显微镜介绍,原理.doc

显微镜显微镜一般分为：光学显微镜、电子显微镜、探针显微镜1.光学显微镜：图1-1-1现代普通光学显微镜利用目镜和物镜两组透镜系统来放大成像，故又常被称为复式显微镜。它们由机械装置和光学系统两大部分组成。结构为：目镜，镜筒，转换器，物镜，载物台，通光孔，遮光器，压片夹，反光镜，镜座，粗准焦螺旋，细准焦螺旋，镜臂，镜柱，是显微镜的基本组成单位，主要是保证光学系统的准确配制和灵活调控，在一般情况下是固定不变的。而光学系统由物镜、目镜、聚光器等组成，直接影响着显微镜的性能，是显微镜的核心。一般的显微镜都可配置多种可互换的光学组件，通过这些组件的变换可改变显微镜的功能，如明视野、暗视野、相差等。光学显微镜的原理：当一束平行于光轴的光线通过凸透镜后相交于一点，这个点称焦点，通过交点并垂直光轴的平面，称焦平面。焦点有两个，在物方空间的焦点，称物方焦点，该处的焦平面，称物方焦平面；反之，在象方空间的焦点，称象方焦点，该处的焦平面，称象方焦平面。 1. 当物体位于透镜物方二倍焦距以外时，则在象方二倍焦距以内、焦点以外形成缩小的倒立实象； 2. 当物体位于透镜物方二倍焦距上时，则在象方二倍焦距上形成同样大小的倒立实象；3. 当物体位于透镜物方二倍焦距以内，焦点以外时，则在象方二倍焦距以外形成放大的倒立实象；4. 当物体位于透镜物方焦点上时，则象方不能成象；5. 当物体位于透镜物方焦点以内时，则象方也无象的形成，而在透镜物方的同侧比物体远的位置形成放大的直立虚象。这是凸透镜成像的基本原理，把物镜与管镜合称为物镜，将这两种镜片看做一组组合透镜，就可以得到如图的简化光路图dL图1-1-2即，物体AB位于透镜物方二倍焦距以内，焦点以外，在象方二倍焦距以外形成了放大的倒立实象A1B1而这个实像落在了目镜的焦点以内，就在物体的同侧形成了一个放大的“正立”的虚像，因为目镜放大的并不是物体而是由物镜放大后的倒立实像，因此我们得到的就是相对与原物体的倒立放大的虚像。显微镜对物体的放大，实际上就是对人观察物体时视角的放大，因此显微镜的放大率取决于对视角的放大率如果有一台显微镜，物镜焦距为，目镜焦距为，镜筒长L，若最后的像成在离目镜d处，试证明显微镜的放大率。显微镜的光路如图1-1-2所示，AB经物镜成一放大实像，物镜的长度放大率 因、相对L都较小。而且B很靠近，所以，即 位于目镜的焦点内，经目镜成一放大的虚像（通常让成在观察者的明视距离d上）。因为都是近轴光线，所以此时观察者从目镜中看到的视角为 若观察者不用显微镜，直接观看AB的视角为 则显微镜的放大率m 不难看出目镜的长度放大率为 所以有 显微镜的重要光学技术参数显微镜的光学技术参数包括：数值孔径、分辨率、放大率、焦深、视场宽度、覆盖差、工作距离等等。这些参数并不都是越高越好，它们之间是相互联系又相互制约的，在使用时，应根据镜检的目的和实际情况来协调参数间的关系，但应以保证分辨率为准。1 数值孔径数值孔径简写NA，数值孔径是物镜和聚光镜的主要技术参数，是判断两者（尤其对物镜而言）性能高低的重要标志。其数值的大小，分别标刻在物镜和聚光镜的外壳上。数值孔径（NA）是物镜前透镜与被检物体之间介质的折射率（n）和孔径角（u）半数的正弦之乘积。用公式表示如下：NA=nsinu/2孔径角又称镜口角，是物镜光轴上的物体点与物镜前透镜的有效直径所形成的角度。孔径角越大，进入物镜的光通亮就越大，它与物镜的有效直径成正比，与焦点的距离成反比。显微镜观察时，若想增大NA值，孔径角是无法增大的，唯一的办法是增大介质的折射率n值。基于这一原理，就产生了水浸物镜和油浸物镜，因介质的折射率n值大于1，NA值就能大于1。数值孔径最大值为1.4，这个数值在理论上和技术上都达到了极限。目前，有用折射率高的溴萘作介质，溴萘的折射率为1.66,所以NA值可大于1.4。这里必须指出，为了充分发挥物镜数值孔径的作用，在观察时，聚光镜的NA值应等于或略大于物镜的NA值。数值孔径与其他技术参数有着密切的关系，它几乎决定和影响着其他各项技术参数。它与分辨率成正比，与放大率成正比，与焦深成反比，NA值增大，视场宽度与工作距离都会相应地变小。2 分辨率显微镜的分辨率是指能被显微镜清晰区分的两个物点的最小间距，又称鉴别率。其计算公式是=/NA式中为最小分辨距离；为光线的波长；NA为物镜的数值孔径。可见物镜的分辨率是由物镜的NA值与照明光源的波长两个因素决定。