超高效液相色谱四极杆飞行时间串联质谱法.pdf

DOI 10 3724 SP J 1096 2011 01323 超高效液相色谱 四极杆飞行时间串联质谱法 同时分析奶粉中 9 种雌激素 王和兴周 颖 姜庆五 上海复旦大学公共卫生学院 公共卫生安全教育部重点实验室 上海 200032 摘要建立了奶粉中 9 种雌激素 雌三醇 雌二醇 雌二醇 马烯雌甾酮 17 乙炔雌二醇 雌酮 己烯雌 酚 己二烯雌酚 己烷雌酚 的超高效液相色谱 四极杆飞行时间串联质谱 UPLC Q TOF MS 分析方法 样品 用水溶解 乙腈超声提取雌激素 正己烷除脂 NH2柱净化 经 Waters ACQUITY UPLC HSS T3 色谱柱 100 mm 2 1 mm 1 8 m 分离 采用电喷雾离子源 ESI 负离子模式 对9 种雌激素进行 Q TOF 分析 分 析时间13 min 线性范围为0 001 0 5 mg L 检出限 S N 3 为0 11 0 30 g kg 定量限 S N 10 为0 37 1 0 g kg 考察了对 9 种雌激素精确质量数的测定能力和用基质内标法定量的回收率和精密度 9 种雌 激素的测定质量数与理论值误差在 1 0 0 9 mDa 之间 在添加水平分别为1 2 10 和100 g kg 时 平均回 收率为61 137 RSD 为1 0 22 6 采用本方法对市售的 7 种奶粉进行检测 未发现上述 9 种雌激 素 关键词超高效液相色谱 四极杆飞行时间串联质谱 QuEchERS 方法 雌激素 奶粉 2010 11 29 收稿 2011 06 08 接受 本文系国家 十一五 科技支撑计划 No 2006BAI19B02 和复旦大学 09 年青年基金 No EYF201023 资助 E mail yingchou fudan edu cn 1引言 奶粉是人们生活中重要的食品之一 与人们的健康息息相关 由于近年来不断发生的奶粉安全事 件 因此奶粉安全问题备受关注 雌激素作为内分泌干扰物之一 有研究表明儿童性早熟 男性前列腺 癌 妇女乳腺癌和子宫癌发病率的上升与食品中雌激素的残留有关 1 2 我国农业部在 2002 年第 193 号 公告里禁止性激素和具有雌激素样作用的物质在食品动物中的使用 但是在经济利益驱动下 违规滥用 这类物质的情况仍然很多 3 同时有研究表明 奶牛在养殖过程中 可能会引起牛奶中内源性雌激素的 升高 4 因此 为保障食品的安全 内源性和外源性雌激素的同时检测就显得很重要 食品中雌激素常用的检测方法是气相色谱 质谱联用法 GC MS 5 6 和液相色谱 质谱联用法 LC MS 7 12 GC MS 虽然分离效果好 但是雌激素挥发性低 需要衍生化 操作繁琐 LC MS 因为灵敏度 高 选择性好 样品前处理相对简单而成为雌激素检测的主要方法 13 超高效液相色谱 UPLC 相对 LC 分离效果好 分析速度快 非常适合于多组分快速检测 14 飞行时间质谱 TOF MS 能够进行分子 量的精确测定 适合复杂基质中组分的准确定性 因此 UPLC TOF MS 成为复杂基质中多组分残留的有 效分析方法 15 目前检测的样品多为牛奶 7 9 动物肌肉 5 7 10 血液 11 12 和尿液 6 等 所采用的样品 处理方法大多操作复杂 本研究借鉴 QuEChERS 16 方法中快速提取的部分原理 结合正己烷除脂及 NH2柱净化 建立了奶粉中 9 种雌激素的超高效液相色谱 四极杆串联飞行时间质谱 UPLC Q TOF MS 检测方法 并成功用于实际样品的检测 2实验部分 2 1仪器与试剂 ACQUITYTM 超高效液相色谱仪 SYNAPT G2 高分辨率飞行时间质谱仪 美国 Waters 公司 2200T 超声波清洗器 上海安谱公司 TGL 10B 高速台式离心机 上海安亭公司 KD200 氮气吹扫仪 杭州 奥盛公司 NH2固相萃取柱 500 mg 3 mL 中性氧化铝固相萃取柱 500 mg 3 mL 12 位固相萃取仪 第 39 卷 2011 年 9 月 分析化学 FENXI HUAXUE 研究报告 Chinese Journal of Analytical Chemistry 第 9 期 1323 1328 德国 CNW 公司 乙腈 纯水 乙酸乙酯 甲醇 LC MS 级 美国 Fisher 公司 NaCl 优级纯 上海国药集团 雌三醇 氘代 雌二醇 雌二醇 雌二醇 马烯雌甾酮 17 乙炔雌二醇 雌酮 己烯雌酚 己二烯雌酚 己烷雌 酚 纯度大于 97 8 美国 Sigma 公司 标准溶液 分别称取标准品 10 0 mg 于 10 mL 棕色容量瓶中 用甲醇定容 得 1 0 g L 标准储备溶 液于 