生物电镜技术.docx

生物电镜技术第一章 透射电子显微镜的原理与操作主讲：吴金浪一、电子显微镜的发展简史 20世纪30年代，卢斯卡（E.ruska）发明了世界上第一台透射式电子显微镜(transmission electron microscope，TEM)，并且成功地得到了一张由电子束作为光源形成的铜网放大像。当时放大倍数仅有12倍。 到1934年电子显微镜的分辨率提高到50nm，放大倍数达到1万倍。这就是电子显微镜的初型设计阶段。 1935年电子显微镜基本定型。 1939年德国西门子公司生产了世界上第一批作为商品的透射式电子显微镜，分辨率优于10nm，放大倍数达到10万倍。 60年代透射式电子显微镜的分辨率达到0.5nm。 70年代末电子显微镜的点分辨率已优于0.3nm，晶格条纹分辨率达到0.14nm。实现了人们早就向往的对原子像和晶格像的观察。 80年代电子显微镜已发展成为一种综合分析仪器。例如，安装配有计算机系统的能量分析谱仪，对样品进行元素的成分分析。样品室内亦可装配加热、冷却、大角度倾斜、拉伸样品台等附件，使透射式电子显微镜既能观察样品的形态又能分析样品的成分。扫描电子显微镜(scanning electron microscope，SEM)是显微镜世家中的一位后起之秀。自第一台定型的透射式电子显微镜产生后，法国卡诺尔就提出了扫描电子显微镜的设计思想和工作原理。到1942年剑桥大学首次制成世界上第一台扫描电子显微镜。由于扫描电子显微镜使用范围广，并具备分辨率高、图像立体感强、放大倍率选择范围广、样品适应性大、制样方便等优点。所以后期发展速度比透射式电子显微镜快的多。70年代已发展成为性能完善，自动化程度高，功能齐全的一种电子光学仪器。电子显微镜种类：由于电子与物质相互作用会产生透射电子、弹性散射电子、能量损失电子、二次电子、背反射电子、吸收电子、X射线、俄歇电子、阴极发光和电动力等等。电镜就是利用这些信息来对试样进行形貌观察、成分分析和结构测定的。 主要分为透射式电子显微镜(简称透射电镜，transmission electron microscope，TEM)和扫描电子显微镜(简称扫描电镜，scanning electron microscope, SEM)两大类。 扫描透射电子显微镜(简称扫描透射电镜，STEM)则兼有两者的性能。为了进一步表征仪器的特点，有以加速电压区分的，如：超高压(1MV)和中等电压(200500kV)透射电镜、低电压(1kV)扫描电镜；有以电子枪类型区分的，如钨灯丝电镜、场发射电镜；有以用途区分的，如高分辨电镜，分析电镜、能量选择电镜、生物电镜、环境电镜、双束扫描电镜(FIB)等。有以激发的信息命名的，如电子探针X射线微区分析仪(简称电子探针，EPMA)等。二、透射电镜的基本原理 就最基本的原理来说，透射电镜和光学显微镜是相同的，它们的显微放大过程基本相似，而且电镜的光路和部件术语也同光镜基本一样。不同的是，电镜的照明源不是可见光而是电子束；透镜也不是玻璃而是轴对称的电场或磁场，并且电子显微镜的总体结构、成像原理、操作方式等与光学显微镜有着本质上的区别。 透射电镜的基本原理如下： (一)分辨本领与放大倍数 分辨本领是指能够分辨物体上两点之间的最小距离。光学显微镜的分辨极限为O.2m，而电镜的分辨本领可优于2 ，相差达l 000倍，因为影响光镜提高分辨本领的主要因素是由于光线的衍射作用。光学显微镜的分辨本领由阿贝公式决定：d=0.612nsin式中d为分辨本领，为照明波波长，n为物体与物镜之间介质的折射率，为物体上的点与物镜所成夹角的一半。普通光学显微镜用油浸镜头时n1.5，90。即sin1，用可见光作照明源时，其平均波长约为5 000 ，那么它的分辨本领约为2 000 。这说明光学显微镜只能分辨大于2 000 的结构。要提高分辨本领，必须采用波长短的照明源。电子显微镜的照明源波长约为0.05 ，目前最好的电镜分辨本领已达1.4 ，比光学显微镜提高了1000多倍。 放大倍数是指物体经过仪器放大后的像与物的大小之比。放大了的像还可多次放大，但到一定限度后继续放大时便不能增加细节，这是分辨本领的限制所致。不能增加图像细节的放大倍数称为空放大，而与分辨本领相应的最高放大倍数称为有效放大倍数，为眼的分辨本领与仪器的分辨本领之比。目前商品电镜的分辨本领可达到2 ，其有效放大倍数为My= 0.2mm210-7mm=106（倍）即100万倍。这个倍数可以从电镜上直接得到，也可在摄制20万倍的底片后再以光学放大5倍来获得。因此，标示电镜性能的主要指标是分辨本领而不是放大倍数。(二)电子束的产生电子束是电镜的照明介质。目前大多数电镜的电子束是由热阴极、控制极和阳极构成的三极式电子枪产生，其示意图： 阴极又称为灯丝 (包括钨丝、六铍化镧等)，通常用钨丝制成，通电加热后灯丝内的自由电子热运动增加并逸出表面，在加速电压作用下，阳极相对阴极形成正电场，逸出阴极的电子在正电场力作用下高速飞向阳极，中心部分的电子因惯性而穿过阳极孔成为照明电子束。 