NA值越大，照明光线波长越短，则值越小，分辨率就越高。要提高分辨率，即减小值，可采取以下措施（1） 降低波长值，使用短波长光源。（2） 增大介质n值以提高NA值（NA=nsinu/2）。（3） 增大孔径角u值以提高NA值。（4） 增加明暗反差。3 放大率和有效放大率由于经过物镜和目镜的两次放大，所以显微镜总的放大率应该是物镜放大率和目镜放大率1的乘积：=1显然，和放大镜相比，显微镜可以具有高得多的放大率，并且通过调换不同放大率的物镜和目镜，能够方便地改变显微镜的放大率。放大率也是显微镜的重要参数，但也不能盲目相信放大率越高越好。显微镜放大倍率的极限即有效放大倍率。分辨率和放大倍率是两个不同的但又互有联系的概念。有关系式：500NA1000NA当选用的物镜数值孔径不够大，即分辨率不够高时，显微镜不能分清物体的微细结构，此时即使过度地增大放大倍率，得到的也只能是一个轮廓虽大但细节不清的图像，称为无效放大倍率。反之如果分辨率已满足要求而放大倍率不足，则显微镜虽已具备分辨的能力，但因图像太小而仍然不能被人眼清晰视见。所以为了充分发挥显微镜的分辨能力，应使数值孔径与显微镜总放大倍率合理匹配。 4 焦深焦深为焦点深度的简称，即在使用显微镜时，当焦点对准某一物体时，不仅位于该点平面上的各点都可以看清楚，而且在此平面的上下一定厚度内，也能看得清楚，这个清楚部分的厚度就是焦深。焦深大, 可以看到被检物体的全层，而焦深小，则只能看到被检物体的一薄层，焦深与其他技术参数有以下关系：（1） 焦深与总放大倍数及物镜的数值孔径成反比。（2） 焦深大，分辨率降低。 由于低倍物镜的景深较大，所以在低倍物镜照相时造成困难。在显微照相时将详细介绍。5 视场直径（Field Of View）观察显微镜时，所看到的明亮的圆形范围叫视场，它的大小是由目镜里的视场光阑决定的。视场直径也称视场宽度，是指在显微镜下看到的圆形视场内所能容纳被检物体的实际范围。视场直径愈大，愈便于观察。有公式 F=FN/式中F: 视场直径，FN：视场数（Field Number, 简写为FN，标刻在目镜的镜筒外侧），:物镜放大率。由公式可看出：（1） 视场直径与视场数成正比。（2） 增大物镜的倍数，则视场直径减小。因此，若在低倍镜下可以看到被检物体的全貌，而换成高倍物镜，就只能看到被检物体的很小一部份。6 覆盖差显微镜的光学系统也包括盖玻片在内。由于盖玻片的厚度不标准，光线从盖玻片进入空气产生折射后的光路发生了改变，从而产生了相差，这就是覆盖差。覆盖差的产生影响了显微镜的成响质量。国际上规定，盖玻片的标准厚度为0.17mm，许可范围在0.16-0.18mm，在物镜的制造上已将此厚度范围的相差计算在内。物镜外壳上标的0.17，即表明该物镜所要求的盖玻片的厚度。 7 工作距离WD工作距离也叫物距，即指物镜前透镜的表面到被检物体之间的距离。镜检时，被检物体应处在物镜的一倍至二倍焦距之间。因此，它与焦距是两个概念，平时习惯所说的调焦，实际上是调节工作距离。 在物镜数值孔径一定的情况下，工作距离短孔径角则大。数值孔径大的高倍物镜，其工作距离小。物镜物镜是显微镜最重要的光学部件，利用光线使被检物体第一次成象，因而直接关系和影响成象的质量和各项光学技术参数，是衡量一台显微镜质量的首要标准。1 物镜的主要参数（1） 放大率（2） 数值孔径NA（3） 机械筒长L：在显微镜中，物镜支承面到目镜支承面之间的距离称为机械筒长。对于一台显微镜来说，机械筒长是固定的。我国规定机械筒长是160毫米。（4） 盖玻片厚度d（5） 工作距离WD这些参数，大多刻在物镜筒上，如图3所示。有一种所谓筒长无限的显微物镜，这种物镜的后方一般带有辅助物镜（也叫补偿物镜或镜筒物镜），被观察物体位于物镜前焦点上，经过物镜以后，成像在无限远，再经过辅助物镜成像在辅助物镜的焦平面上，如图4所示。在物镜和辅助物镜之间是平行光，所以中间距离比较自由一些，可以加入棱镜等光学元件。 物镜的基本类型（1） 按显微镜镜筒长度（以mm计）：透射光用160镜筒，带0.17mm厚或更厚的盖玻片；反射光用190镜筒，不带盖玻片；透射光与反射光用镜筒，筒长无限大。（2） 按浸法特征：非浸式(干式)、浸式(油浸、水浸、甘油浸及其它浸法)。（3） 按光学装置：透射式、反射式以及折反射式。