纤溶酶高产菌株的分离、鉴定 课题申请书.doc

一、课题的立项依据、国（省）内外研究现状豆豉是我国传统大豆发酵食品之一。其营养丰富，食药兼用，对我国人民的饮食文化和医药保健，发挥了重大的作用。豆豉古名“幽菽”，后更名为豆豉。东汉许慎说文解字说：“豉，配盐幽菽也”。宋丹铅录解释说：“盖菽本豆也，以盐配之。幽闭盎中所成，故日幽菽”。东汉刘熙释名、释饮食：“豉，嗜也，五味调和须之而成，乃可甘嗜，故齐人谓豉，声同嗜也”。说明豆豉是古代的重要调味品及其命名的由来。生产豆豉的主要原料是大豆，原产于我国，栽培历史悠久。1973年，在浙江余姚河姆渡古文化遗址中发掘的黑豆，距今有7000年的历史。北京自然博物馆展出的山西侯马出土黄豆，是东周末年的文物。我国古代大豆栽培十分普及，是与稻、梁、麦、黍等齐名的主要农作物之一。在长期的栽培、食用过程中，必然会对大豆的贮存、加工等进行探索，偶然把吃剩的煮豆幽闭于盎中，由此有了豆豉的产生。唐朝时代随着佛教的传播，豆豉生产技术先后流传到日本、朝鲜、菲律宾、印度尼西亚等国家和地区，发展成为具有地方特色的产品。如日本的纳豆，印尼的丹贝均有盛名。日本、印尼率先对豆豉进行科学研究，分别从纳豆和丹贝中发现有溶栓激酶，引起了世界广泛的关注、掀起纳豆热。然而我国的豆豉似已被人遗忘，不仅科学研究落后于日本、印尼，一些专业书籍，如发行量较大的发酵调味品生产技术、酿造工艺学等，均未将豆豉列入。为此选题研究臭豆豉纤溶酶高产菌株，意在唤起国人重视，希望能弘扬我国古代科学文化成就，发掘民族宝贵遗产，与时俱进，自主创新，改革传统工艺中落后的生产方式，对其工艺中合理的因素，赋予现代化的内涵，促进我国发酵调味品科技和豆豉科研生产的发展。豆豉的种类很多，按参与制曲主要微生物的不同，可分为米曲霉型、毛霉型、根霉型、细菌型四类。利用米曲霉酿造豆豉，是我国最早最常用的方法。食经、齐民要术及历代古籍记载的作豉法大都是米曲霉型豆豉，现在的北京豆豉、湖南豆豉、日本静冈县滨松纳豆都是米曲霉型豆豉；毛霉型豆豉以四川潼川豆豉为代表；根霉型豆豉如印度尼西亚的丹贝；细菌型豆豉如山东水豉、贵州豆豉、日本的拉丝纳豆。细菌型豆豉主要微生物是产生芽孢的枯草杆菌，生长适温3O37，在5O56尚能生长。制曲时创造高温、高湿的条件，枯草杆菌能迅速生长。大豆浸渍后水煮，至豆粒充分变软，以手指轻压即烂为度，出锅沥去余水、趁热入曲室中堆积、加盖麻袋保温，2d后品温渐次升高，3d后可达50以上，豆粒布满粘液，可掌拉成丝，并有特殊气味。彭勇和张义正利用纤维蛋白平板筛选，纤溶活性测定，SDSPAGE分析和体外溶栓实验等相结合的方法，成功地从豆豉中筛选到一株纤溶活性高达520U/mL和具有良好体外溶栓效果的解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens)。SDSPAGE和纤维蛋白自显影表明该酶的分子量为28kD，其最适反应温度和pH值分别为42和8.0，在pH6-10较稳定。PMSF和盐酸苯甲醚能抑制纤溶活性，而EDTA和EGTA不能抑制，表明该酶是一种丝氨酸蛋白酶。它溶解纤维蛋白的方式是直接溶解纤维蛋白，而不激活纤溶酶原，并且不水解血细胞。袁贵英等对从河南不同地区采集了5种农户自然发酵的臭豆豉样品，利用平板稀释分离实验，对自然发酵制成的臭豆豉的微生物组成进行了分析。结果表明：河南臭豆豉自然发酵的主要微生物为细菌类，采用传统方法进行分类鉴定，初步确定为枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌。田亚红和刘辉从我国传统食品细菌型豆豉中筛选出1株具有高纤溶活性的纳豆芽孢杆菌菌株NK-1。通过单因素试验和正交试验确定了该菌株液体发酵最佳条件：大豆蛋白胨1.0，葡萄糖2.0，培养温度35，初始pH值为7.0，培养时间72h时，该菌产酶纤溶活力可达1225.5尿激酶IU/mL。李华等为了明确细菌型豆豉发酵菌株的分类地位，采用形态及生理生化方法进行鉴定，并根据16SrDNA测序结果确定菌株BBDC3属于枯草芽孢杆菌。考察了菌种、后酵温度和加盐量对豆豉感官品质和氨基酸态氮含量的影响，经统计比较确定，细菌型豆豉纯种发酵的较优工艺条件是：以枯草芽孢杆菌菌株BBDC3和BBDC4的混合菌为菌种，后酵温度50，加盐量10。在此优化条件下发酵得到的豆豉含蛋白质38.93、脂肪23.90、灰分14.59、总酸0.42，氨基酸态氮和三氯醋酸可溶性蛋白的含量分别为0.61和1.59，大大高于原料黑豆（0.19，0.26），符合我国豆豉行业标准。臭豆豉属于细菌型豆豉，本课题拟采用酪蛋白平板对纤溶酶高产菌株进行分离，并回接到大豆上观察其能否生产臭豆豉，筛选蛋白酶活性最高的菌株。通过16SrDNA测序结果确定菌株的分类地位。再对利用该菌株生产臭豆豉的工艺进行优化研究，达到发掘民族宝贵遗产，与时俱进，自主创新，改革传统工艺中落后的生产方式，促进我国发酵臭豆豉生产技术进步的目的，为农产品的深加工做出贡献。二、课题研究内容、研究目标及拟解决的关键问题（1）研究内容： 臭豆豉中纤溶酶高产菌株的分离、纯化。A采用酪蛋白平板对臭豆豉样品中的产纤溶酶菌株进行分离、纯化；B分离的菌株回接到大豆上观察其能否生产臭豆豉。 筛选纤溶酶活性最高的菌株。A采用体外溶血块技术对产纤溶酶菌株进行初步筛选；B采用血纤维平板法对产纤溶酶菌株进行复筛。 通过16S rDNA测序结果确定菌株的分类地位。A细菌DNA的提取；B通过PCR法扩增16S rDNA片段并送到生物公司测序；C16S rDNA片段测序结果的分析。（2）研究目标采用酪蛋白平板对臭豆豉的纤溶酶高产菌株进行分离、纯化，筛选纤溶酶活性最高的菌株，再通过16SrDNA测序结果确定菌株的分类地位。三、拟采取的研究方案（技术路线）及可行性分析（1）技术路线血纤维平板法复筛高产纤溶酶菌株菌株的分类鉴定优势菌株回接到大豆采用体外溶血块技术初筛产纤溶酶菌株纤溶酶高产菌株的分离、纯化五、年度研究计划与预期研究