控制极靠近阴极表面，相对阴极加上数百伏的负电位，调节电位高低可以控制阴极发射电子的数目，亦即调节了电子束的强弱。钨阴极在使用时，由于金属蒸发和电子枪内残余气体的侵蚀，寿命一般为几十小时。(三)电子透镜及其作用运行中的电子束只有在通过电场或磁场时才能改变其运动轨迹。轴对称的电场或磁场可以使电子束聚焦，故称为电子透镜，前者叫静电透镜，后者叫磁透镜。一束电子的螺旋形轨迹是相似的。为便于理解，可设想将其外周包络起来而不考虑其有否旋转，则包络线的形状基本上和光学玻璃会聚透镜的光路相似。实用的电磁透镜是在线圈外面套上铁壳作磁路，并在铁壳中心置有极靴(pole piece)，使线圈通电后产生的磁场高度集中而又均匀地分布在极靴中心。 电磁透镜的焦距决定于磁场强度，磁场强度决定于通过线圈的电流强度。因此，可以调节激励电流来改变磁场强度，从而达到改变放大倍数和进行图像调焦的目的。由于电磁透镜像差小，调节容易，因此为现代电镜所普遍采用。但有些电子透镜不必改变焦距，可采用磁钢制造形成永久磁场，即为永磁透镜。 电子透镜的缺陷： 球差球差是由于电子透镜的中心区域和边沿区域对电子的会聚能力不同而造成的。结果在象平面成了一个满散圆斑。 象散磁场不对称时，就出现象差。有的方向电子束的折射比别的方向强，这样，圆形物点的象就变成了椭圆形的漫散圆斑。 色差电子的能量不同，从而波长不一造成的，电子透镜的焦距随着电子能量而改变，因此，能量不同的电子束将沿不同的轨迹运动。产生的漫散圆斑还原到物平面。(四)反差与成像反差就是像与背景在亮度上的差别。在电镜中，当电子束中的电子碰到样品中的原子核时，电子轨道将偏斜一个角度，这种相互作用的过程称为弹性散射。弹性散射的强度与样品元素的原子序数成正比，原子序数愈高，对入射电子的散射能力就愈大。在物镜的后焦面上装一接地的光阑，散射角度大的电子被光阑截获而除去，仅让透射电子和散射角小的电子穿过光阑孔参与成像，从而形成反差。这个光阑孔越小(通常为2030m)。被截除的散射电子便越多，像的反差也就越好。 生物组织样品主要由原子序数很低的碳、氢、氧、氮等元素组成，在电镜中不能直接形成反差，因而不能成像。为了获得生物样品的反差，必须对样品进行电子染色，即在样品制备过程中使组织块或超薄切片与重金属盐类(如锇、铀、铅)相作用，使组织中的某些结构结合(化合、吸附)重金属元素，从而增加这些结构对电子的散射能力以获得反差，使样品显示出清晰的结构来。三、透射电镜的使用（一）快速检查合轴的方法 合轴的好坏直接影响着电镜的性能，所以使用前有必要对电镜的合轴进行检查。快速检查合轴的步骤：1. 将光斑聚到最小，降低灯丝发射电流，调出灯丝像，检查灯丝发射是否均匀。2.反复微量改变第二聚光镜激励电流，观查光斑是否出现椭圆形，以判断聚光镜是否有像散。3调物镜激励电流从最大到最小（允许使用者观察电镜时调焦用的最大钮），反复调整，观察光斑中心是否偏离荧光屏中心。如有偏离说明照明系统与成像系统合轴不佳。4放入样品聚好焦，找一标记移置荧光屏中心，然后向欠焦的方向（减小物镜激励电流的方向）调中聚焦钮68档，观察标记是否偏离荧光屏中心，如有偏离说明电流中心合轴不好。5选择样品上颗粒密集的地方，在高倍数下改变物镜激励电流，若图像出现方向性的结构，说明物镜有残存象散。上述五步的检查，基本上可以判断电镜合轴是否合格。（二）操作钮(键)参量的选择及使用方法操作钮(键)的参量是使用者根据样品、分析、记录等要求而定。1加速电压值的选择 在许多电镜中，高压分为20kV、40kV直到100kV，或者更高。所以存在选择的问题。首先分析加速电压对电镜有关参量的影响。(1)加速电压越高，电子波长越短，分辨率增高。(2)加速电压越高，对于给定的一个样品，穿透能力越强，图像亮度提高。但振幅反差下降。(3)加速电压在80100kV时，透过样品的电子打在荧光屏上，荧光粉发光效应最佳。(4)80kv的加速电压。对目前多数照像底片来讲，感光效率最好。综合上述情况，对于生物样品来讲，加速电压一般选择在6080kV间较为合适。2放大倍数的选择(1)倍数越高，电子束流照射的样品范围越小，样品信息损失越多。(2)倍数越高，样品上所要求的照明强度越强。倍数增加两倍，样品上的照明强度必须增加4倍。由此会增大样品上的辐射损伤。(3)倍数增大，样品及透镜本身的缺陷随之增大而突出。(4)高倍率的图像较低倍率聚焦、摄影难度大。3. 倍数的选择原则是： 放大倍数与所需要的分辨率相一致。 一般在满足分辨率的条件下，倍数尽可能选低些。 在实际操作中，为了减少样品受电子的照射时间，先在200以下的倍数内粗查样品全貌，选择最合适的观察部位后再提高倍数。 4聚焦 5万倍以上的图像聚焦需要有较高的操作技能。 聚焦是通过调整物镜激励电流实现的。聚焦的方法一般是从粗到细逐档调整。 近代高档次的商品电镜装有微控装置，使用者只须操作一个钮(键)便可自动聚焦。(1)低倍聚焦：一般15000倍以下的图像为低倍像。