（4） 按数值孔径和放大倍数：低倍(NA0.2与10X)，中倍(NA0.65与40X)，高倍(NA0.65与40X)。（5） 按校正象差的情况不同，通常分为消色差物镜，半复消色差物镜，复消色差物镜，平视场消色差物镜，平视场复消色差物镜和单色物镜。a. 消色差物镜（Achromatic objective）这是应用最广泛的一类显微物镜，外壳上常有Ach字样。它校正了轴上点的位置色差（红，蓝二色）、球差（黄绿光）和正弦差，保持了齐明条件。轴外点的象散不超过允许值(4属光度)，二级光谱未校正。数值孔径为0.10.15的低倍消色差物镜一般由两片透镜胶合在一起的双胶物镜构成。数值孔径至0.2的消色差物镜由两组双胶透镜构成。当数值孔径增大到0.3时，再加入一平凸透镜，该平凸透镜决定着物镜的焦距，而其它透镜则补偿由其平面与球面产生的象差。高倍物镜的平面象差可用浸法消除。高倍消色差物镜一般均为浸式，由四部分构成：前片透镜、新月形透镜及两个双胶透镜组。b. 复消色差物镜（Apochromatic objective）这类物镜的结构复杂，透镜采用了特种玻璃或萤石等材料制作而成，物镜的外壳上标有Apo字样。它对两个色光实现了正弦条件，要求严格地校正轴上点的位置色差（红，蓝二色）、球差（红，蓝二色）和正弦差，同时要求校正二级光谱（再校正绿光的位置色差）。其倍率色差并不能完全校正，一般须用目镜补偿。由于对各种象差的校正极为完善，比响应倍率的消色差物镜有更大的数值孔径，这样不仅分辨率高，象质量优而且也有更高的有效放大率。因此，复消色差物镜的性能很高，适用于高级研究镜检和显微照相。c. 半复消色差物镜（Semi apochromatic objective）半复消色差物镜又称氟石物镜，物镜的外壳上标有FL字样。在结构上透镜的数目比消色差物镜多，比复消色差物镜少，成象质量上，远较消色差物镜为好，接近于复消色差物镜。d. 平视场物镜（Plan objective ）平场物镜是在物镜的透镜系统中增加一快半月形的厚透镜，以达到校正场曲的缺陷，提高视场边缘成像质量的目的。平场物镜的视场平坦，更适用于镜检和显微照相。对于平视场消色差物镜，其倍率色差不大，不必用特殊目镜补偿。而平视场复消色差物镜，则必须用目镜来补偿它的倍率色差。e. 单色物镜这类物镜由石英、荧石或氟化锂制的一组单片透镜构成。只能在紫外线光谱区的个别区内使用(宽度不超过20mm)，可见光谱区不能采用单色物镜。这类物镜均制成反射式与折反射式系统。主要缺点是相当大一部分光束在中心被遮蔽(入瞳面积的25%)。在新型折反射系统中，由于采用半透明反射镜以及物镜的胶合结构，使这一缺点大为减轻，从而可以取消反射镜框的遮光。并且两同轴反射镜的残余象差是互相补偿的，同时用透镜组来增大数值孔径。若系统的校正满意，孔径达到NA=1.4时，中心遮蔽可不超过入瞳面积的4%。f. 特种物镜所谓特种物镜是在上述物镜的基础上，专门为达到某些特定的观察效果而设计制造的。主要有以下几种： (a) 带校正环物镜（Correction collar objective）在物镜的中部装有环装的调节环，当转动调节环时，可调节物镜内透镜组之间的距离，从而校正由盖玻片厚度不标准引起的覆盖差。调节环上的刻度可从0 .11-.023,在物镜的外壳上也标科有此数字，表明可校正盖玻片从0.11-0.23mm厚度之间的误差。(b) 带虹彩光阑的物镜（Iris diaphragm objective）在物镜镜筒内的上部装有虹彩光阑，外方也可以旋转的调节环，转动时可调节光阑孔径的大小，这种结构的物镜是高级的油浸物镜，它的作用是在暗视场镜检时，往往由于某些原因而使照明光线进入物镜，使视场背景不够黑暗，造成镜检质量的下降。这时调节光阑的大小，使背景变黑，使被检物体更明亮，增强镜检效果。 (c) 相衬物镜（Phase contrast objective）这种物镜是由于相衬镜检术的专用物镜，其特点是在物镜的后焦平面处装有相板。(d) 无罩物镜（No cover objective）有些被检物体，如涂抹制片等，上面不能加用盖玻片，这样在镜检时应使用无罩物镜，否则图象质量将明显下降，特别是在高倍镜检时更为明显。这种物镜的外壳上常标刻NC，同时在盖玻片厚度的位置上没有0.17的字样，而标刻着0。(e) 长工作距离物镜这种物镜是倒置显微镜的专用物镜，它是为了满足组织培养，悬浮液等材料的镜检而设计。