常用试剂与培养基.doc

第九章 微生物实验室常用试剂与培养基 第一节 常用试剂及其使用方法一、诊断用纸片1.杆菌肽纸片（0.04U/片），抑菌圈10mm为敏感。质控菌株 A群链球菌阳性 D群链球菌阴性 2.SMZ纸片（1.25g/23.75g/片），出现抑菌圈即为敏感。质控菌株 D群链球菌阳性 A群链球菌阴性 3.新生霉素纸片（5.0g/片），抑菌圈16mm为敏感。质控菌株 表皮葡萄球菌阳性 腐生葡萄球菌阴性 4.O129纸片、奥普托欣（Optochin）纸片参见第五节生化试验培养基。二、诊断用血清1.沙门菌属诊断血清A-F群O多价血清特异O群因子血清 常用的有O2，O4，O7，O9，O10特异H因子血清 常用的有Ha，Hb，Hc，Hd，Hgm，Hi，Hf、Vi因子血清。 2.志贺菌属诊断血清 志贺菌属四种多价血清（含有痢疾志贺、福氏、宋内志贺） 痢疾志贺菌、血清。 福氏志贺菌多价血清及分型血清（1-6型）。 宋内志贺菌诊断血清（除光滑相抗血清外，能制备粗糙相抗血清）。 鲍氏志贺菌多价血清及分型血清。3.致病性大肠埃希菌诊断血清肠致病性大肠埃希菌（EPEC）诊断血清。产肠毒素大肠埃希菌（ETEC）诊断血清。肠侵袭性大肠埃希菌（EIEC）诊断血清。肠出血性大肠埃希菌（EHEC）诊断血清O157：H7。 4.霍乱弧菌O1、O139混合多价诊断血清及稻叶、小川、彦岛O139分型血清。 5.脑膜炎奈瑟菌多价血清及分群血清。 6.链球菌分类诊断血清。 7.肺炎链球菌诊断血清。8.耶尔森菌诊断血清。三、常用染色液(一)革兰染色液1. 结晶紫溶液A液 结晶紫 20g 95%乙醇 20mlB液 草酸铵 0.8g蒸馏水 80ml需在用前24小时将A液. B液混合,过滤后装入试剂瓶内备用。2.碘液 碘 1g碘化钾 2g蒸馏水 300ml将碘与碘化钾混合并研磨,加入几毫升水, 使其逐渐溶解,然后研磨,继续加入少量蒸馏水至完全溶解。最后补足水量。也可用少量蒸馏水将碘化钾完全溶解,再加入碘片,待完全溶解后,加水至300ml。3.脱色液 95%乙醇4.复染液A贮存液 沙黄 2.5g 95%乙 100mlB应用液:A液 10ml蒸馏水 90ml(二)抗酸染色液1碱性复红染色液(1)萋纳石炭酸复红溶液碱性复红乙醇饱和溶液 10ml5%石炭酸溶液 90ml(2)脱色液浓盐酸 3ml95%乙醇 97ml(3)复染液(吕弗勒美蓝液)美蓝乙醇饱和溶液 30ml100g/L氢氧化钾 0.1ml蒸馏水 100ml2.金胺0-罗丹明B染色液(1) 罗丹明B液 罗丹明B0.1g加蒸馏水100ml。(2)1g/L金胺O液 金胺O液0.1g加蒸馏水95ml,再加入纯石炭酸 5ml,混匀。(3)3%盐酸酒精(4)稀释美蓝液 吕弗勒美蓝液100ml,加蒸馏水90ml,混匀。(三)鞭毛染色液(改良Ryu法)A液 5%石炭酸 10ml鞣酸 2g饱和硫酸铝钾液 10mlB液 结晶紫酒精饱和液 应用液A液10份,B液1份,混合,室温存放备用。(四)异染颗粒染色液甲液 甲苯胺蓝 0.15g孔雀绿 0.2g95% 乙醇 2.0ml蒸馏水 100ml乙液 碘 2g 碘化钾 3g 蒸馏水 300ml先将碘化钾加入少许蒸馏水(约2ml),充分振摇,待完全溶解,再中入碘,使完全溶解后, 加蒸馏水至300ml。(五)荚膜染色液1印度墨汁或50g/L黑色素水溶液25g/L苯胺兰水溶液第二节 基础培养基一、液体基础培养基(一)蛋白胨水(Peptone water)用途 1.