研究内容是在前期研究基础上，结合本领域的最新发展和国家需求，对前期工作的提炼、深化、延伸和发展。研究内容具体，研究目标明确，不仅结合了项目组成员前期的研究积累，也包含项目组成员的原创性研究思想。（2）基础扎实、硬件一流 项目组成员在纳米材料的设计、新型纳米药物的构建及其降低肝癌细胞耐药性、调控肝癌免疫微环境作用的机理、体内过程和生物安全性研究等方面已有丰富的积累，在国内外一流学术期刊上发表了多篇与本项目研究工作密切相关的论文，并有多个相关纳米药物研制及临床实践的宝贵经验，取得了一批重要的前期成果，在国内外产生了一定的影响。这些前期研究成果为本项目的实施奠定了良好的研究工作基础。项目承担单位拥有多个相关国家实验室、国家重点实验室、国家工程中心或省部级重点实验室的一流硬件设施与药物研究技术平台，包括用于纳米材料合成与表征、新型纳米药物构建与表征的各类先进仪器，开展突破肝癌生理屏障、靶向肝癌细胞、降低肝癌细胞耐药性、调控肝癌免疫微环境的机制、体内过程与生物安全性研究等的各类设施，为本项目的顺利完成提供了强有力的保障。 （3）优势团队、一流人才 项目集中了一批具有纳米科学、临床医学、材料学、化学、药理学、毒理学、肿瘤学、免疫学、分子生物学等研究领域的优秀人才，他们具有较高的学术水平和强烈的进取精神。项目组成员均来自我国重要的相关研究机构和国家或省部级重点实验室/工程技术中心，在纳米材料合成、新型纳米药物设计和构建、肿瘤治疗与生物安全性研究方面积累了丰富经验，取得过优异的成绩，得到了国际同行的认可。项目组在前期的研究中积累了丰富的合作经验，形成了一支优势互补的科研团队，已成为我国纳米生物医学创新研究的优秀研究群体，为本项目的实施和完成提供了强大的人力资源。7、组织方式 （1）在组织上强调体系化，瞄准项目总目标，追求可持续发展。组织管理和运作体制分项目和课题两个层次。项目设首席科学家1人，实行项目首席科学家负责制，由项目首席科学家负责组织、管理、监督和协调整个项目的实施。首席科学家聘任若干专家组成项目专家组，参与项目的组织、运行、领导和管理，协助首席科学家审核和确定项目的学术思想、技术路线及研究计划，指导协调各课题的工作，督促并考核各课题的进展情况。项目专家组由相关学科领域成就卓著的专家组成，承担单位之外的专家将占较大比例。（2）在项目实施过程中，注重多项技术的集成整合、技术平台和信息资源共享、人才队伍交叉融合。在充分发挥项目各承担单位的学科优势和关键技术研究实力的基础上，强调优势力量的整合和协同攻关，克服“各自为战”的做法，形成功能配套、布局合理、机制灵活的创新体系，将项目实施的一体化运行机制落到实处。8、课题设置根据项目的总体目标和拟解决的关键科学问题，以发展新型纳米药物改善肝癌治疗效果为核心，精心选择突破点，设置如下四个课题：课题一 突破肝癌生理屏障新型纳米药物的构建与表征课题二 新型纳米药物降低肝癌细胞耐药性的机制和药效学研究课题三 新型纳米药物调控肝癌免疫微环境的机制和药效学研究课题四 新型纳米药物体内过程研究与生物安全性评价各课题间的相互关系见图3。图3 四个课题间的相互关系课题一 针对突破肝癌生理屏障和靶向肝癌细胞的需要，设计、合成新的功能性纳米材料，并在此基础上构建具有降低肝癌细胞耐药性、调控肝癌免疫微环境的新型纳米药物，为降低肝癌细胞耐药性的机制和药效学研究（课题二）、调控肝癌免疫微环境的机制和药效学研究（课题三）、体内过程研究与生物安全性评价（课题四）提供材料和物质保障。