20 保存 用乙腈 水 10 90 V V 稀释 得到 1 mg L 混合标准溶液 然后逐级稀释得到所需浓 度混合标准工作溶液 2 2色谱 质谱条件 Waters ACQUITY UPLC HSS T3 色谱柱 100 mm 2 1 mm 1 8 m 流动相 水 A 和乙腈 B 梯度洗脱程序 0 2 min 5 35 B 2 8 min 35 45 B 8 8 5 min 45 95 B 8 5 11 0 min 95 B 11 0 11 5 min 95 5 B 11 5 13 0 min 5 B 流速 0 7 mL min 柱温 40 样品室温度 10 进样量 10 L ESI 负离子模式 毛细管电压2 8 kV 锥孔电压 45 V 提取锥电压 4 V 离子源温度 120 脱溶 剂气温度 450 锥孔气流量 40 L h 脱溶剂气流量 1000 L h 碰撞气 氩气 质量范围 100 800 Da 扫描时间 0 2 s MSe 模式中各雌激素碰撞电压见表 1 其它参数同 MS 模式 2 3样品处理 称取混匀的奶粉样品 2 0 g 于 50 mL 具塞塑料离心管中 加入 10 mL 纯水 充分混匀 超声波提取 10 min 后 加入 20 mL 乙腈 振摇 2 min 再次超声波提取 10 min 然后加入 3 g NaCl 振摇 2 min 以 7000 r min 离心 10 min 取 10 mL 上清液于 10 mL 离心管中 在 45 以微氮气流吹至 5 mL 加入 3 mL 正己烷 振摇 1 min 后 静置 5 min 去除上层正己烷 重复操作 1 次 下层乙腈提取液用微氮气流吹至 近干 用 1 mL 乙酸乙酯 甲醇 90 10 V V 溶解残渣 待净化 预先用 8 mL 乙酸乙酯 甲醇 90 10 V V 活化平衡 NH2柱后 将上述待净化液全部上柱 再用 10 mL 乙酸乙酯 甲醇 90 10 V V 洗脱 收集全部洗脱液于 10 mL 离心管中 用微氮气流吹至近干 加 入500 L 甲醇 再吹至近干 用乙腈 水 10 90 V V 定容至1 0 mL 漩涡混匀 30 s 过0 2 m 滤膜 滤 液供分析 3结果与讨论 3 1提取条件和除脂条件的优化 QuEChERS 的提取方法常用 NaCl 促使水与乙腈快速分层 实现有机物的快速溶剂萃取 16 本研 究采用这种快速溶剂提取方法提取目标化合物 并与乙腈直接超声提取方法进行了比较 结果显示 前者对9 种雌激素回收率在 84 102 之间 平均为 93 而采用乙腈直接超声提取的回收率在 43 57 之间 平均为 47 本研究采用快速溶剂提取方法进行样品提取 分别考察了正己烷除脂 NH2柱净化与氧化铝柱直接除脂和净化的效果 采用氧化铝柱净化时 上 样液和淋洗液均为正己烷 丙酮 70 30 V V 洗脱液为二氯甲烷 甲醇 50 50 V V 结果表明 前者 对9 种雌激素回收率在 80 97 之间 平均为 87 而后者的回收率在 22 77 之间 平均为 45 因此 本研究采用正己烷除脂 NH2柱净化 3 2色谱条件的优化 分别考察了 ACQUITY UPLC HSS T3 和 BEH C18色谱柱在不同溶剂系统 梯度洗脱和流速以及添加 改性剂与否时的分离效果 实验表明 无论 C18色谱柱还是 T3 色谱柱 在流动相中添加10 mmol L 乙酸 铵改性剂时 9 种雌激素的灵敏度均降低 1 3 倍 C18色谱柱通过变换乙腈 水和甲醇 水 2 种溶剂系统 改变洗脱梯度和流速均难以实现己烷雌酚和己二烯雌酚 雌酮和乙炔雌二醇之间的基线分离 而 T3 色谱 柱在流动相为乙腈 水时 通过优化洗脱梯度和流速 在 8 min 内可实现 9 种雌激素的基线分离 最小分离 度为己烷雌酚与己二烯雌酚之间的1 59 梯度洗脱程序共为13 min 优化后的色谱条件见2 2 节 50 g L 的 9 种雌激素混合标准溶液基峰离子 BPI 色谱图和奶粉样品中加标量为 10 g kg 的各 4231 分 析 化 学第 39 卷 雌激素母离子提取色谱图分别见图 1 和图 2 图 1 9 种雌激素混合标准溶液的基峰离子色谱图 Fig 1Base peak ion BPI chromatograms of a mixed standard solution of nine estrogens 1 雌三醇 Estriol 2 雌二醇 Estradiol 3 雌二醇 Estradiol 4 马烯雌甾酮 Equilin 5 17 乙炔雌二醇 17 Ethinylestradiol 6 雌酮 Estrone 7 己烯雌酚 Diethylstilbes trol 8 己二烯雌酚 