RNA 提取细节-赞.docx

内容来自网络，主要是dxy另外，提示下下，TRIzol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。其实酚有水饱和酚和tris饱和酚，它们的pH值是不同的。前者pH值7，用于DNA的提取。楼主注意一下苹果棉花等多酚类植物提取RNA用TRIZOL一般提不出来我这个方法是验证过有效的,提取的RNA纯度不是特别高,但是用作northern是足够的了,和广大战友分享下多酚类植物的RNA提取11.5ml离心管用液N2冷冻吼加入0.1g样品,立即加入500ul酚氯仿,再加入500ul提取buffer,剧烈振荡1-2min,冰上放置5min.24度12000rpm离心15min, 上清转入新管,加氯仿异戊醇抽提一次3取600ul异丙醇,-20度沉淀20min.412000rpm离心10min5沉淀用70度乙醇洗68000rpm 5min7沉淀晾干,溶于30ulDEPC水附提取buffer 200mlNaCl 1.1688g 100mMTris 2.4228g 10mM (tris-HCl 8.0)EDTA 5.8450g 10mMSDS 2.0000g 1%NaOH调至8.0,定至200ml,加200ulDEPC融解.值大于 1.8（DNA）或者 2.0（RNA）。如果比值低于 1.8 或者2.0，表示存在蛋白质或者酚类物质的影响。A 230 表示样品中存在一些污染物，如碳水化合物，多肽，苯酚等，较纯净的核酸 A 260 / A 230 的比值大于 2.0。A 320 检测溶液的混浊度和其他干扰因子。纯样品，A 320 一般是 0。（320差不多也就是那条曲线刚下降到0的时候）。所以，当我们检测260/280后，如果比值在1.8-2.0之间时，我们可以说其纯度可以，那OD260的值就有效。否则，OD260的值判为无在论坛里混了很长时间，得到了很多帮助，特别是 上海孤儿 的无私奉献更让我感动。所以决定办一个RNA抽提细节的系列交流。为什么只谈细节呢？因为原理书上都有。当然这个系列主要是针对刚涉及RNA抽提的新手，老手免看，_。今天是第一讲：RNase真的很顽固吗？刚涉及RNA抽提的新手都会听到别人说RNase很顽固，用高压灭菌都无法去除其活性。于是在配制tris缓冲液时就遇到了两难的境地。tris缓冲液不能用DEPC处理，只能用DEPC处理过的水配制，那么在药品称量、调pH值等过程中tris缓冲液会造到RNase的再次污染，所以是一个两难的境地。但是今天我要谈的是RNase并不顽固，高压灭菌可以去除其大量活性。下面的实验照片（照片来自ambion）很清楚的显示了高压灭菌的效果。实验很简单，将不同含量的RNase用高压灭菌处理，然后与未高压灭菌处理的RNase一起来降解RNA（37度1小时），结果表明，当RNase的污染量小于100ng/ml时，高压灭菌可以去除其活性。这张照片还说明了一个问题，当你的RNA溶液中含有很微量的RNase污染时，不用过于担心，因为RNase对RNA的降解是需要时间的，更何况你的RNA是存放在低温下的。讲得不好，请大家拍砖，但不要打脸哦，_0DEPC有致癌性，不能处理Tris溶液等这些事项大家都知道，所以不谈。谈一些实验室中的操作误区。误区一：重复使用含DEPC的水处理枪头、离心管等。由于DEPC较贵，而且书上说DEPC要用高压灭菌处理去除，于是有些人就萌发了重复使用DEPC的想法，即对含有DEPC的水不进行高压灭菌，从而重复使用含DEPC的水处理枪头、离心管等。节约本是好事，但这样的节约是无效的。为什么不能重复使用含DEPC的水，因为DEPC在水溶液中不稳定，极易分解，DEPC在pH6.0和pH7.0的PBS缓冲液中的半衰期分别约为20min和10min，DEPC在水中的半衰期约为30min。因此，重复使用含DEPC的水就不能保证枪头和离心管的RNase-free。误区二：必需长时间高压灭菌来彻底去除DEPC。用DEPC处理过的溶液，在1520min的高压灭菌后还可以闻到一股特殊的香味，因此有人认为高压灭菌去除DEPC不彻底，所以要延长高压灭菌的时间以完全去除DEPC。但是延长高压灭菌的时间并不需要，因为闻到的特殊香味不是DEPC的，而是DEPC分解产物之一的乙醇同溶液中残留的微量的羧酸（如甲酸和乙酸等）反应产生的挥发性脂类。这种特殊的水果香味不代表有痕量的DEPC残留。误区三：溶液中DEPC含量约高，灭活RNase的效果越好。这个误区错了一半，的确，1% DEPC能灭活高达1000 ng/ml的RNase A，而0.1% DEPC只能灭活少于500 ng/ml的RNase A。但是溶液中残留的DEPC副产物会抑制一些酶反应，例如DEPC副产物会抑制体外转录反应，因此DEPC含量越高，高压灭菌后的DEPC副产物就越多，抑制越明显。