供细菌靛基质试验用。 2.一般细菌培养和传代。 配法 蛋白胨（或胰蛋白胨） 10g Nacl 5g 蒸馏水 1L pH 7.2 将上述成分溶于水中，校正pH,分装试管，每管23ml，置121灭菌15min备用。 质量控制大肠埃希菌 生长良好，靛基质阳性；伤寒沙门菌 生长良好，靛基质阴性。(二)营养肉汤(Nutrient broth)用途 供一般细菌的增菌培养，加入1%的琼脂粉亦可作营养琼脂。配法 蛋白胨 10g 牛肉膏 3gNacl 5g蒸馏水 1LpH 7.4 将上述成分称量混合溶解于水中，校正pH，按用途不同分装于烧瓶或试管内。经121灭菌15min，作无菌试验后冷藏备用。 质量控制 金黄色葡萄球菌、伤寒沙门菌、化脓性链球菌 生长良好。保存 置冰箱3周内用完。 (三)牛肉浸液培养基 用途 细菌培养最基础的培养基，除用于一般细菌的培养外，又可以作营养琼脂及其它培养基的基础。 配法 新鲜除脂牛肉 500g Nacl 5g 蛋白胨 10g 蒸馏水 1L pH 7.47.6 1.先将牛肉清洗，除脂肪、肌腱，并切块绞碎。称取500g置容器加入蒸馏水1L，搅匀后置冰箱过夜，次日煮沸加热30min，并用玻棒不时搅拌用绒布或麻布进行粗过滤，再用脱脂棉过滤即成。在过滤中加入蛋白胨10g、氯化钠5g溶解后，用NaOH溶液矫正pH至7.67.8，并加热煮沸10min，补充蒸馏水至1L，最后用滤纸过滤，呈清晰透明、淡黄色液体，经12115min灭菌备用。 2.根据用途不同可以制成营养肉汤，以此为基础制成其它培养基。如制作固体培养基，加入琼脂15g/L20g/L即可。质量控制 金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、伤寒沙门菌、痢疾志贺菌等均生长良好。 保存 置4冰箱内可以使用较长时间。注:商品牛肉浸膏粉，一般使用量为3g/L5g/L。二、固体基础培养基 (一)营养琼脂(Nutrient agar) 用途 供一般细菌和菌株的纯化及传种用。 配法 蛋白胨 10g 牛肉膏 3g Nacl 5g 琼脂粉（优质） 12g 蒸馏水 1L pH 7.27.4 将上述成分(除琼脂外)溶于水中，校正pH后加入琼脂，煮沸溶解，根据用途不同进行分装，经121灭菌15min，倾注平板或制成斜面，冷藏备用。 质量控制 金黄色葡萄球菌 菌落浅黄色； 痢疾志贺菌 菌落无色；铜绿假单胞菌 菌落无色或浅绿色。保存 置4冰箱保存，两周内用完。 (二)血琼脂培养基(Blood agar medium) 用途 供一般病原菌的分离培养和溶血性鉴别及保存菌种用。配法 pH7.47.6牛肉浸液琼脂 100ml 脱纤维羊血(或兔血) 510ml 将血琼脂基础经121灭菌15min，待冷却至50左右以无菌手续加入羊血，摇匀后立即倾注灭菌平皿内，待凝固后，经无菌实验冷藏备用。 质量控制 化脓性链球菌ATCC 19615生长良好，-溶血；肺炎链球菌ATCC 6303生长良好，-溶血；表皮葡萄球菌ATCC 12228 生长良好,不溶血。保存 置4冰箱，1周内用完。 (三)巧克力琼脂培养基 用途 主要用于嗜血杆菌的分离培养，亦可用于奈瑟菌的增殖培养。 配法 鲜牛肉浸出液 1L蛋白胨 10g Nacl 5g 琼脂粉 12g 无菌脱纤维羊血或兔血 100ml 将上述成分（除兔血外）加热溶解，调pH7.2，置12115min高压灭菌，待冷至约85，以无菌方法加入兔血，摇匀后置85水浴中，维持该温度10min，使之成巧克力色。