对于一个显微镜，目镜只起一个放大的作用，分辨率等等参数都是由物镜直接决定的。物镜的鉴别能力：显微镜的鉴别能力主要决定于物镜。物镜的鉴别能力可分为平面和垂直鉴别能力。平面鉴别能力即物镜的分辨率是指物镜所具有的将显微组织中两物点清晰区分的最小距离d的能力。如1-5所示。根据光学衍射理论可知，显微组织中的一点经物镜放大成像后并不能获得一个真正的点像，而是具有相应尺寸的以白色圆斑为中心的许多个同心衍射环组成的。中心光斑的强度最大，而衍射环的光强度随着环直径增大而逐渐减弱。试样上若有两个点，如果两点之间的距离小于d，则两点放大成像后的衍射环中心部分也相互重迭而不能清晰分辨。只有当两点间距大于或等于图1-5 鉴别率与衍射环d才能清晰地分辨出来。d即为物镜的分辨能力（鉴别率）。两物点间最小距离d愈小，物镜的分辨能力愈高。d=/2NA式中入射光的波长；NA物镜的数值孔径。在显微镜中，能充分利用物镜分辨率的最低放大倍数称为有效放大倍数。人眼在明视距离（250mm）处的分辨距离为0.150.30mm，因此，显微镜应将物镜能分辨的最小距离d放大到0.150.30mm时方使其被人眼所分辨。若以Ma表示显微镜的有效放大倍数，则dMa=0.150.30mmMa=(0.30.6)NA/由此可知，显微镜的有效放大倍数是由物镜的数值孔径和入射光的波长决定的。若用黄绿色光（5.510-1mm）观察，则Ma=（5001000）NA例如：选用NA=0.65的40倍物镜，若入射光波长5.510-1mm时，则Ma=（5001000）NA=325650倍表1-2 物镜的最小数值孔径系列、参数、色圈及标志分类，色圈放大倍数1.62.546.310162540506380100代号消色差物镜数值孔径0.100.250.400.650.851.25平面消色差物镜0.040.070.100.150.250.320.400.650.750.850.951.25PC平面半复消色差物镜0.200.300.400.600.750.901.30PB平面复消色差物镜0.160.200.300.400.650.800.951.32PF色圈黑黑蓝蓝紫绿绿黄黄红红白因此，应选择1020倍目镜相配合。如目镜倍数低于10倍，则未能充分发挥物镜的分辨能力；如果目镜倍数高于20倍，将会产生虚放大。垂直鉴别能力即物镜垂直分辨率又称景深，是指物镜所具有在景深方面能清晰造像的能力，即垂直方面能清晰造像的最大景深深度，深度越大表示垂直鉴别率越大。景深h为: h=n/(NA)M（0.150.30）由此可见，物镜的垂直鉴别率与数值孔径、放大倍数成反比，要提高景深，最好选用数值孔径小的物镜或减小孔径光阑以缩小物镜的工作孔径，但这样就会降低物镜的分辨能力.。所以要调和这一矛盾只能视具体情况而定。显微镜的鉴别能力显微镜的鉴别能力是显微镜最重要的特性，它是指显微镜对于试样上最细微部分所能获得清晰映象的能力，通常用可以辨别的物体上两点间的最小距离d来表示。被分辨的距离越短，表示显微镜的鉴别能力越高。显微镜的鉴别能力可由下式求得：d=/2NA式中：入射光源的波长；NA物镜的数值孔径，表示物镜的聚光能力。可见，波长越短，数值孔径越大，鉴别能力就越高，在显微镜中就能看到更细微的部分。一般物镜与物体之间的介质是空气，光线在空气中的折射率n=1，若一物镜的角孔径为60，则其数值孔径为NA=nsin=1sin30=0.5若在物镜与试样之间滴入一种松柏油（n=1.52），则其数值孔径为：NA=1.52sin30=0.76物镜在设计和使用中指定以空气为介质的称为“干系物镜”（或干物镜），以油为介质的称为“油浸系物镜”（或油物镜）。从图1-7可以看出，油物镜具有较高的数值孔径，因为透过油进入到物镜的光线比透过空气进入的多，使物镜的聚光能力增强，从而提高物镜的鉴别能力。物镜物镜试样试样R2R1R1R2R1R1R2R2jj=300 空气n=1 油n=1.52（a）干物镜 （b）油物镜图1-7 不同介质对物镜聚光能力的比较以上是光学显微镜一些重要的性质与光学原理，以下是光学显微镜几种特殊情况，或者说具有更特异性功能的光学显微镜：暗视野显微镜明视野显微镜的的照明光线直接进入视野，属透射照明。生活的细菌在明视野显微镜下观察是透明的，不易看清。而暗视野显微镜则利用特殊的聚光器实现斜射照明，给样品照明的光不直接穿过物镜，而是由样品反射或折射后再进入物镜（图 2-9），因此，整个视野是暗的，而样品是明亮的。