低倍像调正焦点，多使用图像摇摆器(wobbler)，目前多数电镜装备此种装置。它有两组偏转线圈组成，在偏转线圈上通50周/秒的交流电，使用时照明束以样品平面上的一点为中心来回摆动。当物镜处于正焦点时，对于样品平面上的一点任意方向发射的电子到像平面还是一点当物镜处于过焦或欠焦时，则在像平面上散焦成两个点，图像呈现摆动。通过聚焦使图像稳定，此时即为正焦点。在15000倍以上的图像用摇摆器调焦效果不好。 (2)高倍聚焦：15000倍以上的图像为高倍像。可采用最小反差法，操作方法是：拔出物镜光阑，调节聚焦钮，图像出现最小反差时即为正焦点，然后加入物镜光阑再进行观察分析。 其原理可用干涉理论来解释，因为样品中任何质量厚度迅速改变的区域周围都出现Fresnel环，此环在欠焦时是亮线，过焦时是黑线，正焦时完全消失，所以正焦时像的反差最小。5光阑的选择(1)聚光镜光阑孔的选择：聚光镜光阑位于聚光镜下方。是一个多孔的可动光阑。一般三个孔，典型孔径为lOOm、200m、600m。根据需要选择适当的光阑孔，以改变孔径角。较薄的样品为了提高反差（位相反差）需要较小的光阑孔，使照明孔径角极小。使用较小的聚光镜光阑孔，可减少薄样品上的辐射损伤。为兼顾诸方面的因素，实践中多采用200m的光阑孔。 (2)物镜光阑孔的选择：物镜可动光阑位于物镜上方，是一个四孔光阑，典型孔径为25m、50m、75m、100m。选择物镜光阑孔径时，应考虑到样品的厚度。较厚的样品，散射电子角度大，反差较好，但亮度相对减小，所以应选用较大的孔径。较薄的样品为了提高反差选用较小的光阑孔。6样品的安装 安装样品是一件较容易的事，但并非是不重要的事。它的操作关系到图像的分辨率，为此安装样品时要求：手不能触摸进入真空系统的部分。以免手上的水分或脏物进入电子光学系统。放样品时要摆正放平，使载网与样品夹持器或样品杯接触良好，保证有良好的热传导，防止样品热漂移。 7照像 照像是记录观察者认为感兴趣的区域做为进一步分析或长期保存用。目前底片的分辨率高于荧光屏分辨率，所以底片可提供比荧光屏更多的样品信息。拍摄一张较满意的照片应注意以下步骤:(1)选择适当的倍数，使预拍照的区域充满荧光屏内照像的区域。(2)根据倍数和图像反差确定曝光时间和感光度。反差弱的图像可适当增加曝光时间。(3)图像无漂移，无振动，注意过底片时马达引起的振动。(4)确认焦点合适、反差适中。(5)注意室内光线不能对曝光有影响观察结束，应即时从真空中取出底片接收盒送暗室冲洗。8减少辐射损伤的方法：通常采用的方法是减少电子束发射电流及使用小的聚光镜光阑孔。注意： 在减少聚光镜光阑孔时必须保证图像亮度。也可采用移动样品法，先对不感兴趣的视野聚焦，然后再移动样品把感兴趣的视野放到照像的区域。这种方法只限于在低倍数之下使用。 在高倍数下，先将光斑中心移到荧光屏一侧对图像进行聚焦，然后再将束斑中心移到荧光屏中心进行拍照，上述两种方法，主要是减少电子束对样品的照射时间。 一种最有效的办法是采用低温法。使样品处在低温的环境中。提高样品室内的真空度也可减少样品的辐射损伤。9减少样品污染的方法这里所提出的样品污染是指观察样品的过程中在镜筒内造成的污染。通常造成污染的原因： 真空泵油的倒流，各橡胶密封垫圈放气， 它们吸附在镜筒内表面上，当受到电子轰击时分解成碳而造成样品污染。 采用冷却样品的办法是目前较有效的办法。实验证明样品温度在20K时污染率最小。 此外，操作时尽量减少电子束的照射时间。 操作熟练，分析目的明确。 倍数不宜过高，记录时关掉灯丝都是减少污染的有效方法。 关电镜前，一定把样品取出来，以免造成严重污染。第二章 透射电镜生物样品制备技术概述： 在医学生物学上所用的电子显微镜，发展最早和应用最广的是透射式的，它的成像是由一定强度的电子束透过标本而成像。 普通光学显微镜标本的厚度为2-5m. 电镜切片0.03-0.05m。这种厚度的切片叫做超薄切片。与其相关技术称为超薄切片术或称作透射电镜生物样品制备技术。电镜的分辨本领，在实际应用中，一方面取决于电镜本身的分辨率，同时取决于标本的结构和反差；而标本的结构在很大程度上决定于标本制备技术。 一、标本制作过程：取材固定 脱水 包埋 切片 染色 电镜观察（一）取材1.取材要快，从动物中取材，力争在处死动物或组织离体后半分钟内将组织浸入固定液中。2.组织块要小，组织块的大小不允许超过1mm3。3.低温操作，044避免人工损伤5选择部位准确可靠（二）固定用化学法或物理法迅速杀死细胞的过程叫做固定。1固定的作用破坏细胞的酶系统，阻止细胞的自溶；稳定细胞物质成分；如核酸、核蛋白，糖类和脂类，使之发生交联，减少或避免抽提作用，以保存组织成分。在一些细胞组份之间以化学反应和物理反应建立交联，以提供一个骨架来稳定各种细胞器的空间构型；能提供一定的电子反差。2固定剂在电镜生物样品制备中，常用的固定剂有：四氧化锇（OsO4），醛类、高锰酸钾等。它们的性质分述如下：醛类：醛类固定剂有甲醛、多聚甲醛、戊二醛等。