Dienestrol 9 己烷雌酚 Hexestrol 图 2加标样品中 9 种雌激素和内标物 氘代 雌二 醇 的母离子提取色谱图 Fig 2Extracted parent ion chromatograms of nine estro gens and internal standard estradiol d3 in the spiked milk sample 1 雌三醇 Estriol 2 雌二醇 Estradiol 3 雌二醇 Estradiol 4 马烯雌甾酮 Equilin 5 17 乙炔雌二醇 17 Ethinylestradiol 6 雌酮 Estrone 7 己烯雌酚 Diethylstil bestrol 8 己二烯雌酚 Dienestrol 9 己烷雌酚 Hexes trol 10 氘代 雌二醇 estradiol d3 3 3质谱条件的优化 用乙腈 水 50 50 V V 配制 0 1 mg L 的 9 种 雌激素的混合标准溶液 采用流动注射泵以 20 L min 流速直接进行质谱分析 为得到待测雌激素最佳的离子化效率和 MSe 模式下适宜的裂解质谱图 采用单因素变化模型逐个对质谱条件进行优化 发现毛细管电压 锥孔电压 源温度 脱溶剂温度和脱溶 剂气流量对离子化效率影响较大 同时对碰撞电压进行优化 结果见表 1 表 1加标样品中 9 种雌激素和内标 氘代 雌二醇 的碰撞电压 子离子的元素组成以及精确质量数 Table 1Collision energy elemental composition and accurate mass measurement of daughter ions for 9 estrogens and internal standard estradiol d3 in spiked sample 雌激素 Estrogen 碰撞能量 Collision energy eV 元素组成 Elemental composition 理论质量数 Theoretical mass Da 实测质量数 Experimental mass Da 误差 Error 10 3 Da 雌三醇 Estriol 氘代 雌二醇 Estradiol d3 雌二醇 Estradiol 雌二醇 Estradiol 马烯雌甾酮 Equilin 17 乙炔雌二醇 17 Ethinylestradiol 雌酮 Estrone 己烯雌酚 Diethylstilbestrol 己二烯雌酚 Dienestrol 己烷雌酚 Hexestrol 43 C12H11O 171 0810171 0809 0 10 C10H9O145 0653145 0649 0 40 42C10H9O145 0653145 06580 50 C13H9OD2185 0935185 09360 10 42C10H9O145 0653145 0649 0 40 C13H11O183 0810183 0803 0 70 42C17H19O239 1441239 1432 0 90 C10H9O145 0653145 0652 0 10 33C10H7O143 0497143 05010 40 C16H15O223 1123223 1118 0 50 40C10H9O145 0653145 0648 0 50 C14H15O199 1123199 1118 0 50 36C10H9O145 0653145 06540 10 C11H11O159 0810159 0806 0 40 27C17H15O2251 1072251 1066 0 60 C16H13O2 237 0916237 0908 0 80 25C17H13O2249 0916249 0907 0 90 C16H11O2235 0759235 0757 0 20 20C9H9O133 0653133 06570 40 C8H7O 119 0497119 04980 10 3 4定性和定量分析 分析样品前 分别用 5 mmol L 甲酸钠和 2 mg L 亮氨酸脑啡肽校准仪器 在 MS 模式下 用保留时 5231 第 9 期王和兴等 超高效液相色谱 四极杆飞行时间串联质谱法同时分析奶粉中 9 种雌激素 间 t R和分子离子精确质量数对待测雌激素进行初步定性 5 个加标样品连续进样后 9 种雌激素保留 时间的相对标准偏差均小于 0 2 对于加标样品 实验测定的分子离子质量数与理论质量数的误差在 1 0 0 9 mDa 之间 表 2 在 MSe 模式下 可获得待测物的二级质谱图 通过特征性子离子精确质 量数 可以确定元素组成 从而推测母离子裂解途径 进一步增强了对待测物的确证能力 