取出置室温冷至约50，倾注平板或制成斜面备用。 质量控制 流感嗜血杆菌ATCC 10211、肺炎链球菌ATCC 6305生长良好，菌落典型。保存 置4冰箱，1周内用完。 (四)胱氨酸胰化酪蛋白琼脂（CTA）用途 常用于测定脑膜炎奈瑟菌和淋病奈瑟菌以及营养要求较高细菌的糖发酵试验。 配法 胱氨酸 0.5g 胰化酪蛋白 20g NaCl 5g 亚硫酸钠 0.3g 琼脂 3.5g 酚红 0.0175g 蒸馏水 1L 将上述成分（酚红除外）混合溶解，调pH至7.2，加入酚红指示剂。分装试管，11515min灭菌。用于测定糖发酵时，按需要加入各种糖溶液，将待检标本直接种于培养基管内，置35孵箱，18h24h观察结果。培养基由红色变为黄色为阳性，不变色为阴性。第三节 保存和增菌培养基一、菌种保存培养基 (一)疱肉培养基(Chopped meat medium) 配法 牛肉渣 0.5g 牛肉浸液（pH7.6） 7ml 将干燥的肉渣0.5克装入15mm150mm试管内，再加入pH7.6牛肉浸液7ml，两者高度比例为12。在试管液面上加一层34mm高度的融化凡士林，用橡皮塞塞紧，经121灭菌15min后，置4冰箱备用。质量控制破伤风杆菌或坏死梭杆菌48h的培养物，稀释1000倍，每管接种0.01ml，生长良好。保存置4冰箱内，数月有效。(二)半固体培养基(Semi-solid medium) 配法 蛋白胨 10g 牛肉膏 5g NaCl 3g Na2HPO412H2O 2g 琼脂粉 4.5g 蒸馏水 1L pH 7.47.6 将上述成分混合于水中，加热溶解，调pH至7.47.6，分装试管内的2/3左右的高度，12115min高压灭菌，备用。 质量控制 大肠埃希菌(ATCC25922)生长良好,动力阳性。 福氏志贺菌(ATCC12022)生长良好,动力阴性。 金黄色葡萄球菌(ATCC25923)生长良好,动力阴性。培养基呈淡黄色半固体状。二、增菌培养基(enrichment medium) (一)葡萄糖肉汤 用途 用于血液增菌。 配法 蛋白胨(或月示 胨) 10g NaCl 5g 肉浸液（或心浸液） 1L 葡萄糖 3g 枸橼酸钠 3g 5g/L对氨基苯甲酸水溶液 10ml 1mol/L MgSO47H2O 20ml 青霉素酶 1000U 将蛋白胨、NaCl混合于肉浸液中加热溶解，再加入葡萄糖、枸橼酸钠、对氨苯甲酸及硫酸镁，继续煮沸5min，并补足失水，调整pH至7.8。过滤分装，每瓶50ml，高压灭菌11520min后，每瓶加入青霉素酶50U，经无菌试验合格后，冷却备用。 将采取的血液标本，以无菌手续注入培养瓶中（血液1ml，培养液10ml），置35培养箱内，每日取出观察一次结果。如有细菌生长，可出现数种不同的表现，应随时作分离培养，可选用血琼脂、EMB及巧克力平板等。无细菌生长表现的培养瓶，需连续观察7天，仍无细菌生长方可弃去。在观察的过程中，至少应作两次分离培养。注:1.枸橼酸钠为抗凝剂，使血液加入培养基中不凝固。 2.对氨基苯甲酸主要能中和血液中磺胺类药物的抑菌作用。 3.硫酸镁主要能破坏血液中存在的四环素、金霉素、新霉素、多粘菌素及链霉素的抑菌作用。4.