（1）戊二醛(C5H8O2)是一种毒性不大的良好的固定剂，其结构式为： O=CH-CH2-CH2-CH2-CH=O，具有两醛基，对细胞结构有高的亲和力。 戊二醛的主要优点在于：戊二醛的单体分子小，穿透力强，固定速度快，它可以突破1mm3样品的界限。戊二醛的两个醛基，在固定时以交链作用使细胞成分得以稳定。具有稳定糖元，保存核酸、核蛋白的特点，尤其对细胞膜系统和细胞基质有较好的固定作用。经戊二醛长时间固定的材料不会变脆，变黑。适合于长期保存样品或远离实验室的野外取材。适于进行超微细胞化学研究。 戊二醛的主要缺点：它对脂质不起固定作用。经戊二醛单独固定的组织经脱水之后大部分脂质被抽提而丢失。因此，它不适于单独作为电镜固定剂，最好作为锇酸固定的前固定剂使用。无电子染色作用，反差较弱。戊二醛固定不影响细胞的渗透性，因此对缓冲液的渗透压要求较高。它不能用醋酸-巴比妥缓冲液配制。 戊二醛固定液的配制：0.2mol磷酸缓冲液：50ml，25%戊二醛水溶液：10ml，加蒸馏水至100ml，戊二醛的最终浓度2.5%。必要时，可加无水氯化钙，或氯化镁，使最终浓度达到1-3mmol但要注意避免形成沉淀，还可根据需要加入苦味酸等。（2）甲醛(CH2O)是醛类中最简单的醛，其分子较小，渗透较戊二醛迅速。虽然甲醛对细胞精细结构的保存不如戌二醛，但在酶活性的保存方面却优于戌二醛，故甲醛一般用于组织化学或快速固定。并且对结构致密的种子及脆弱的脑组织有良好的固定作用。常用戊二醛和多聚甲醛配合的固定液作为前固定液，其配制方法为：10%多聚甲醛水溶液：20ml，25%戊二醛水溶液：10ml，0.2mol磷酸缓冲液：50ml，加蒸馏水至100ml。其中，10%多聚甲醛水溶液的配制：称取2克多聚甲醛加入到20mL蒸馏水中，加热搅拌至溶解，再加入几滴新鲜配制的1mol NaOH，使溶液变得清亮。（注意：应在通风厨中操作）（3）四氧化锇（OsO4）：俗称锇酸,是一种非电解质强氧化剂，常用浓度为1%。 优点：与氮原子有极大的亲和力，故能与各种氨基酸、肽、及蛋白质反应，和蛋白化学结合并形成交链而使蛋白质得到稳定，故此能较完好地保存生物微细结构。与脂肪的不饱和脂肪酸链结合，形成脂肪-锇复合物。 虽然它对碳水化合物保护较差,但对作为细胞支架的磷酸脂蛋白的保护很好，还能固定核蛋白和脂蛋白。四氧化锇中的锇原子序数较高，对样品有较强的电子染色作用，并能产生一定的电子反差。 主要缺点：不能保护糖原，不能固定核酸，对微管固定较差；分子较大，扩散较慢，因而穿透力较差；四氧化锇是酶的钝化剂，不能用于细胞化学的研究；固定时间不宜太长，时间太长,会使组织变脆，给切片带来困难. 四氧化锇与蛋白质、不饱和脂肪酸交链形成的脂蛋白复合体是易溶于水的物质,特别是在长时间的固定后更易溶解。因此，固定时间以1-2小时较为适宜；四氧化锇能与乙醇或醛类产生氧化还原反应，生成沉淀。所以，四氧化锇固定后的组织块必须用相应的缓冲液充分漂洗干净后才能转入醛类或乙醇溶液中；毒性大，易挥发。对眼、鼻、喉等粘膜有强烈的刺激作用，因此操作时必须在防护通风罩内进行。戊二醛和四氧化锇（OsO4）与细胞主要成分固定作用比较：固定剂戊二醛四氧化锇蛋白质尚好好核蛋白很好很好脂质很差良好糖原很好很差核酸较好很差渗透大小电子染色无有对缓冲液（要求）强不强双固定法：即先用戊二醛固定，叫做预固定，或前固定。后用四氧化锇固定，叫后固定。（4）高锰酸钾(KMnO4)强氧化剂，对磷脂蛋白类有特别好的固定作用，可用于保护细胞的膜性结构，但几乎不能固定细胞的其他成分，常用浓度为0.6%。 3.缓冲液由于细胞本身的缓冲能力有限，为了防止组织细胞在固定时微细结构的改变或破坏，固定液用缓冲液以达到以下目的：（1）维持稳定的PH值在生理值上。缓冲液的PH值选在6.8-7.4范围时，适合大多数的动物植物组织细胞；对高含水组织可在8.0左右,对细菌、病毒可选在7.0以下。（2）提供合适的渗透压，使细胞不发生肿胀或收缩。（3）提供适宜的离子成分，使生物样品既不发生抽提，也不出现沉淀。电镜技术上常用的缓冲液：（1）磷酸盐缓冲液用于电镜技术的磷酸盐缓冲液是仿效细胞外液的成分而配制的，因其对细胞无毒性作用，故最富有生理学功能，适合各种固定液的配制。这种固定液特别适用于灌注固定。本缓冲液长期保存会出现沉淀，故应新鲜配制为宜。0.2mol磷酸缓冲液：A液：Na2HPO42H2O 35.61 g或Na2HPO47H2O 53.65 g或Na2HPO412H2O 71.20 gB液：NaH2PO4H2O 27.60 g或NaH2PO42H2O 31.20 gA、B两液分别加入蒸馏水溶解至1000ml。根据需要，按表中所列A液和B液不同配比，可得到不同PH 值的0.2mol磷酸缓冲液。PH（25)6.87.07.27.47.67.8A液(ml)24.530.536.040.543.545.75B液(ml)25.519.514.09.56.54.25如需配制0.1mol的磷酸盐缓冲液,可按上述比例再加入双蒸馏水至100 ml 即可。