例如 内源性 雌激素 雌二醇的 2 个特征性离子 C10H9O 145 0653 和 C13H11O 183 0810 是由分子离子 C18H23O2 271 1698 分别失去碎片 C8H14O 126 1045 和 C5H12O 88 0888 产生的 表 1 显示了特征性子离子 的元素组成和分子量误差 子离子实际测定的质量数与理论质量数之间的误差仅为 0 9 0 5 mDa 为了减少基质效应对于雌激素分析的影响 采用基质内标法进行定量 MS 模式下的分子离子峰作 为定量离子 离子提取窗口为 0 02 Da 表 2加标样品中 9 种雌激素和内标 氘代 雌二醇 母离子的元素组成和精确质量数 Table 2Elemental composition and accurate mass measurement of parent ions for 9 estrogens and internal standard estradiol d3 in spiked sample 雌激素 Estrogen 平均保留时间 Mean retention time min 元素组成 Elemental composition 理论质量数 Theoretical mass Da 实测质量数 Experimental mass Da 误差 Error mDa 雌三醇 Estriol 2 51C18H23O3287 1647287 1641 0 60 氘代 雌二醇 Estradiol d34 61C18H20O2D3274 1886 274 1878 0 80 雌二醇 Estradiol4 66C18H23O2 271 1698271 1696 0 20 雌二醇 Estradiol5 14C18H23O2 271 1698271 1692 0 60 马烯雌甾酮 Equilin5 36C18H19O2 267 1385267 1376 0 90 17 乙炔雌二醇 17 Ethinylestradiol5 53C20H23O2295 1698295 1688 1 00 雌酮 Estrone 5 69 C18H21O2 269 1542269 1534 0 80 己烯雌酚 Diethylstilbestrol6 75C18H19O2 267 1385267 1378 0 70 己二烯雌酚 Dienestrol6 99C18H17O2 265 1229265 12380 90 己烷雌酚 Hexestrol7 17C18H21O2 269 1542269 1541 0 10 3 5线性范围和检出限 用经检测的 9 种雌激素含量均低于检出限的奶粉作为基质样品 按 2 3 节所述样品前处理方法得 到样品处理液 将该处理液配制成浓度分别为 0 001 0 002 0 005 0 01 0 05 0 1 和 0 5 mg L 的 系列混合基质匹配标准溶液 各浓度点内标 雌二醇 d3 浓度均为 0 01 mg L 以各雌激素母离子色 谱峰面积与内标 雌二醇 d3 母离子色谱峰面积之比乘以 雌二醇 d3 的质量浓度 Y 为纵坐标 各雌 激素的质量浓度 X 为横坐标绘制内标法校准曲线 以 3 倍信噪比 S N 对应的样品中雌激素浓度作 为检出限 LOD 10 倍信噪比 S N 对应的样品中雌激素浓度为定量限 LOQ 获得各雌激素的检出 限和定量限 由表 3 可见 各雌激素在 0 001 0 5 mg L 范围内具有较好的线性关系 检出限为 0 11 0 30 g kg 定量限为 0 37 1 0 g kg 表 39 种雌激素的线性方程 相关系数 检出限和定量限 Table 3Linear equations correlation coefficient LOD and LOQ of nine estrogens 雌激素 Estrogen 线性方程 Linear equation 相关系数 Correlation coefficient 检出限 LOD g kg 定量限 LOQ g kg 雌三醇 Estriol Y 6797 4X 61 950 9970 260 88 雌二醇 EstradiolY 9409 1X 7 96 0 99970 190 64 雌二醇 EstradiolY 8913X 1 32 0 99980 200 67 马烯雌甾酮 EquilinY 16278X 7 83 0 99980 110 37 17 乙炔雌二醇 17 EthinylestradiolY 8649 3X 18 280 99980 210 69 雌酮 Estrone Y 8361 5X 39 750 9980 220 72 己烯雌酚 