正如我们在白天看不到的星辰却可在黑暗的夜空中清楚地显现一样，在暗视野显微镜中由于样品与背景之间的反差增大，可以清晰地观察到在明视野显微镜中不易看清的活菌体等透明的微小颗粒。而且，即使所观察微粒的尺寸小于显微镜的分辨率，依然可以通过它们散射的光而发现其存在。因此，暗视野法主要用于观察生活细菌的运动性。相差显微镜光线通过比较透明的标本时，光的波长（颜色）和振幅（亮度）都没有明显的变化，因此，用普通光学显微镜观察未经染色的标本（如活的细胞）时，其形态和内部结构往往难以分辨。然而，由于细胞各部分的折射率和厚度的不同，光线通过这种标本时，直射光和衍射光的光程就会有差别。随着光程的增加或减少，加快或落后的光波的相位会发生改变（产生相位差）。光的相位差人肉眼感觉不到，但相差显微镜配备有特殊的光学装置环状光阑和相差板，利用光的干涉现象，能将光的相位差转变为人眼可以察觉的振幅差（明暗差），从而使原来透明的物体表现出明显的明暗差异，对比度增强。正由于样品的这种反差是以不同部位的密度差别为基础形成的，因此，相差显微镜使人们能在不染色的情况下比较清楚地观察到在普通光学显微镜和暗视野显微镜下都看不到或看不清的活细胞及细胞内的某些细微结构。它比通常的显微镜要增加下列附件： (1) 装有相位板(相位环形板)的物镜，相位差物镜。 (2) 附有相位环(环形缝板)的聚光镜，相位差聚光镜。 (3) 单色滤光镜-(绿)。 各种元件的性能说明 (1) 相位板使直接光的相位移动 90，并且吸收减弱光的强度，在物镜后焦平面的适当位置装置相位板，相位板必须确保亮度，为使衍射光的影响少一些，相位板做成环形状。 (2) 相位环(环状光圈)是根据每种物镜的倍率，而有大小不同，可用转盘器更换。 (3) 单色滤光镜系用中心波长546nm(毫微米)的绿色滤光镜。通常是用单色滤光镜入观察。相位板用特定的波长，移动90看直接光的相位。当需要特定波长时，必须选择适当的滤光镜，滤光镜插入后对比度就提高。此外，相位环形缝的中心，必须调整到正确方位后方能操作，对中望远镜就是起这个作用部件。荧光显微镜有些化合物（荧光素）可以吸收紫外线并转放出一部分为光波较长的可见光，这种现象称为荧光。因此，在紫外线的照射下，发荧光的物体会在黑暗的背景下表现为光亮的有色物体，这就是荧光显微技术的原理。由于不同荧光素的激发波长范围不同，因此同一样品可以同时用二种以上的荧光素标记，它们在荧光显微镜下经过一定波长的光激发发射出不同颜色的光。荧光显微技术在免疫学、环境微生物学、分子生物学中应用十分普遍。在萤光显微镜上，必须在标本的照明光中，选择出特定波长的激发光，以产生荧光，然后必须在激发光和荧光混合的光线中，单把荧光分离出来以供观察。因此，在选择特定波长中，滤光镜系统，成为极其重要的角色。 荧光显微镜原理： (A) 光源：光源辐射出各种波长的光(以紫外至红外)。 (B) 激励滤光源：透过能使标本产生萤光的特定波长的光，同时阻挡对激发萤光无用的光。 (C) 荧光标本：一般用荧光色素染色。 (D) 阻挡滤光镜：阻挡掉没有被标本吸收的激发光有选择地透射荧光，在荧光中也有部分波长被选择透过。 以紫外线为光源，使被照射的物体发出荧光的显微镜。偏光显微镜偏光显微镜是用于研究所谓透明与不透明各向异性材料的一种显微镜。凡具有双折射的物质，在偏光显微镜下就能分辨的清楚，当然这些物质也可用染色法来进行观察，但有些则不可能，而必须利用偏光显微镜。 （1）偏光显微镜的特点 将普通光改变为偏振光进行镜检的方法，以鉴别某一物质是单折射（各向同行）或双折射性（光束入射到各向异性的晶体，分解为两束光而沿不同方向折射的现象。它们为振动方向互相垂直的线偏振光。这样的晶体可以理解为不均匀介质）。双折射性是晶体的基本特性。因此，偏光显微镜被广泛地应用在矿物、化学等领域，在生物学和植物学也有应用。 （2）偏光显微镜的基本原理 偏光显微镜的原理比较复杂，在此不作过多介绍,偏光显微镜必须具备以下附件：起偏镜，检偏镜，补偿器或相位片，专用无应力物镜，旋转载物台。共聚焦显微镜从一个点光源发射的探测光通过透镜聚焦到被观测物体上，如果物体恰在焦点上，那么反射光通过原透镜应当汇聚回到光源，这就是所谓的共聚焦，简称共焦。