PH 7.2时的渗透压是226 mos mols，加入0.18mol蔗糖，可使渗透压提高到425 mos mols。 （2）二甲砷酸盐缓冲液 配制0.1mol二甲砷酸钠缓冲液：A液：二甲砷酸钠Na(CH3)2As023H2O 21.4g，加双蒸馏水至1000mlB液: 0.1mol盐酸 按下表混合后,即可得到不同PH值的缓冲液：PH6.7-6.86.9-7.07.1-7.27.3-7.4A液(ml)10101010B液(ml)1.861.260.840.54 二甲砷酸盐缓冲液的优点：容易配制，长期保存比较稳定，不易长细菌，加入低浓度的钙质（1-3mmol）不会产生沉淀，适用于作电镜组织化学研究，特别适用于作电镜放射自显影时的固定缓冲液。 但砷有毒性，并可与固定液起反应，有臭味，配制时应在防护罩内进行。而且不能同磷酸缓冲液起作用，会起反应。 4固定方法（1）浸泡固定（通用固定法）（2）灌注固定法所谓灌注固定就是将固定液通过血液循环的途径灌注到所需固定的组织中。适用于一些取材比较复杂，对缺氧较敏感，或较软的组织，如脑、神经组织等。其具体步聚为：全身灌注；局部灌注。（3）培养细胞的固定 单层细胞，在倒去培养液后，即加入前固定液，并轻刮下细胞，用3000转/分，离心1520分钟，使细胞成团，然后倒去上清液，再缓慢加入新鲜的前固定液，（避免将细胞团冲散）并继续进行双重固定。 悬浮培养的细胞或血液等，可在培养液中直接加入等量的固定液（前固定液）固定30分钟，然后用500-1000转/分，离心1520分钟，使细胞沉淀，再倒去上清液，加入前固定液，用3000转/分，离心1520分钟，使细胞成团。并继续进行双重固定，若离心后细胞不易成团，则可以于沉淀物中加几滴牛血清蛋白，或用琼脂预包埋法处理，使细胞凝集成团。最后把细胞团切成小块，再进行常规的双重固定。5固定时注意事项（1）浓度浓度较低，固定时间必须延长，这就容易引起细胞物质的抽提及组织的肿胀；浓度较高容易损坏细胞结构，尤其是四氧化锇和高锰酸钾，浓度太高能使蛋白质分子氧化而断裂。因此，固定液的浓度一定要适宜。一般戊二醛常用浓度为2.5%，四氧化锇常用浓度为1% （2）固定液的滲透压低滲固定液会引起细胞器或整个细胞膨胀，而高滲固定液则容易使细胞收缩。固定液的滲透压是通过改变缓冲液的浓度或者通过增加钠、钙和镁等电解质或葡萄糖和蔗糖等非电解质来调节的。 （3）PH值固定液PH值必须接近所要固定的组织的PH值。由于大部份动物组织的平均PH值约7.4，所以目前电镜固定液的PH值都选用中性（7.2-7.4）。（4）固定的温度前固定（戊二醛和甲醛）在低温（4左右）固定，后固定（锇酸）在室温固定，且加以振摇。 （5）每一种固定之后，都要用配制该固定液的缓冲液充分漂洗（缓冲液的温度与固定液相同），以除去多余的固定液，防止戊二醛和四氧化锇与后面的脱水剂（丙酮、乙醇 ）反应，产生沉淀，影响固定效果。 良好固定的细胞成份的超微结构形态： 细胞壁和细胞膜：致密并基本上分层，没有断裂。 细胞质基质：微细的颗粒沉淀，没有空白的空间。 内质网（粗糙型）：扁平的腔，在两侧均匀地排列着核糖核蛋白体颗粒。 内质网（光滑型）：有完整膜的分叉管子，没有核糖核白体颗粒附于膜上。 高尔基体：完整的膜，扁平囊池成叠排列。 线粒体：既不膨胀，也不收缩，外面的双层膜和内脊完整，基质致密。 核膜：双层膜没有损伤并基本上互相平行，二层膜厚度不等，可能有核孔。 核内容物：密度均匀，有染色质团分散在核膜附近。 质膜：完整，低倍下呈单层结构，高倍下可见三层结构。 质体：外层双膜完整，片层结构相互联结，基质致密。（三）脱水所谓脱水，指用适当的有机溶剂取代组织细胞中的游离水，因水分的存在会使组织结构在电镜高真空状态下急聚收缩而遭破坏，还因常用的包埋剂是非水溶性的，细胞中的游离水影响包埋剂的浸透，因此，脱水是一个很重要的步聚。 1. 常用脱水剂：常用于电镜生物样品制备的脱水剂有乙醇、丙酮，和过渡液环氧丙烷等。其中，因乙醇引起细胞中脂类物质的抽提较丙酮少，且不会使组织材料变硬、变脆，故为最常用的脱水剂。然而，乙醇不易和用于包埋的环氧树脂相混溶，为此，在转入包埋剂前要用“中间脱水剂”环氧丙烷过渡，它比乙醇易与环氧树脂混溶，且挥发快，利于后面浸透和包埋。2. 脱水的原则和方法生物样品中的水份占据着一定的空间，急聚脱水会引起细胞收缩，必须采用“等级系列脱水法”。所用系列浓度一般为30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%。材料在每一浓度停留10-20分钟，室内相对湿度要在50%以下。在脱水剂浓度低于70%时，组织处于膨胀状态，高于70%时，组织处于收缩状态，在70%浓度是组织体积变化最小状态，（四）渗透和包埋渗透和包埋的目的是取代活组织中的水分以及支持整个结构，以便有特定的机械性能利于切片。理想的包埋剂有以下特点：粘稠度低，容易渗透，聚合均一，不产生体积收缩，能耐受电子束轰击，高温下不易升华，不变形，对组织成分抽提少，能良好地保存微细结构，本身在电镜高倍下不显示结构，有良好的切割性能，切片易染色，对人体无害。