《分子荧光光度法》PPT课件.ppt

第一节概述Generalization第二节基本原理Principles第三节定量分析方法Fluorometer第四节仪器与技术QuantatitiveAnalysis第五节应用Apply 第五章分子荧光分析法 MolecularFluorescenceAnalysis 第一节概述Generalization 一 光致发光 物质分子吸收一定能量的光后发射出的光辐射 利用测量荧光强度而建立的物质含量分析方法 二 荧光光度法 第二节基本原理Principles 一 分子荧光的发生过程 一 分子的能级与电子能级的多重性 1 分子的能级跃迁 每个分子具有严格分立的能级 基态分子吸收了特征频率能量后 从低能级向高能级跃迁 即处于不同的激发态 E Ej Ei hv 2 分子的激发态 1 基态时 电子在各原子或分子轨道中成对存在 在某一给定轨道中的两个电子具有相反的自旋 自旋配对 2 所有电子自旋都配对的分子电子态叫基态单重态 S0 基态单重态 S0 3 处于基态单重态的电子对 其中一个电子被激发到某一较高能级时 受激电子的自旋仍然与处于基态的电子配对 称为激发单重态 S 激发单重态 S 4 处于基态单重态的电子对 其中一个电子被激发到某一较高能级时 两个电子的自旋相互平行 称为激发三重态 T 激发三重态 T 激发单重态的平均寿命大约10 8s 而激发三重态的平均寿命大10 4 1s以上 由基态单重态向激发三重态跃迁 S0 T 属于禁阻跃迁 而由基态单重态跃迁到激发单重态 S0 S 是允许跃迁 二 荧光和磷光的产生 最常见 1 无辐射跃迁 振动驰豫 较高能级分子与其它分子 样品或溶剂 碰撞 能量变为热能 内转换和体系跨越 当两个相邻电子能级相距较近以致其振动能级重叠 电子由较高电子能级以无辐射跃迁方式至低一级电子能级 称为内转换 电子由激发单重态向激发三重态 S1 T1 的无辐射跃迁称为体系跨越 S2 S1 T2 T1 内转换 体系跨越 S1 T1 外转换 受激分子与溶剂或其它溶质分子间的相互作用和能量转移 外转换使分子的荧光或磷光减弱甚至消失 这一现象称为 熄灭 或 淬灭 2 辐射跃迁 荧光和磷光 处于电子激发态的分子 S1 或T1 通过光发射回到电子基态 称为辐射跃迁 S1 S0 T1 S0 荧光 磷光 荧 磷 强度F磷 F荧 讨论 荧 10 6 10 9s 磷 10 4 xs 固定测量波长 选最大发射波长 化合物发射的荧光 磷光 强度与照射光波长的关系曲线 图中曲线I 激发光谱曲线的最高处 处于激发态的分子最多 荧光强度最大 二 激发光谱与荧光光谱 1 荧光 磷光 的激发光谱曲线 测定荧光 磷光 强度的仪器装置示意图 固定激发光波长 选最大激发波长 化合物发射的荧光 或磷光强度 与发射光波长关系曲线 图中曲线II或III 2 荧光光谱 或磷光光谱 3 激发光谱与发射光谱的关系 1 Stokes位移 激发光谱与发射光谱之间的波长差值 发射光谱的波长比激发光谱的长 振动弛豫消耗了能量 2 发射光谱的形状与激发波长无关 电子跃迁到不同激发态能级 吸收不同波长的能量 如能级图 2 1 产生不同吸收带 但均回到第一激发单重态的最低振动能级再跃迁回到基态 产生波长一定的荧光 如 2 通常荧光发射光谱与它的吸收光谱 与激发光谱形状一样 成镜像对称关系 3 镜像规则 镜像规则的解释 基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各振动能级分布类似 基态上的零振动能级与第一激发态的二振动能级之间的跃迁几率最大 相反跃迁也然 三 物质分子结构与荧光的关系 一 荧光效率 f 激发态分子中以发射荧光的光量子数目和分子吸收激发光的光量子总数之比 f 0 1 分子产生荧光必须具备的条件 1 具有合适的结构 共轭刚性平面结构 2 具有一定的荧光量子产率 激发态的分子有几种途径可以回到基态 荧光去激发比其它去激发快 才可以观察到荧光发射 荧光效率越大 分子产生荧光的能力越大 二 分子结构与荧光 的荧光效率高 系间跨越过程的速率常数小 有利于荧光的产生 1 跃迁类型 提高共轭程度有利于增加荧光效率并产生红移 2 长共轭效应 共轭程度 f 荧光强度 当激发光波长为 