课题二 在分子、细胞、组织和动物水平上对课题一提供的新型纳米药物降低肝癌细胞耐药性的机制与药效开展研究，并将信息反馈给课题一，为课题一对功能性纳米材料的改进和新型纳米药物的进一步优化提供实验依据，也为课题四的研究提供理论和实验依据。课题三 在分子、细胞、组织和动物水平上对课题一提供的新型纳米药物调控肝癌免疫微环境的机制与药效开展研究，并将信息反馈给课题一，为课题一对新型纳米药物和相关功能性纳米材料的进一步优化提供实验依据，也为课题四的研究提供理论和实验依据。课题四 应用课题一、课题二和课题三提供的新型纳米药物和降低肝癌细胞耐药性与调控肝癌免疫微环境机制的研究成果，进行新型纳米药物及相关纳米材料的体内过程研究和生物安全性评价，同时将信息反馈给课题一、课题二和课题三，为新型纳米药物及相关纳米材料的进一步优化，降低肝癌细胞耐药性与调控肝癌免疫微环境的药效及其机制的进一步研究提供依据。通过课题二、课题三和课题四对课题一提供的新型纳米药物研究和信息反馈，对新型纳米药物及相关纳米材料进行优化，并再经课题二、课题三和课题四的循环研究，直至构建出安全、可控的新型纳米药物，实现改善肝癌治疗效果的最终目标。课题一：突破肝癌生理屏障新型纳米药物的构建与表征研究目标： （1）获得用于构建抗肝癌新型纳米药物、具有自主知识产权的新型纳米材料10-15种；（2）获得突破肝癌生理屏障、靶向肝癌细胞、降低肝癌细胞耐药性、调控肝癌免疫微环境，且具有良好应用开发前景的纳米药物5-8种；（3）取得一批原创性成果，发表高质量论文25篇以上，申请专利8-10项；（4）培养硕士研究生10-15名、博士研究生8-10名和博士后3-5名。研究内容：（1）根据突破肝癌生理屏障的需要，采用有机化学、高分子化学、超分子化学以及生物材料学等的方法和原理，设计、合成具有长循环与EPR效应的相关新型纳米材料，主要包括对肿瘤组织或肿瘤细胞微环境快速响应或降解的两亲性嵌段聚合物、生物可降解纳米凝胶、脂质材料等，使其对特定刺激（如热、pH、酶和氧化还原性等）快速响应，进行化学组成、结构及理化特性的表征。（2）为提高上述纳米材料突破肝癌生理屏障、降低肝癌细胞耐药性和调控肝癌免疫微环境的性能，运用先进的组装技术（分子/粒子自组装、外场诱导组装等），构建多种新型纳米药物载体（包括纳米凝胶聚集体、聚合物胶束、纳米脂质体、固体脂质纳米粒、聚合物纳米粒和纳米泡等），并负载不同作用机制的药物，在突破生理屏障基础上，发展降低耐药性的新型化疗纳米药物和调控肝癌免疫微环境的免疫治疗纳米药物，并研究其理化特性及释药行为。（3）为提高纳米药物对肝癌组织与细胞的选择性，偶联肝癌细胞靶向分子，构建靶向纳米药物，研究靶向分子种类及其偶联密度和生物活性等对肝癌细胞特异性粘附、摄取的影响和规律。（4）建立体外肝癌血流模型，模拟肝癌组织细胞外基质，探讨纳米药物理化特性、辅助药物等对纳米药物在其中的扩散、传输行为的影响；研究现代医疗技术对纳米药物突破肝癌生理屏障的作用。