常用包埋剂：甲基丙稀酸脂，环氧树脂(常用为Epon812), Spurr树脂,水溶性包埋剂,低温包埋剂如：LR. white Lowicryl k4M等。（1）甲基丙稀酸脂 优点：粘稠度低，容易渗透，配制、使用、保存容易，对湿度影响不大。 缺点：在聚合中易引起组织损伤，在电子束轰击易升华，收缩率大，21%左右。（2）环氧树脂（常用为Epon812） 优点：因其具有三维交联结构、聚合收缩率小，25%左右，聚合均匀，对组织损伤小，耐电子束的轰击，对细胞微细结构有较好的保存性能。 缺点：操作不方便，切片困难，染色后反差较弱，使用时对环境湿度要求较高。 聚合原理：环氧树脂有两种化学反应基团，其结构链的两端有环氧基（2个碳原子和1个氧原子拉紧的三角环），链的中间有羟基。环氧末端基团是非常容易应变的三元环，很容易打开并与其它含活性氢原子基团特别是胺类相结合，因此，当一个胺基附加到一个环氧树脂上时，头尾分子将联结在一起，形成一种长链聚合物，中间的羟基也能与其它的反应物，特别是酸酐联合，形成树脂分子间的横桥。因此，若把树脂，胺和酸酐的混合物一起加热。那么将发生三维聚合作用，即按链的长轴及横轴交联，形成一种非常稳定，含有聚脂和聚醚的抗热溶的惰性物质。胺类物质在树脂三维聚合作用中起“加速剂”的作用。常用的是2，4，6-三（二甲氨基甲基）苯酚，简称DMP-30，酸酐类物质在树脂三维聚合作用中起“固化剂”的作用，常用的是十二烷基琥珀酸酐（简称DDSA）和甲基内次甲基二甲酸酐（简称MNA）。为了改善包埋块的切割性能，使其具有适当的韧性和弹性，可通过调节DDSA和MNA的比例来调节包埋块的软硬度。DDSA偏软，MNA偏硬。 Epon812包埋剂的配制方法：A液：Epon812 62ml，DDSA 100ml；B液：Epon812 l00ml，MNA 89ml。上述配方若改变A液和B液的比例则可调节聚合块硬度，根据南方的地区气候条件，可按上配方，取其A:B为2:8左右比例，简化为下列配方：Epon812 51ml，DDSA 12ml，MNA 37ml，DMP-30 1.82ml聚合条件：室温过夜，在60聚合4872小时。 （3）水溶性包埋剂因这种包埋剂是水溶性的，故组织材料可在其中同时脱水和包埋，可避免使用乙醇，丙酮等对样品的抽提，能较好保存脂肪成份，但切片时易被水溶解，最后还得用非水溶性包埋剂来包埋，由于它能使样品的生物化学活性丧失尽可能最低程度，因此，这类包埋剂多用于组织化学和细胞化学的研究工作。 （4）低温包埋剂LR. White 可在4850聚合。Lowicryl k4M 可在-30-40在紫外线照射下聚合。（五）切片超薄切片术是为了电镜观察提供极薄的切片样品的专门技术。一般厚度在10100毫微米的切片叫做超薄切片。1定位、修块：所谓定位、修块，就是保留要进行电镜观察部分，把其余部分削去，以利进行超薄切片。定位、修块一般可分两个步聚：（1）先用单面刀片将包埋块表面修去，暴露组织，再将组织周围多余的包埋块修掉，然后将粗修后的包埋块置切片机上切出0.52m，的半薄片经过甲苯胺兰染色后，光镜下观察、定位。（2）根据半薄片上的定位，而在包埋块端面上进行相对应的定位。然后以定位为中心，将包埋块修成便于切片的一定大小的形状（顶端面一般为0.50.5mm左右）。2.切片刀的制备：制备切片刀是超薄切片准备工作之一，超薄切片刀有二种，一种是钻石刀，另一种是玻璃刀。钻石刀价格昂贵，故常用玻璃刀，玻璃刀制作方便，价格低廉，但刀刃较脆，不耐用，不能切硬材料。切片刀的制备有手工制刀和使用制刀机制刀。目前一般是用制刀机制刀，常用的为LEICA制刀机和奥地利RelchertJung公司生产的制刀机，不同类型的制刀机有专门配备不同规格的玻璃，不能相混使用。下面以LKB制刀机为例，介绍制刀过程。把玻璃条（2.5cm宽）栽成2.52.5cm的小方块然后在方块上稍偏离对角线处刻痕，再加压力断裂成两个三角形玻璃刀，这样做出来的真实刀角比划痕角大10左右。为了使超薄切片漂浮在一个液体表面上，刀上应该装上一个不漏的小水槽，通常是由金属片预制或胶带制成。刀口的选择：将刀装在切片机的刀台上，打开聚光灯，移动灯的位置，此时背景是暗的，而刀刃上出现一条亮线，在高倍镜下检查刀刃情况,，最佳部分的刀刃是一条平直的亮线，而有缺陷部分的刀刃则有闪烁的反光，并能看到许多“锯齿”，凡有锯齿部份的刀口不可用来切片，一般好的刀口上整个刀口的1/41/3左右，为了要获得较好的切片，最好选用应力线侧的刀口。3.支持膜及支持膜制作方法：（1）载网载网一般采用很薄的铜片，此外，还有镍网。银、钼、不锈钢、尼龙等材料制成的载网，惰性金属的载网适用于细胞化学放射自显影技术等，非金属的载网则适用于X射线元素的分析，常用的为铜网。载网的直径一般为3mm，孔形有圆形，长方形，单孔形及狭缝形等。一般选用200目左右，（每一英寸长度含200目）以保证有70%以上的电子束透过.