讲得不好，请大家批评，但不要扔臭鸡蛋哦，_少的文献都说，用LiCl 沉淀RNA有很多好处，比如只沉淀RNA，不会沉淀DNA、蛋白和多糖等。但就是操作比较麻烦，比如，过夜沉淀，不能沉淀小分子RNA等。下面就LiCl 沉淀方法的误区进行探讨。误区一：LiCl 不能沉淀小分子RNA。很多文献都说LiCl 沉淀的RNA不含小分子的5s rRNA和tRNA。但，事实是这样吗？至少在我的实验中发现LiCl 可以沉淀小分子RNA。下面的图片更能说明LiCl 可以沉淀小分子RNA。泳道1是RNA maker，泳道2、3、4是用LiCl 沉淀的RNA。当然LiCl 沉淀tRNA的效果真的不好，其原因可能是tRNA的高度二级结构。误区二：LiCl 沉淀需要长时间和低温。不少文献上说LiCl 沉淀需要4度、20度、甚至80度下放置1小时、2小时、甚至过夜，其操作极其繁杂。但是，LiCl 沉淀真的需要长时间和低温吗？让我们来看看下面的数据：Lane 1, RNA marker.Lane 2, RNA centrifutged immediately without chilling.Lane 3, RNA chilled at -20C for 30 minutes before centrifugation.Lane 4, RNA incubated at 25C for 30 minutes to test precipitation time independently of chilling.Lane 5, RNA chilled at -20C for 1 hour.Lane 6, RNA incubated at 25C for 1 hour.图片显示放置30min后，RNA沉淀比不放置更有效（请比较泳道2和3），但是比较泳道3、4、5、6后，你会发现在20度下沉淀与在25度下沉淀没有区别，放置30min与放置1小时沉淀没有区别。但是建议大家用 -20C 30 minutes 的沉淀方法，因为低温能降低RNases的活性（假设有痕量的RNase残留）小提示：任何事务有利便有弊，LiCl 沉淀与乙醇沉淀相比，它的沉淀效率稍低。数据显示2.5M的LiCl 的平均沉淀率是74，而乙醇则是85。通俗的说乙醇沉淀可以得到更多的RNATRIzol试剂适用于从细胞和组织中快速分离RNA。TRIzol试剂有多组分分离作用,与其他方法如硫氰酸胍/酚法、酚/SDS法、盐酸胍法、硫氰酸胍法等相比，最大特点是可同时分离一个样品的RNADNA蛋白质TRIzol使样品匀浆化，细胞裂解，溶解细胞内含物，同时因含有RNase抑制剂可保持RNA的完整性。在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，RNA在水相中。取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA；用乙醇沉淀中间层可回收DNA；用异丙醇沉淀有机相可回收蛋白质。TRIzol试剂可用于小量样品（50-100mg组织、5106细胞）也适用于大量样品（1g组织、107细胞）。对人，动物，植物组织，细菌均适用，可同时处理大量不同样品，整个提取过程在一小时内即可完成。分离的总RNA无蛋白质和DNA污染，可用于Northern Blot，dot blot，ployA筛选，体外翻译，RNase保护分析和分子克隆。在用于RT-PCR时如果两条引物存在于一个单一外显子内，建议用无RNase的DNase处理RNA样品，避免出现假阳性。共纯化的DNA可用作标准，比较不同样品RNA的得率，也可用于PCR和酶切。蛋白质可用于Western Blotting。规格：100ml 黄色透明液体储存条件：2-8避光保存12个月注意：请勿直接接触皮肤或吞咽，以免灼伤。如接触皮肤应立即用洗涤剂和大量水冲洗。忌用乙醇擦洗，乙醇会加重灼伤程度。预防RNase污染注意事项：1.经常更换新手套，皮肤上常带有的细菌，霉菌可能成为RNase的来源。2.使用灭过菌的RNA专用塑料制品避免交叉污染。3.RNA在TRIzol试剂中时不会被RNase污染，但提取后继续处理过程中应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150烘烤4小时，塑料制品可在0.5M NaOH中浸泡10分钟，然后用水彻底清洗，高压灭菌，即可去除RNase。4.配制溶液应使用无RNase的水（将水加入处理过不含RNase的玻璃瓶中，加入DEPC至终浓度0.01v/v,放置过夜,高压灭菌。注：DEPC有致癌之嫌，需小心操作。）RNA的提取准备试剂：氯仿，异丙醇，75乙醇，无RNase的水或0.5SDS(溶液均需用DEPC处理过的水配制)操作步骤:1. 匀浆处理:a.组织 将组织在液氮中磨碎,每50-100mg组织加入1ml TRIzol,用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10。