本培养基近年来有许多改良配方，如加入0.3%0.5%酵母浸膏以增加营养；加0.2%核酸刺激细菌生长；加0.1%粘液素能被覆于细菌的表面，保护细菌免受抗体破坏；加入聚茴香脑磺酸钠（SPS）能中和补体抗药作用提高检出率。 (二)血液增菌培养基(Blood enriched medium) 用途 供血液和骨髓液病原菌的增菌培养用。 配法 蛋白胨 10g Nacl 5g 牛肉膏 3g 葡萄糖 1g 酵母膏粉 3g 枸橼酸钠 3g K2HPO4 2g 5g/L对氨基苯甲酸 5ml 1mol/LMgSO4。7H2O 20ml 4g/L酚红溶液 6ml 青霉素酶 50U 聚茴香脑磺酸钠(SPS) 0.3g 蒸馏水 1L pH 7.4 将上述成分（除酚红指示剂、青霉素酶外）混合加热溶解，校正pH至7.4，再加酚红，过滤分装每瓶3050ml，经121灭菌15min经3524h无菌试验备用。临用时每瓶加入1.52.5U青霉素酶。质量控制 伤寒沙门菌ATCC 50096、白色念珠菌ATCC 10231、化脓性链球菌ATCC 19615、肺炎链球菌ATCC 6305、金黄色葡萄菌ATCC 25923、铜绿假单胞菌ATCC 27853均生长良好。 (三)亚硒酸盐增菌培养基(SF)（Selenite enrichment medium） 用途 供沙门菌增菌培养用。 配法 蛋白胨 5g 乳糖 4g 磷酸氢二钠 4.5g 磷酸二氢钠 5.5g 亚硒酸氢钠 4g 蒸馏水 1L pH 7.07.1 先将亚硒酸盐加到200ml蒸馏水中，充分摇匀溶解。其它成分称量混合，加入蒸馏水800ml，加热溶解，待冷却后两液混合，充分摇匀，校正pH7.07.1(调整磷酸盐缓冲对的比例来校正pH值)。最后分装于15mm150mm的试管内，每管10ml。置水浴隔水煮沸10min15min，立即冷却，置4冰箱保存备用。 取新鲜便例标本1g或棉拭子采样直接种于该培养管内。摇动后置35培养过夜，如发现均匀混浊，管底有红色沉淀物，表示细菌生长。然后取培养物分离在选择性培养基上，如SS琼脂、HE琼脂或麦康凯平板等，进行培养。质量控制培养基应呈淡黄色或无色，透明无沉淀物。增菌灵敏度 伤寒沙门菌110-5，鼠伤寒及副伤寒沙门菌110-7。保存 4保存，1周内用完。 注：1.亚硒酸盐，包括亚硒酸钠、亚硒酸氢钠、原则上均可使用。但以亚硒酸氢钠效果为好。 2.磷酸盐缓冲对，两者的用量比例与含量和亚硒酸盐及蛋白胨的品种有关。制备前应进行调试，其总量为10g/L。 3.在制备过程中，亚硒酸盐不能直接加热。隔水煮沸时间亦不能超过规定时间，否则亚硒酸盐会变质，生成红色沉淀物，而降低抑制性。4.培养基应呈淡黄色，有红色沉淀物出现时不可再用。 (四)SS增菌液(Salmonella Shigela Enrichment Broth) 用途 用于沙门、志贺菌的增菌。 配法月示 胨 2g蛋白胨 8g 牛肉膏 3.5g 酵母膏 2g 葡萄糖 2g 枸橼酸铁 10g 硫代硫酸钠 10g 亚硫酸钠 0.7g 胆盐 5.5g Na2HPO4 4g KH2PO4 0.1g 去氧胆酸钠(进口) 1.5g煌绿 0.005g 蒸馏水 1L pH 7.1 将上述成分加热溶于水中，分装试管（150mm15mm），每管57ml，隔水煮沸5min备用。 取病人粪便标本1g直接种于增菌液内，3516h18h培养，取出分离平板即可。 质量控制 培养基应呈淡黄色或略呈淡绿色。伤寒沙门菌ATCC50096,福氏志贺菌ATCC12022 生长良好；大肠埃希菌ATCC25922 抑制生长。 