（2）支持膜的制备：支持膜要求本身没有结构。薄而透明，易被电子穿透，有足够的机械强度，经得住电子束的轰击，不与生物样品产生化学反应，其厚度在15nm左右为宜，太厚会增加电子散射，降低分辨率和反差。常用的支持膜有 Formver 膜，火棉胶膜、碳膜。前面两种为有机膜，能满足一般分辨率的要求。对于高分辨率的研究，需要纯碳膜。有时为了增强有机膜的强度，可再喷上一层碳作为加固膜。 Formvar膜：化学名称为聚乙烯醇缩甲醛，特点是机械强度高，常配成0.2%0.5%氯仿溶液。采用玻片漂浮法制膜，用干净玻片浸入溶液后取出，表面形成一层薄膜，然后利用水的表面张力作用，将膜剥离到水面上。火棉胶膜：火棉胶膜的机械强度比Formvar膜弱，但制作较容易，常配成1%2%醋酸异戊酯（或醋酸正戊酯）溶液。 方法： 取一直径约10cm的结晶皿，盛满蒸馏水，在上面滴一滴火棉胶液，等火棉胶膜形成后，将干净铜网平铺在膜上，然后在铜网上复盖一层滤纸，等滤纸湿透并与铜网贴附好之后，用镊子夹住滤纸的边缘，一边轻轻提起，取出水面，翻转晾干备用。4.超薄切片修好包埋块，制好刀后，即可以进行超薄切片。不同厂家制造的超薄切片操作方法各有特点，但基本结构及原理类同。切片机按照自动进刀的原理，超薄切片机可分为机械推进式和热膨胀式两类.超薄切片操作 标本块与刀刃的调整：首先把标本和刀分别安装好，要注意夹紧，标本面的梯形上下底需与刀刃平行。把装有水槽的刀插入刀夹，刀前沿紧贴刀夹前沿，刀刃应与刀台标示等高。 根据组织块软硬程度不同，调整刀的前角（间隙角），设定切片速度。一般软硬适中的包埋块可选用45刀角，3-5的前角，2-5mm/秒的切速，偏硬的块可用较小角度的刀和较小前角及较慢的切速，偏软的块用大角度的刀，较大的前角及较快切速。 对刀对刀操作时，必须十分小心，对刀的原则是使刀刃尽量贴近标本面，但不能摩擦到，否则，会损伤标本面和损伤刀口，因此，对刀是超薄切片过程中极为重要，而又较难掌握的一关。 加水理想的水槽液必须具有较高的表面张力，以利切片漂浮和展开，具有极低的粘度，容许切片在其表面自由移动，一般蒸馏水是比较理想的水槽液。加入10%20%的乙醇，可降低溶液表面张力，有利于展平切片上的皱折。 切片和捞片加水后，可打开自动切片开关。如还未切出片，为了节省时间，可增大切片速度，直到切出第一片，即将速度回复到适合位置。切片过程中可根据切片情况，随时调节切片速度和厚度，直到切出满意的切片。切片的厚薄一般是从干涉色来判断的。切片厚度和切片干涉色的近似关系：暗灰色 40nm灰色 60nm银白色 6090 nm金黄色 90150nm紫色 150190 nm蓝色 190240 nm 常见的切片缺陷的原因及消除方法：颤痕：切片中出现的与刀刃平行的刀纹，主要由于切片时环境有振动源影响，或标本与刀夹持不牢，刀角度选择不合适，切速太快，包埋过软等。刀痕：切片中出现的与刀刃垂直的刀纹.是由于刀口有缺口，或刀刃上有脏物或组织材料有硬质材料所致，一般更换刀口或修去硬质材料便可。褶皱：切片中出现有不规则的皱褶，一般由于包埋块太软，刀钝，切面太大，水面太低，捞片时持铜网手不稳等。切片厚度不一：主要是刀不利、标本表面太大和包埋块各部分聚合不均匀等原因所造成。带水：原因是水槽液面太高。切片不成带切片破碎：由于组织块脱水不彻底而使包埋剂渗透不完全所造成。（六）染色1.切片染色电子染色所谓电子染色是利用某些金属盐（如铅、铀、锇等）能与细胞的某些结构和成分结合，以增加其电子散射能力，进而达到提高反差的一种方法，不同结构成分上吸附有不同数量重金属原子，结合重金属原子较多的区域（即结构致密，原子序数高的部分）具有较强的电子散射能力，在电镜下呈现为电子致密的黑色；结合重金属原子较少的区域则为浅黑色、灰黑色，没有结合重金属的区域是电子透明的区域，因此经过电子染色处理可提高样品的反差，增加图象的清晰度。 电子染色剂： 醋酸铀：也称醋酸双氧铀，是广泛使用的染色剂，它以提高核酸、蛋白质和结缔组织纤维的反差为主，对膜染色效果较差。铀具有放射性和化学毒性，对光不稳定，贮存和染色最好避光。 铅盐染色剂：是用得最广泛的电镜染色剂，电子密度大，对各种组织结构都有广泛的亲和作用，所以提高细胞膜系统及脂类物质的反差为好，对不能被四氧化锇染色的糖原更具有染色作用。铅盐毒性大，和空气中的CO2接触易产生白色碳酸铅沉淀污染切片，电镜下显黑色致密不定型颗粒。电镜染色常规用铀、铅盐双重染色。具体方法如下：先用大约12%的醋酸铀-乙醇饱和溶液染色510分钟，然后用蒸馏水洗三遍。用铅染色5分钟左右，再用双蒸馏水洗三遍，用滤纸吸干后晾干，电镜观察。 2.负染色技术负染色又称阴染色，是相对于普通染色（称正染色）而言。所谓负染，是指通过重金属盐加强样品外周的电子密度，使样品显示负的反差，衬托出样品的形态和大小。对于颗粒生物材料的研究而言，负染色具有分辩率高、简单、快速等优点。它可以显示生物大分子、细菌、病毒以及分离的细胞器等样品的形状结构、大小以及表面结构的特征。