DiethylstilbestrolY 12646X 82 370 998 0 140 47 己二烯雌酚 DienestrolY 5936 9X 67 95 0 9930 301 0 己烷雌酚 HexestrolY 9511 7X 70 83 0 9970 190 63 Y 雌激素峰面积与内标 氘代 雌二醇 峰面积的比值与内标质量浓度的乘积 Quantification ion peak area ratio of estrogen to es tradiol d3 internal standard multiplied by mass concentration of estradiol d3 X 雌激素质量浓度 Mass concentration of the estrogen mg L 3 6方法的回收率与精密度 在奶粉中添加不同浓度水平 1 2 10 和 100 g kg 的雌激素 每个水平重复 5 次 用基质内标法测 6231 分 析 化 学第 39 卷 定回收率和精密度 结果见表4 由表4 可见 回收率为61 137 精密度 RSD 为1 0 22 6 表 4以基质内标法测定空白样品中添加 9 种雌激素的回收率和相对标准偏差 RSD n 5 Table 4Recoveries and relative standard deviations RSDs for 9 estrogens spiked in a blank sample determined by matrix matched internal standard method n 5 雌激素 Estrogen 加标量 Spiked g kg 实测量 Found g kg 回收率 Recovery 相对标准 偏差 RSD 雌激素 Estrogen 加标量 Spiked g kg 实测量 Found g kg 回收率 Recovery 相对标准 偏差 RSD 雌三醇 Estriol 雌二醇 Estradiol 雌二醇 Estradiol 马烯雌甾酮 Equilin 17 乙炔雌二醇 17 Ethinylestradiol 10 616119 0 21 47010 0 107 6764 3 10097 597 55 8 10 909012 4 22 211010 0 1010 21023 4 1001021021 2 10 878710 6 22 11056 8 109 8981 0 10092 792 73 8 10 757511 0 21 8907 9 108 9895 9 10087 887 86 4 10 777712 1 21 8908 1 1010 81086 8 10093 493 43 1 雌酮 Estrone 己烯雌酚 Diethylstibestrol 己二烯雌酚 Dienestrol 己烷雌酚 Hexestrol 11 1611617 4 22 512513 4 1010 31034 6 10087 287 24 8 11 2812822 6 22 211010 9 1013 31337 9 10092 092 06 5 11 2912916 7 22 71357 6 1013 71373 0 10090 790 78 2 11 2412411 9 22 31158 1 1012 91295 8 10084 684 68 2 3 7实际样品的测定 利用本方法对购自超市的 4 个不同品牌的 7 份奶粉样品 适用对象为 0 3 岁的婴儿和幼儿 进行 分析 均未检出上述 9 种雌激素 3 8小结 本研究采用 UPLC Q TOF MS 方法分析了奶粉中 9 种不同性质雌激素残留 实现了9 种雌激素的快 速基线分离 质谱母离子和特征性子离子的精确质量数测定 增强了本方法在复杂基质中雌激素的定性 能力 结合准确的基质内标法定量 能够满足奶粉样品中雌激素多残留快速分析的要求 References 1Okamotoa Y Liua X Suzukia N Toxicology Letters 2010 193 3 224 228 2Aksglaede L Juul A Leffers H Skakkeb k N E Andersson A Hum Reprod Update 2006 12 4 341 349 3WU Ping Gu WANG Qiang CHEN Hui Hua YING Yong Fei ZHAO Yong Xin SHEN Xiang Hong SONG Guo Liang XU Xiao Min 吴平谷 王 强 陈慧华 应永飞 赵永信 沈向红 宋国良 徐小民 Chinese J Anal Chem 分析化 学 