ex327nm时 产生的荧光为 em510nm 维生素A 3 分子的刚性和共平面性 可降低分子振动 减少与溶剂的相互作用 故具有很强的荧光 如荧光素和酚酞有相似结构 荧光素有很强的荧光 酚酞却没有 共轭程度 荧光效率 芳环上有推电子基 使荧光 4 取代基效应 芳环上有吸电子基 使荧光 推电子基 OH NH2 NR2等 吸电子基 NO2 COOH等 引入高原子序数原子 Br I 到 电子体系 荧光减弱 磷光增强 荧光强度对温度变化敏感 温度增加 外转换去活的几率增加 荧光效率 1 温度的影响 除一般溶剂效应外 溶剂的极性 氢键 配位键的形成都将使化合物的荧光发生变化 2 溶剂的影响 极性 荧光 重原子溶剂 CBr4 C2H5I 荧光 四 影响荧光的外界因素 弱酸或弱碱性化合物 溶液pH的影响较大 需要严格控制 3 溶液的pH值 无荧光 蓝色荧光 无荧光 与荧光物质分子发生相互作用引起荧光熄灭的物质 如 X 重金属离子 O2 NO2 重氮化合物 COOH 等 4 荧光熄灭剂 自熄灭 待测物浓度过大时 会发生分子间碰撞 使荧光强度减弱 称为自熄灭 第三节荧光定量分析QuantatitiveAnalysis 一 基本原理 在稀溶液中 荧光强度If有 If K c 二 定量分析方法 1 工作曲线法 常将标准系列溶液中浓度最大的标准溶液做基准 使其荧光强度读数为F0 100 然后测出其它溶液的相对荧光强度 以 I I0 对C标作图 测出Ix 查 Ix I0 找对应Cx 2 标准对照法 Is I0 K Cs Ix I0 K Cx 第四节仪器与技术Fluorometer 测量荧光的仪器主要由四个部分组成 激发光源 样品池 双单色器系统 检测器 特殊点 有两个单色器 光源与检测器通常成直角 1 激发光源 2 单色器 光电荧光计常用干涉滤光片 荧光分光光度计常用光栅 特点 强度大 适用波长范围宽 常用 高压汞灯 氙弧灯 卤钨灯 激光光源 仪器光路图 3 样品池用石英材料 四面透明 4 检测器光电池或光电倍增管 激发单色器 把不需要的光线滤去 让所选择的激发光透过而照射在测定物质上 选最大激发波长 ex 荧光单色器 把激发光所发生的反射光 溶剂的散射光以及溶液杂质所产生的荧光滤去 只让样品物质所产生的荧光通过而照射到检测器上 选最大荧光波长 em 可获得三维光谱图的仪器 可获得激发光谱与发射光谱同时变化时的荧 磷 光光谱图 第五节应用Apply 荧光法的优点 灵敏度高 选择性好 取样量少等 荧光法在临床检验 药物分析和生物化学上应用在不断扩大 如血液和组织液中极微量的肾上腺素 组胺 多巴胺 5 羟色胺和胆碱的测定 均可用荧光法达到目的 一 直接荧光测定法 色胺的含量是色胺酸新陈代谢的一个标志 色胺有天然荧光 激发峰为285nm 荧光峰为360nm 利用苯可从尿或组织液中萃取出来 即可进行检测 在0 1 8 g 15mL范围内 F与色胺浓度呈线性关系 基于药物本身受特定波长光激发后能产生荧光 例如 二 化学引导荧光测定法 自身化学结构不产生荧光 化学处理 产物的化学结构具有荧光 增加 电子共轭程度 增加分子结构刚性和共平面性 1 氧化还原反应 血浆中苯妥英的测定 血浆中苯妥英 二氯乙烷萃取 NaOH溶液 KMnO4氧化 正己烷萃取 浓H2SO4溶液回提 二苯酮 2 水解反应 血清中氨苄青霉素的测定 3 缩合反应 血清中异味烟肼的测定 4 络合反应 药物与金属离子发生络合反应 形成具有荧光的分子 5 光化学反应 药物发生光催化反应 形成具有荧光的分子 6 H2SO4引导荧光 甾体化合物在浓H2SO4作用下可因质子化而产生荧光 三 制备荧光衍生物测定法 1 与荧光试剂反应生成荧光衍生物 2 胺荧 与含伯胺 仲胺或潜在胺基的药物作用产生荧光 3 与单酰氯反应生成荧光衍生物 4 与邻苯二甲醛反应生成荧光衍生物 5 与荧光染料反应生成荧光离子对 四 淬灭荧光测定法 药物与荧光试剂反应 生成的产物能淬灭荧光试剂的荧光 与试剂空白比较降低了荧光强度 测定样品液荧光强度减弱的定量方法 五 化学发光免疫分析法 特点 高灵敏度 免疫分析专一性 超微量分析 分析浓度10 12 10 15mol L 1 具有比放射性同位素法安全 抗原或抗体 标记 酶或荧光化合物 荧光 在抗原上或抗体