b.单层培养细胞 直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞，每10cm2面积(即3.5cm直径的培养板)加1ml，用移液器吸打几次。TRIzol的用量应根据培养板面积而定，不取决于细胞数。TRIzol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。c细胞悬液 离心收集细胞，每5-10106动物、植物、酵母细胞或1107细菌细胞加入1ml TRIzol，反复吸打。加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。2将匀浆样品在室温（15-30）放置5分钟，使核酸蛋白复合物完全分离。3可选步骤：如样品中含有较多蛋白质，脂肪，多糖或胞外物质（肌肉，植物结节部分等）可于2-810000g离心10分钟，取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。处理脂肪组织时，上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟。6. 2-810000g离心15分钟。样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60。7. 把水相转移到新管中，如要分离DNA和蛋白质可保留有机相，进一步操作见后。用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml异丙醇，室温放置10分钟。8. 2-810000g离心10分钟，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。9. 用75乙醇洗涤RNA沉淀。每使用1ml TRIzol至少加1ml 75乙醇。2-8不超过7500g离心5分钟，弃上清。10.室温放置干燥或真空抽干RNA沉淀，大约晾5-10分钟即可.不要真空离心干燥，过于干燥会导致RNA的溶解性大大降低。加入25-200l无RNase的水或0.5SDS,用枪头吸打几次,55-60放置10分钟使RNA溶解.如RNA用于酶切反应,勿使用SDS溶液。RNA也可用100的去离子甲酰胺溶解，-70保存。注意事项：1.从少量样品（1-10mg组织或102-104细胞）中提取RNA时可加入少许糖原以促进RNA沉淀。例如加800ml TRIzol匀浆样品，沉淀RNA前加5-10g RNase-free糖原。糖原会与RNA一同沉淀出来，糖原浓度不高于4mg/ml是不影响第一链的合成，也不影响PCR反应。2匀浆后加氯仿之前样品可以在-60至-70保存至少一个月。RNA沉淀可以保存于75% 酒精中2-8一星期以上或-5至-20一年以上。3分层和RNA沉淀时也可使用台式离心机，2600g离心30-60分钟。预期产量：1mg组织或1106细胞提取RNA分别为：肝和脾6-10g ,肾3-4g ,骨骼肌和脑组织1-1.5g ,胎盘1-4g ,上皮细胞8-15g ,成纤维细胞5-7g 。常见问题分析：得率低：A.样品裂解或匀浆处理不彻底BRNA沉淀未完全溶解A260/A28012000g离心10分钟除去。DNA的定量：取一份溶于8mM NaOH的DNA加水测A260值。一单位A260值相当于50g/ml双链DNA。根据DNA产量可估计细胞数，人，大鼠，小鼠1106二倍体细胞含DNA的量分别为7.1g , 6.5g , 5.8g 。预期产量：1mg组织或1106细胞提取DNA分别为肝和肾3-4g 骨骼肌，脑组织，胎盘2-3g 人，大鼠，小鼠培养细胞（1106）5-7g 成纤维细胞5-7g应用：1.用于PCR 溶于8mM NaOH的DNA用0.1M HEPES调pH至8.4,取0.1-1g DNA用作模板。2.酶切反应 用HEPES或1mM EDTA调节pH至适当值。每g DNA使用3-5单位的酶，80-90%的DNA是可消化的。1ml 8mM NaOH溶解的DNA样品pH值调节Final pH 0.1M HEPES(l) Final pH 1M HEPES(l)8.4 86 7.2 238.2 93 7.0 328.0 1017.8 1177.5 159注意事项：1. DNA在中间层和有机相中时可在2-8保存过夜。2DNA沉淀在75%乙醇中2-8可保存几个月。3DNA在8mM NaOH溶液中4可放置过夜，如长期保存需用HEPES调节pH至7-8并且加EDTA至1mM，可置于4或-20长期保存。常见问题分析：得率低：A.样品匀浆和裂解的不彻底B最终得到的DNA沉淀没有完全溶解A260/A2801.70 ：A. 检测吸光度时，RNA样品没有溶于水，而溶于了TE中B酚除去的不