2008 36 11 1476 1482 4Ganmaa D Sato A Med Hypotheses 2005 5 6 1028 1037 5Seo J Kim H Y Chung B C Hong J J Chromatogr A 2005 1067 1 2 303 309 6ZHAN Jia YU Xue Jun LI Zuo Qing XIE Dong Hua HAUNG Shao Tang FAN Yuan Mu CHEN Shu Bing PENG Jin Feng 湛 嘉 俞雪钧 李佐卿 谢东华 黄绍棠 樊苑牧 陈树兵 彭锦峰 Chinese J Anal Chem 分析化学 2009 37 2 251 254 7Yang Y Shao B Zhang J Wu Y Duan H J Chromatogr B 2009 877 5 6 489 496 8Tso J Aga D S J Chromatogr A 2010 1217 29 4784 4795 9Yan W Li Y Zhao L Lin J M J Chromatogr A 2009 1216 44 7539 7545 10CHEN Hui Hua YING Yong Fei WU Ping Gu Wei Min Jue ZHU Cong Ying QU Jian CHEN Man Qian 陈慧华 应 7231 第 9 期王和兴等 超高效液相色谱 四极杆飞行时间串联质谱法同时分析奶粉中 9 种雌激素 永飞 吴平谷 韦敏珏 朱聪英 屈 健 陈熳茜 Chinese J Anal Chem 分析化学 2009 37 2 181 186 11Hosogi J Tanaka H Fujita K Kuwabara T Ikegawa S Kobayashi N Mano N Goto J J Chromatogr B 2010 878 2 222 227 12Draisci R Palleschi L Ferretti E Marchiafava C Lucentini L Cammarata P Analyst 1998 123 12 2605 2609 13YAN Wei LIN Jin Ming 严 炜 林金明 Chinese J Anal Chem 分析化学 2010 38 4 598 606 14Guillarme D Schappler J Rudaz S Veuthey J Trends Anal Chem 2010 29 1 15 27 15Lacina O Urbanova J Poustka J Hajslova J J Chromatogr A 2010 217 5 648 659 16Anastassiades M Lehotay S J Stajnbaher D Schenck F J J AOAC Int 2003 86 2 412 431 Simultaneous Analysis of Nine Estrogens in Milk Powder with Ultra Performance Liquid Chromatography Coupled Quadrupole Time of Flight Mass Spectrometry WANG He Xing ZHOU Ying JIANG Qing Wu Key Laboratory of Public Health Safety of Ministry of Education College of Public Health Fudan University Shanghai 200032 AbstractA rapid sensitive and specific method has been developed for the simultaneous analysis of 9 estrogens including estradiol estradiol estradiol equilin 17 ethinylestradiol estrone diethylstilbes trol dienestrol and hexestrol using ultra performance liquid chromatography coupled quadrupole time of flight mass spectrometry UPLC Q TOF MS with electrospray ionization ESI in negative mode The milk powder was dissolved in water the