激光扫描共聚焦显微镜Confocal Laser Scanning Microscope(CLSM或LSCM)在反射光的光路上加上了一块半反半透镜(dichroic mirror)，将已经通过透镜的反射光折向其它方向，在其焦点上有一个带有针孔(Pinhole)，小孔就位于焦点处，挡板后面是一个 光电倍增管(photomultiplier tube，PMT)。可以想像，探测光焦点前后的反射光通过这一套共焦系统，必不能聚焦到小孔上，会被挡板挡住。于是光度计测量的就是焦点处的反射光强度。其意义是：通过移动透镜系统可以对一个半透明的物体进行三维扫描。金相显微镜金相显微镜是对金属内部结构进行分析与鉴定的显微镜，对镜片要求较高。上面提到的滤光镜片等等参数实际上是在金相显微镜中的细致要求，一般的生物学观测并不局限于上面的细致的规定，但成像原理并无区别2.电子显微镜透射电子显微镜图1.3图1.2透射电子显微镜的光路原理图因电子束穿透样品后，再用电子透镜成像放大而得名。，由于电子束的穿透力很弱，因此用于电镜的标本须制成厚度约50nm左右的超薄切片。这种切片需要用超薄切片机制作。电子显微镜的放大倍数最高可达近百万倍、由照明系统、成像系统、真空系统、记录系统、电源系统5部分构成，如果细分的话：主体部分是电子透镜和显像记录系统，由置于真空中的电子枪、聚光镜、物样室、 物镜、衍射镜、中间镜、 投影镜、荧光屏和照相机。电子光学部分整个电子光学部分完全置于镜筒之内，自上而下顺序排列着电子枪、聚光镜、样品室、 物镜、中间镜、投影镜、观察室、荧光屏、照相机构等装置。根据这些装置的功能不同又可将电子光学部分分为照明系统、样品室、成像系统及图像观察和记录系统。图1.3为透射电子显微镜电子光学部分示意图。1照明系统照明系统由电子枪、聚光镜和相应的平移对中及倾斜调节装置组成。它的作用：是为成像系统提供 一束亮度高、相干性好的照明光源。为满足暗场成像的需要照明电子束可在2-3度范围内倾斜。电子枪。它由阴极、栅极和阳极构成。 在真空中通电加热后使从阴极发射的电子获得较高的动能形成定向高速电子流。聚光镜。聚光镜的作用是会聚从电子枪发射出来的电子束，控制照明孔径角、电流密度和光斑尺寸。图1.4 照明系统示意图 2样品室样品室中有样品杆、样品杯及样品台。其位于照明部分和物镜之间，它的主要作用是通过试样台承载试样，移动试样。 3成像系统 一般由物镜、中间镜和投影镜组成。中间镜和投影镜的作用是将来自物镜的图像进一步放大。成像系统补充说明：a) 由物镜、中间镜(1、2个)和投影镜(1、2个)组成。b) 成像系统的两个基本操作是将衍射花样或图像投影到荧光屏上。c) 通过调整中间镜的透镜电流，使中间镜的物平面与物镜的背焦面重合，可在荧光屏上得到衍射花样。d) 若使中间镜的物平面与物镜的像平面重合则得到显微像。图1.5 透射电镜成像系统的两种基本操作：（a）将衍射谱投影到荧光屏；（b）将显微像投影到荧光屏4图像观察与记录系统 该系统由荧光屏、照相机、数据显示等组成在分析电镜中，还有探测器和电子能量分析等附件，见图1.6。图1.6 透射电镜图像观察与记录系统示意图1.1.2真空系统真空系统由机械泵、油扩散泵、换向阀门、真空测量仪泵及真空管道组成。它的作用是排除镜筒内气体，使镜筒真空度至少要在10-3 pa以上。如果真空度低的话，电子与气体分子之间的碰撞引起散射而影响衬度，还会使电子栅极与阳极间高压电离导致极间放电，残余的气体还会腐蚀灯丝，污染样品。 1.1.3供电控制系统加速电压和透镜磁电流不稳定将会产生严重的色差及降低电镜的分辨本领，所以加速电压和透镜电流的稳定度是衡量电镜性能好坏的一个重要标准。透射电镜的电路主要由高压直流电源、透镜励磁电源、偏转器线圈电源、电子枪灯丝加热电源，以及真空系统控制电路、真空泵电源、照相驱动装置及自动曝光电路等部分组成。另外，许多高性能的电镜上还装备有扫描附件、能谱议、电子能量损失谱等仪器。它的光路与光学显微镜相仿，可以直接获得一个样本的投影。通过改变物镜的透镜系统人们可以直接放大物镜的焦点的像。由此人们可以获得电子衍射像。使用这个像可以分析样本的晶体结构。在这种电子显微镜中，图像细节的对比度是由样品的原子对电子束的散射形成的。由于电子需要穿过样本，因此样本必须非常薄。组成样本的原子的原子量、加速电子的电压和所希望获得的分辨率决定样本的厚度。样本的厚度可以从数纳米到数微米不等。原子量越高、电压越低，样本就必须越薄。