注：1.切勿高压，隔水煮沸时间不宜超过5min。 2.煌绿用量应根据不同批号酌情增减。 (五)碱性蛋白胨水(Alkaline peptone water) 用途 供霍乱弧菌增菌培养用。 配法 蛋白胨 20g Nacl 5g 蒸馏水 100ml pH 8.6 将上述成分溶解于水中,校正pH，分装于试管810ml，经12115min灭菌备用。 将待检标本接种到碱性胨水中，置35培养6h8h，取表面菌液一白金环移种到碱性琼脂、庆大琼脂或TCBS琼脂平板上。必要时做第二次增菌。（经6h8h培养，霍乱弧菌呈均匀混浊生长，表面有菌膜出现。）质量控制 各实验室自配或采用商品培养基，用前有条件的实验室可用标准菌株，一般临床实验室可用非01群弧菌，生长良好者方可使用。霍乱弧菌E1-Tor生物型和副溶血弧菌 生长良好（6h）；大肠埃希菌ATCC25922 不生长（6h）。保存 置4冰箱，2周内用完。注：若在碱性胨水中加入1%亚碲酸钾0.51ml/L，则成为亚碲酸钾碱性胨水，其增菌效果更为理想。第四节 分离培养基 一、革兰阳性杆菌分离培养基 (一)罗-琴改良培养基（Lowenstein-Jenden medium）用途 供结核分枝杆菌培养用。 配法 KH2PO4 2.4g MgSO47H2O6 0.24g 枸橼酸镁(或枸橼酸钠) 0.6g 天门冬素 3.6g 甘油(纯) 12ml 蒸馏水 600ml 马铃薯淀粉 30g 新鲜鸡卵液 1L 2%孔雀绿水溶液 20ml 先将磷酸盐、硫酸镁、枸橼酸镁、天门冬素及甘油，加热溶解于600ml蒸馏水中。再添放马铃薯粉，边放边搅，并继续置沸水中加热30min，待冷却至60左右时，加入鸡卵液1L及孔雀绿溶液20ml，充分混匀后，用无菌操作分装于灭菌试管，每支56ml，塞紧橡皮塞（最好是翻口塞），置于血清凝固器内制成斜面，经851h间歇灭菌二次(或高压灭菌11520min)，待凝固后经无菌试验，4冷藏备用。 取晨咳痰或其它体液标本，经消化处理和离心沉淀的浓缩液0.1ml（约二滴）滴种于培养基的斜面上，尽量摇晃，置355%10%CO2温箱内培养14周，观察结果。凡在1周内发现生长的菌落，一般不可能是结核分枝杆菌；在2周后生长的菌落，呈奶油状，略带黄色，粗糙突起，不透明，即取菌进行涂片染色镜检，及作其鉴定。质量控制 自制或商品培养基在使用前，均应进行性能监测，符合要求者方可应用。保存置4冰箱内24周有效。 注：1.本培养基pH约为6.0左右，一般无须校正。 2.间歇灭菌的温度不宜超过90。 (二)血清斜面培养基(吕氏血清斜面) 用途 供白喉棒状杆菌培养用。配法1%葡萄糖肉汤(pH7.6) 100ml 无菌动物血清(牛羊猪兔) 300ml 将上述成分混合后，分装于试管内，每管约45ml。斜插在血清凝固器内（或蒸笼）加热808530min，使血清凝固成斜面，冷却后放4冰箱内。取出后采用间歇灭菌法，85灭菌30min，连续3天，经无菌试验证明无杂菌生长即可应用。 将喉拭直接接种于上述斜面上，置35培养16h24h。白喉杆菌在上述培养基上，菌落呈圆形，表面光滑、完整，盐水中易乳化，用阿尔培脱染色，两极异染颗粒明显。 注：1.所用血清不能含有防腐剂。 2.该培养基不能高热灭菌，以防破坏其营养成分。3.配制时所有器皿、棉塞等均应高压灭菌。 (三)亚碲酸钾血琼脂 用途 分离白喉杆菌用 配法 蛋白胨 10g NaCl 5g 牛肉浸膏 3g 葡萄糖 2g 胱氨酸 0.05g 1%亚碲酸钾 45ml 脱纤维羊血 100ml 琼脂 2g 蒸馏水 900ml pH 7.6 先将蛋白胨、NaCl、牛肉膏、葡萄糖和胱氨酸加水加热溶解，调pH至7.6，加入琼脂，高压灭菌11515min备用。待冷至50左右，用无菌操作加入已灭菌的亚碲酸钾溶液及羊血，混匀倾注平板。将标本直接接种于亚碲酸钾平板上。置35孵箱，经24h48h培养，观察结果。白喉杆菌能使亚碲酸钾还原成金属碲而形成黑色和灰黑色的菌落。其它大部分细菌在此培养基上被抑制，故较易鉴别。 二、革兰阴性杆菌分离培养基 (一)弧菌分离培养基 1.碱性琼脂 用途 供霍乱弧菌分离培养用。 配法 蛋白胨 10g NaCl 5g 牛肉膏 3g 脂 20g 蒸馏水 1L pH 8.4 将上述成分混合于水中，加热溶解，校正pH至 8.4，分装后高压灭菌12115min倾注平板。 凡急性病人水样便在做增菌培养的同时，应直接取标本接种到碱性琼脂平板或亚碲酸钾琼脂平板上。置35培养12h16h，观察结果。霍乱弧菌生长较快，菌落大而扁平，呈青灰色，半透明，光滑湿润。在亚碲酸钾琼脂上菌落呈灰黑色。质量控制 各实验室凡自配或商品培养基,在使用前有条件的实验室可用标准菌株生长对照，临床实验室可送防疫部门所设立的专门检验机构进行目的菌监测,质量可靠者方可使用.EL-Tor弧菌 生长良好；大肠埃希菌ATCC 25922 抑制生长。保存 置4冰箱，1周内用完。 2.碱性胆盐琼脂(Alkaline bile-salt agar） 用途 用于霍乱弧菌的分离培养。 配法 蛋白胨 10g 牛肉膏 5g NaCl 5g10g 琼脂 20g 胆盐（牛、猪） 2.5g 蒸馏水 1L pH 8.4 将上述成分称量混合于水中加热溶解，校正pH，分装高压灭菌12115min，倾注平板。 取病人粪便标本或增菌培养物1接种环接种平板，置35温箱培养16h18h。霍乱弧菌迅速生长，其它细菌生长较缓慢。在16h18h，霍乱弧菌的菌落较大，直径可达2mm左右。呈扁平，青灰色，半透明，光滑湿润，易挑起。其它细菌菌落小而凸起，不透明，或有色素。质量控制 同碱性琼脂。保存 置冰箱，1周内用完。 3.庆大霉素琼脂(Gentamicin Agar) 用途 供霍乱弧菌分离培养用。 配法 蛋白胨 10g 牛肉膏 3g NaCl 5g 枸橼钠 10g 无水亚硫酸钠 3g 蔗糖(或白糖) 10g 琼脂 15g20g 庆大霉素,多粘菌素B“双抗液” 2ml 蒸馏水 1L pH 8.4 将上述成分(除双抗液外)称量混合于水中，加热溶解，校正pH，分装灭菌12115min，待冷却至50后，每100ml内加“双抗液”0.2ml，另加5g/L亚碲酸钾水溶液0.1ml，再倾注平板。最后每ml培养基内含有庆大霉素0.5U，多粘菌素B6U。 将粪便标本或增菌培养物划线接种到该平板上，置35培养16h18h。 由于该培养基抑制性强，其他非弧菌科细菌被抑制，而霍乱弧菌生长迅速，16h菌落可达2mm，菌落青灰色，半透明，扁平，光滑湿润。培养时间长，菌落略黄色、隆起，中心厚而不透明。质量控制霍乱弧菌(小川、稻叶)生长良好，培养18h24h菌落直径2.53.0mm；大肠埃希菌和变形杆菌抑制生长。（由于临床实验室不允许保存霍乱弧菌，实际工作中可用非01群弧菌代替）。保存 置4冰箱内，1周内用完。 注：1.