提取淋巴细胞流程.doc

一、采集血样，室温保存。使用一次性的抗凝的真空抽血管进行采血。一般使用EDTA或肝素抗凝均可；血量一般为2-5ml；一般地，1ml外周血中含有大约1-2*106个单个核细胞（PBMC，即淋巴细胞核单核细胞）。二、提取淋巴细胞。在无菌的塑料离心管中加入2ml淋巴细胞分离液，在装有2ml血样的真空管中加入2mlPBS（磷酸盐缓冲液），1：1混匀。然后缓慢把混匀的血样PBS混合液加入到有淋巴细胞分离液的离心管中，注意要缓慢，使血样尽量位于提取液上层，不能太用力让血细胞扩散到下层，就没办法离心分层了。（这一步的操作应该尽量快速的完成，因为时间长了，红细胞就会在重力作用下沉降，混入到提取液中，对后面的离心造成影响）然后离心。1500rpm,15min,20摄氏度。说明：1、从采集血样到开始实验的时间最好不超过4小时。实验过程中一直保持室温条件，一般20摄氏度比较适中，因为细胞的最适温度是体温37摄氏度，但是温度降低又可以降低细胞的代谢，两者有些矛盾，所以取中间温度比较理想。2、关于淋巴细胞分离液的注意事项：启封后应置4保存避免微生物的污染；分离液从冰箱取出后，不可立即使用，需待溶液温度升至室温时，摇匀后使用； 整个分离过程中，温度应控制在18-28且在无菌环境下，避免微生物的污染，否则会影响分离质量；未启封前在18-25避光保存，启封后置4保存，本品为真空包装，未启封前置于10 以下易出现白色结晶，影响分离效果。（各种淋巴细胞分离液的保存温度不完全一致）淋巴细胞分离液是一种根据细胞密度差异，借助离心产生的重力加速度，进行细胞的分离纯化的常用试剂，为带有乳光或微乳光的灭菌水溶液，主要成分是葡聚糖与泛影酸葡甲胺。适用于人淋巴细胞和大多数哺乳动物细胞的分离纯化，能除去红细胞和死细胞碎片，所获得的PBMC可进一步用于原代培养或流式细胞分析。最常用的细胞分离液有Ficoll和Percoll。3、PBS溶液是一种平衡盐溶液，还可以用Hanks液或生理盐水代替PBS溶液，但最常用的还是PBS溶液。4、离心的条件有很多说法。转数范围为1500-2000rpm，时间范围为10-20分钟，温度为室温20摄氏度。推荐两步离心法：首先用1500rpm/min离心20min，如果白膜层足够一步就结束，如果发觉细胞不够，说明该病人的淋巴细胞比重较低，再重新用2000rpm/min离心10min。三、离心后，分四层。淋巴细胞位于第二层（从上到下），呈白蒙蒙的一薄层。用5ml的小注射器吸取分离液层中的淋巴细胞，这里技巧性比较强，需要多次练习才能比较熟练的把淋巴细胞吸的比较完全。把吸取的淋巴细胞溶液装入另一无菌离心管中。用小注射器前，需把针头拧紧，抽动几下，减小摩擦力。再次离心。1500r,10min，20摄氏度。把离心后的上层液体倒掉，淋巴细胞位于离心管底的一小点白色的物质，一般会混有少量红细胞，尽量避免。加入4mlPBS缓冲液到离心管中，（并用加液枪吹打底部的白色物质，把其打散【该步也有认为不吹打的，以避免淋巴细胞粘在壁上，造成损失】）。注意换枪头。再洗涤两次，离心条件为：1500r,10min，20摄氏度。说明：1、有时离心后得到的淋巴细胞层很薄，淋巴细胞很少，这可能是离心转数不够，淋巴细胞还飘在分离中造成的，最好再用2000rpm，10min，20摄氏度再次离心一下。2、吸取淋巴细胞的方法还可以用长嘴胶头滴管，不带刻度的，使用的时候在顶端套上一个橡皮吸头。这种方法比注射器使用方便，而且吸得更完全。3、洗涤后离心的条件，离心范围为1500-2000rpm，通常用1500rpm就足够了，太高了容易把细胞离死。时间为10min，温度还是室温20摄氏度。4、离心后，看到淋巴细胞中混有少量红细胞，在这个实验中问题不大。5、洗涤液的选择也是平衡盐溶液即可，作用主要是去除淋巴细胞中的血浆蛋白和血小板，红细胞很难去掉。一般洗涤液用4-5ml即可。四、用Trizol reagent 裂解淋巴细胞，提取RNA。在离心管中加入1ml Trizol试剂，可以裂解除RNA以外的其他大分子物质，细胞膜，细胞器等。这个东西有致癌、致畸性，要带口罩，小心操作。用加液枪吹打离心管底部的淋巴细胞团块，把其打散。一般至少吹打30-60次，主要目的是把其打散，让Trizol试剂充分裂解淋巴细胞。把吹打之后的液体转移到EP管中，存放在-80摄氏度冰箱中。说明：1、TRIZOL试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂。它在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性。2、在TRIZOL中，RNA是隔离在RNA酶污染之外的。而对样品的后续操作会要求用无RNA酶的非一次性的玻璃器皿或塑料器皿。玻璃器皿可以在150C的烘箱中烘烤4小时。塑料器皿可以在0.5 M NaOH中浸泡10分钟，用水彻底漂洗干净后高压灭菌备用