样品较薄或密度较低的部分，电子束散射较少，这样就有较多的电子通过物镜光栏，参与成像，在图像中显得较亮。反之，样品中较厚或较密的部分，在图像中则显得较暗。如果样品太厚或过密，则像的对比度就会恶化，甚至会因吸收电子束的能量而被损伤或破坏。 透射式电子显微镜镜筒的顶部是电子枪，电子由钨丝热阴极发射出、通过第一，第二两个聚光镜使电子束聚焦。电子束通过样品后由物镜成像于中间镜上，再通过中间镜和投影镜逐级放大，成像于荧光屏或照相干版上。中间镜主要通过对励磁电流的调节，放大倍数可从几十倍连续地变化到几十万倍；改变中间镜的焦距，即可在同一样品的微小部位上得到电子显微像和电子衍射图像。为了能研究较厚的金属切片样品，法国杜洛斯电子光学实验室研制出加速电压为3500千伏的超高压电子显微镜。 在能量过滤透过式电子显微镜（Energy Filtered Transmission Electron Microscopy，EFTEM）中人们测量电子通过样本时的速度改变。由此可以推测出样本的化学组成，比如化学元素在样本内的分布。关于衍射的原理，简单的引入惠更斯菲涅尔原理（1）惠更斯原理图2-1-33惠更斯指出，由光源发出的光波，在同一时刻t时它所达到的各点的集合所构成的面，叫做此时刻的波阵面（又称为波前），在同一波阵面上各点的相位都相同，且波阵面上的各点又都作为新的波源向外发射子波，子波相遇时可以互相叠加，历时t后，这些子波的包络面就是t+t时刻的新的波阵面。波的传播方向与波阵面垂直，波阵面是一个平面的波叫做平面波，其传播方向与此平面垂直，波阵面是一个球面（或球面的一部分）的波叫做球面波，其传播方向为沿球面的半径方向,如图2-1-33（2）菲涅耳对惠更斯原理的改进（惠菲原理）波面S上每个面积单元都可看作新的波源，它们均发出次波，波面前方空间某一点P的振动可以由S面上所有面积所发出的次波在该点迭加后的合振幅来表示。面积元ds所发出各次波的振幅和位相符合下列四个假设：在波动理论中，波面是一个等位相面，因而可以认为面上名点所发出的所有次波都有相同的初位相（可令）。SPN图2-1-34次波在P点处的振幅与r成反比。从面积元所发出的次波的振幅正比于的面积，且与倾角有关，其中为ds的法线N与ds到P点的连线r之间的夹角，即从ds发出的次波到达P点时的振幅随的增大而减小（倾斜因数）。次波在P点处的位相，由光程决定 。也就是说，一束波穿过一个缝之后，就相当于以这个缝上的点为波源重新向外发出与原来等速的子波，而子波到底以多大的张角向什么方向发出，是子波之间共同干涉的结果，涉及到E=CK()/rcos2（t/T-r/）dS这个公式，是一个倾斜因子函数，不加以解释。扫描电子显微镜扫描电镜的电子束不穿过样品，仅以电子束尽量聚焦在样本的一小块地方，然后一行一行地扫描样本。入射的电子导致样本表面被激发出次级电子。显微镜观察的是这些每个点散射出来的电子，放在样品旁的闪烁晶体接收这些次级电子，通过放大后调制显像管的电子束强度，从而改变显像管荧光屏上的亮度。显像管的偏转线圈与样品表面上的电子束保持同步扫描，这样显像管的荧光屏就显示出样品表面的形貌图像，这与工业电视机的工作原理相类似。由于这样的显微镜中电子不必透射样本，因此其电子加速的电压不必非常高。 扫描式电子显微镜的分辨率主要决定于样品表面上电子束的直径。放大倍数是显像管上扫描幅度与样品上扫描幅度之比，可从几十倍连续地变化到几十万倍。扫描式电子显微镜不需要很薄的样品；图像有很强的立体感；能利用电子束与物质相互作用而产生的次级电子、吸收电子和X射线等信息分析物质成分。 扫描式电子显微镜的电子枪和聚光镜与透射式电子显微镜的大致相同，但是为了使电子束更细，在聚光镜下又增加了物镜和消像散器，在物镜内部还装有两组互相垂直的扫描线圈。物镜下面的样品室内装有可以移动、转动和倾斜的样品台。 场发射扫描电子显微镜（FESEM）是一种比较简单的扫描电子显微镜，它观察样本上因强电场导致的场发射所散发出来的电子。 假如观察的是透过样本的扫描电子的话，那么这种显微镜被称为扫描透射电子显微镜（Scanning Transmission Electron Microscopy，STEM）扫描电子显微镜由三大部分组成：真空系统，电子束系统以及成像系统。真空系统真空系统主要包括真空泵和真空柱两部分。真空柱是一个密封的柱形容器。 真空泵用来在真空柱内产生真空。