经费比例：27%承担单位：华中科技大学课题负责人：杨祥良学术骨干：万江陵、赵彦兵、张志平、杨亚江、张志伟课题二：新型纳米药物降低肝癌细胞耐药性的机制和药效学研究研究目标： （1）建立新型化疗纳米药物降低肝癌细胞耐药性的研究方法；（2）发展3-5个降低肝癌细胞耐药性的化疗纳米药物，提高5-8个候选药物对肝癌的治疗效果；（3）取得一批原创性成果，发表高质量论文25篇以上，申请专利8-10项；（4）培养硕士研究生10-15名、博士研究生8-10名和博士后3-5名。研究内容：（1）研究新型纳米药物对肝癌耐药细胞的增殖、凋亡和细胞周期等的影响，揭示纳米药物的组成、结构和理化特性对肝癌耐药细胞药物外排系统、细胞解毒系统、信号转导等的影响；研究现代医疗技术增强纳米药物降低肝癌细胞耐药性的作用及机制。（2）研究新型纳米药物与肝癌敏感细胞、耐药细胞的结合/粘附、摄取、胞内滞留及转运等过程与经时变化规律，研究其入胞速度与程度、胞内分布与动力学过程，揭示新型纳米药物的组成、结构和理化特性对其入胞过程及胞内行为的影响，阐明其与降低肝癌细胞耐药性之间的关系。（3）研究纳米药物的组成、结构和理化特性对肝癌干细胞自我更新、分化、成瘤能力的影响；建立肝癌动物模型，研究经新型纳米药物治疗后肝癌组织中癌干细胞的比例和“干性”。（4）选用耐药肝癌细胞建立动物模型，从动物水平上评价新型纳米药物降低肝癌细胞耐药性的效果，及与现代医疗技术相结合的作用。经费比例： 26%承担单位： 中国科学院上海药物研究所、中国科学技术大学课题负责人：缪泽鸿学术骨干：林莉萍、刘扬中、高瑜、汪铭课题三：新型纳米药物调控肝癌免疫微环境的机制和药效学研究研究目标： （1）建立新型免疫治疗纳米药物调控肝癌免疫微环境的研究方法；（2）发展2-3个免疫治疗纳米药物，筛选出具有协同效应的化疗纳米药物与免疫治疗纳米药物联用的方案；（3）取得一批原创性成果，发表高质量论文25篇以上，申请专利8-10项；（4）培养硕士研究生10-15名、博士研究生8-10名和博士后3-5名。研究内容：（1）研究新型免疫治疗纳米药物对模型小鼠肝癌组织中的抑制性免疫细胞Treg等的清除作用及机理；研究新型纳米药物的组成、纳米特性等对清除作用的影响；阐明抑制性免疫细胞的清除对肝癌组织中其它免疫细胞和抑制性免疫因子的作用，评价其治疗效果。（2）研究新型免疫治疗纳米药物对模型小鼠肝癌组织中的免疫抑制因子TGF-等含量、表达和分布的影响，阐明新型纳米药物的组成、纳米特性等对其中和作用的影响规律；揭示免疫抑制因子的中和对肝癌组织中不同免疫细胞类群的作用，评价其治疗效果。（3）研究上述针对细胞和分子的多靶点免疫治疗纳米药物与前述化疗纳米药物不同给药顺序和组合，对小鼠肝癌的治疗效果；阐明肝癌组织不同免疫细胞类群、免疫因子的变化规律；揭示免疫治疗纳米药物和化疗纳米药物协同增效机理。（4）研究新型纳米药物的化学组成和纳米特性等对肝癌组织中多种促炎因子以及抑炎因子等的表达和分布的影响；分析癌组织中调节炎症的转录因子NF-B和AP-1等的活性；研究对肝癌免疫微环境中抑制性免疫细胞和因子的调节作用；评价新型纳米药物免疫炎症反应模式对肝癌治疗效果的影响。经费比例：22%承担单位：天津医科大学、华中科技大学课题负责人：杨德学术骨干：黄波、尹海芳、李强、张荣信课题四：新型纳米药物体内过程研究与生物安全性评价研究目标：（1）建立新型纳米药物体内过程研究与生物安全性评价的研究方法；（2）完成12个抗肝癌新型纳米药物的临床前