尤其在病毒研究方面，负染色技术成为不可取代的实验技术。（1）负染色液的制备目前最常用的负染色液是磷钨酸、磷钨酸钾和磷钨酸钠。此外醋酸铀、甲酸铀、硅钨酸、钼酸铵等也作负染色剂用。磷钨酸、磷钨酸钠、磷钨酸钾：用双蒸馏水成1%3%溶液，1mol NaOH调至6.4-7.0。醋酸铀：用双蒸馏水成0.2%0.5%溶液，新鲜配制, 使用前1mol NaOH调至PH4.5。甲酸铀：用双蒸馏水配制成0.51%水溶液，(PH3.5)使用时,用1molNaOH调至PH4.5-5.2。钼酸铵：用双蒸馏水配成2%-3%水溶液，使用时用醋酸铵将PH值调至7.0-7.4。钼酸铵对膜性结构材料染色效果较好。（2）染色方法： 悬滴法：将标本用细管滴一滴在有支持膜的载网上，染色12分钟后即用滤纸在悬滴的边缘处吸去余液，然后立即滴上染液，一般12分钟即可将染液用滤纸吸干，晾干后进行电镜观察。 漂浮法 喷雾法：将染色液与病毒悬液等量混合后，在无菌柜或防护罩里用喷器将标本喷到带膜的载网上，如果雾滴较少，往往能获得良好的效果，此法尤其适用于高分辨率的电镜。缺点：技术上比较繁琐，易造成病毒的扩散，此外，病毒与染液混合时，要求溶液的缓冲条件较高，否则易产生沉淀而影响效果。（3）染色操作中的注意事项负染色虽然操作比较简单，但要求获得理想的负染色效果，却不大容易，为要取得较好的效果需反复实践，获得良好结果的条件可能很多，因素比较复杂，其中最重要的条件是颗粒标本的均匀分散问题和标本、染液的酸碱度（PH值）问题，现分别将负染色标本制作条件介绍如下：标本的均匀散布问题：负染色中遇到的最大困难可能是颗粒悬滴标本的凝集现象，即生物标本与染色剂形成电子不能穿透的团块使超微结构无法观察，这是负染失败的最常见的原因，造成这一现象的主要原因是标本不易展开而形成团集现象。生物标本凝集成团块的现象原因之一是样品浓度太高，另外，也可能是由于表面张力的作用，滴到载网上的标本，颇象一颗滚动在玻璃上的水银不能展开。造成这样不亲和的原因很多，其中包括标本的电荷，支持膜的疏水作用以及酸碱度等解决办法： 使用分散剂把0.0050.05%牛血清蛋白溶液加到样品悬液内。所加量并无严格规定，例如0.5ml标本加入3-4滴即可，试染后如果仍不见效可适当增加，也可直接用0.01%的牛血清蛋白溶液作为离心沉淀物的稀释。此法适合于高度纯化的颗粒性悬液。 亲水性处理把有支持膜的载网放在离子溅射仪中，在约10-110-2的真空中用离子轰击（蚀刻）几秒钟，支持膜即由疏水性变为亲水性。悬液的浓度和纯度悬液浓度要适中，太浓时，因样品的堆集而影响观察，因此滴样时，应同时做几个不同浓度，通过电镜观察以找出最佳稀释度。悬液里含有较大的细胞残渣，应在2000-5000转/分离心除去大块物质。悬液和染液的酸碱度（PH）问题样品悬液和染液的酸碱度会对负染色的结果产生较大的影响，一般说来，生物样品悬液的酸碱度是中性或偏酸为宜。而偏酸的染液效果较好，而染液越是偏碱染色效果越差。二、免疫电子显微镜技术免疫电镜技术是把免疫化学技术与电镜技术有机的结合起来，研究抗原、抗体相互作用的一种方法。目前，普遍应用的免疫电镜技术有：免疫铁蛋白技术，免疫酶技术和胶体金技术等。免疫金染色和免疫金银染色技术免疫金和免疫金银法都是利用胶体金为标记物的免疫细胞化学方法。胶体金：是指金以微小的粒子分散在水中所形成的金溶胶。胶体金探针：指胶体金-大分子结合物。 电镜水平的免疫金染色法应用于电镜水平的免疫金染色法，可分为包埋前染色和包埋后染色和冷冻超薄切片免疫标记。由于包埋前染色对细胞膜的穿透性差，一般只用于细胞表面抗原的标记，如需穿透细胞膜，则需辅以冻融法或加入Triton X-100（能溶解细胞膜，增加抗体的穿透性，从而加强特异性染色），皂角等活性剂。后者会加重细胞超微结构的破坏。（一）包埋前染色 包埋前染色的优点在于：组织不经过锇酸的固定，脱水及树脂包埋等过程，抗原未被破坏，易于获得良好的免疫反应，可在免疫反应阳性部分定位作超薄切片，提高电镜下的检出率，特别适用于含抗原量较少的组织。（二）包埋后染色 优点：（1）超微结构保存较好；（2）由于是制成超薄切片才进行染色，所以不存在穿透问题，可标记到细胞的任何部分，且方法简便；（3）可在同一切片上进行多重免疫染色。 缺点：抗原活性在电镜生物样品处理过程中可能减弱以致丧失。常规包埋所用的环氧树脂的环氧基在聚合过程可能与组织成分发生反应而改变抗原性质，所以在环氧树脂中的组织不易进行免疫反应。 采用包埋后染色，最好采用低温包埋剂，如lowiryls,LR.White等，以上包埋剂可在低温下（-35摄氏度）经紫外线灯照射聚合，避免了高温对抗原的损伤。 （三）冷冻超薄切片冷冻超薄切片免疫电镜技术的特点是组织不经脱水包埋直接冷冻，在冷冻状态下进行超薄切片，然后进行免疫标记。该项技术克服了上述两种方法的缺点，能更理想地保存一些生物大分子的活性，极大地提高了免疫标记的敏感性，但在冷冻过程中超微结构会受到冰晶的破坏。 1.包埋后染色：（