有机械泵、油扩散泵以及涡轮分子泵三大类，机械泵加油扩散泵的组合可以满足配置钨枪的SEM的真空要求，但对于装置了场致发射枪或六硼化镧枪的SEM,则需要机械泵加涡轮分子泵的组合。 成象系统和电子束系统均内置在真空柱中。真空柱底端即为右图所示的密封室，用于放置样品。之所以要用真空，主要基于以下两点原因： 电子束系统中的灯丝在普通大气中会迅速氧化而失效，所以除了在使用SEM时需要用真空以外，平时还需要以纯氮气或惰性气体充满整个真空柱。 为了增大电子的平均自由程，从而使得用于成象的电子更多。 1.2电子束系统 电子束系统由电子枪和电磁透镜两部分组成，主要用于产生一束能量分布极窄的、电子能量确定的电子束用以扫描成象。 电子枪 电子枪用于产生电子，主要有两大类，共三种。 一类是利用场致发射效应产生电子，称为场致发射电子枪。这种电子枪极其昂贵，在十万美元以上，且需要小于10-10torr的极高真空。但它具有至少1000小时以上的寿命，且不需要电磁透镜系统。 另一类则是利用热发射效应产生电子，有钨枪和六硼化镧枪两种。钨枪寿命在30100小时之间，价格便宜，但成象不如其他两种明亮，常作为廉价或标准SEM配置。六硼化镧枪寿命介于场致发射电子枪与钨枪之间，为2001000小时，价格约为钨枪的十倍，图像比钨枪明亮510倍，需要略高于钨枪的真空，一般在10-7torr以上；但比钨枪容易产生过度饱和和热激发问题。 电磁透镜 热发射电子需要电磁透镜来成束，所以在用热发射电子枪的SEM上，电磁透镜必不可少。通常会装配两组： 汇聚透镜：顾名思义，汇聚透镜用汇聚电子束，装配在真空柱中，位于电子枪之下。通常不止一个，并有一组汇聚光圈与之相配。但汇聚透镜仅仅用于汇聚电子束，与成象会焦无关。 物镜：物镜为真空柱中最下方的一个电磁透镜，它负责将电子束的焦点汇聚到样品表面。 1.3成像系统 电子经过一系列电磁透镜成束后，打到样品上与样品相互作用，会产生次级电子、背散射电子、欧革电子以及X射线等一系列信号。所以需要不同的探测器譬如次级电子探测器、X射线能谱分析仪等来区分这些信号以获得所需要的信息。虽然X射线信号不能用于成象，但习惯上，仍然将X射线分析系统划分到成象系统中。 。3.探针显微镜原子力显微镜（1）原子力显微镜结构 AFM的原理较为简单，它是用微小探针“摸索”样品表面来获得信息如图1所示，当针尖接近样品时，针尖受到力的作用使悬臂发生偏转或振幅改变。悬臂的这种变化经检测系统检测后转变成电信号传递给反馈系统和成像系统，记录扫描过程中一系列探针变化就可以获得样品表面信息图像。图1下面分别介绍检测系统、扫描系统和反馈控制系统。1. 检测系统 悬臂的偏转或振幅改变可以通过多种方法检测，包括：光反射法、光干涉法、隧道电流法、电容检测法等。目前AFM系统中常用的是激光反射检测系统，它具有简便灵敏的特点。激光反射检测系统由探针、激光发生器和光检测器组成.2. 探针 探针是AFM检测系统的关键部分。它由悬臂和悬臂末端的针尖组成随着精细加工技术的发展，人们已经能制造出各种形状和特殊要求的探针。悬臂是由Si或Si3N4经光刻技术加工而成的。悬臂的背面镀有一层金属以达到镜面反射。在接触式AFM中V形悬臂是常见的一种类型(如图2所示)。图2 它的优点是具有低的垂直反射机械力阻和高的侧向扭曲机械力阻。悬臂的弹性系数一般低于固体原于的弹性系数，悬臂的弹性常数与形状、大小和材料有关。厚而短的悬臂具有硬度大和振动频率高的特点。3. 光电检测器AFM光信号检测是通过光电检测器来完成的。激光由光源发出照在金属包覆的悬臀上，经反射后进入光电二极管检测系统。然后，通过电子线路把照在两个二极管上的光量差转换成电压信号方式来指示光点位置。4. 扫描系统 AFM对样品扫描的精确控制是靠扫描器来实现的。扫描器中装有压电转换器。压电装置在X，Y，Z三个方向上精确控制样品或探针位置。目前构成扫描器的基质材料主要是钛锆酸铅Pb(Ti,Zr)O3制成的压电陶瓷材料。压电陶瓷有压电效应，即在加电压时有收缩特性，并且收缩的程度与所加电压成比例关系。压电陶瓷能将1mv1000V的电压信号转换成十几分之一纳米到几微米的位移。 5. 反馈控制系统 AFM反馈控制是由电子线路和计算机系统共同完成的。AFM的运行是在高速、功能强大的计算机控制下来实现的。控制系统主要有两个功能：(1)提供控制压电转换器X-Y方向扫描的驱动电压；(2)在恒力模式下维持来自显微镜检测环路