该培养基国内有商品出售，多数产品已加入庆大霉素，使用时，应详阅说明书。2.“双抗液”配制 98ml灭菌蒸馏水中加庆大霉素(25，000U/ml)1ml，多粘菌B或抗敌E(300，000U/ml)1ml。4冰箱保存一个月用完。 4.四号琼脂(No.4 Agar) 用途 供分离霍乱弧菌用。 配法 蛋白胨 10g NaCl 5g 牛肉膏 3g 亚硫酸钠(无水) 3g 柠檬酸钠 10g 猪胆汁粉 5g 十二烷硫酸钠 20g 利凡诺（雷佛奴尔） 3g 琼脂粉 12g 庆大霉素亚碲酸钾混合液 1ml 蒸馏水 1L pH 8.0 将上述8种成分放入玻璃或搪瓷容器内(严禁用铝制容器等金属容器)，加入蒸馏水，加热溶解混合后，调整至pH8.0,然后按1.2%加入琼脂，煮沸至琼脂溶化后，冷至60左右，按每100ml琼脂加入庆大霉素亚碲酸钾混合液(1ml 40，000U庆大霉素加79ml蒸馏水混合后，加入0.8g亚碲酸钾溶解混合即成，每ml含500U的庆大霉素和10g/L亚碲酸钾)0.1ml，摇匀，倾注平板。 取待检标本划线接种平板，置35培养过夜。 8h后即可初步观察结果，24h培养霍乱弧菌呈中心黑色较大而扁平的菌落，较易鉴别。质量控制 配成的培养基呈亮黄色透明；EL-Tor弧菌稻叶型生长良好；EL-Tor弧菌小川型生长良好；大肠埃希菌ATCC25922抑制生长。 注：1.庆大和亚碲酸钾混合液应新鲜配制并置冰箱保存。2.雷夫奴尔应避光保存，而且每批均应预试后方可使用。成品培养基应避光保存。(二)肠杆菌分离培养基 1.中国蓝琼脂(Chinese blue Agar) 用途 系分离肠道菌的弱选择性培养基。 配法 肉膏汤琼脂(pH7.4) 1L 10g/L中国蓝水溶液(灭菌) 10ml 乳糖 10g 10g/L蔷薇红酸乙醇溶液 10ml 取乳糖10g置于已灭菌的肉膏汤琼脂瓶内，加热溶解琼脂并混匀。待冷却至50左右，加入中国蓝、蔷薇 红酸溶液混匀，立即倾注平板，凝固后备用。 将标本接种平板，置3518h24h。分解乳糖产酸的细菌，其菌落呈蓝色；不分解乳糖的细菌，菌落为淡红色的透明菌落。 质量控制大肠埃希菌ATCC 25922菌落呈蓝色。痢疾志贺菌型ATCC 13313和鼠伤寒沙门菌ATCC 13311菌落呈淡红色。保存 4冰箱保存，1周内用完。 注：(1)中国蓝水溶液需煮沸或高压11515min灭菌后应用。蔷薇红酸乙醇溶液无需灭菌，但加热时应避开火焰。 (2)蔷薇红酸能抑制革兰阳性细菌生长，但对大肠埃希菌没有抑制作用，标本接种量不宜太多。(3)此培养基pH7.4，制好后应呈淡红色，若过碱呈鲜红色，过酸则呈蓝色，均不适用。 2.木糖、赖氨酸、去氧胆酸盐(XLD)培养基 用途 为肠道菌选择性培养基。 配法 酵母浸膏 3g L-赖氨酸 5g NaCl 5g D-木糖 3.75g 乳糖 7.5g 蔗糖 7.5g 去氧胆酸钠 2.5g 硫代硫酸钠 6.8g 枸橼酸铁铵 0.8g 琼脂 13.5g 1%酚红溶液 8ml 蒸馏水 1L 将上述成分(酚红除外)混合，加热溶解，校正pH至7.2,再加入酚红溶液混匀。121高压灭菌15min，倾注平板备用。 将标本划线接种平板，置35培养18h24h。大肠埃希菌、肠杆菌属、克雷伯菌属、枸橼酸杆菌属细菌在本培养基上形成黄色、不透明菌落；大多数沙门菌属细菌因不利用糖类，为半透明红色或无色菌落。质量控制大肠埃希菌 呈黄色菌落；宋内志贺菌 呈无色菌落；伤寒沙门菌 呈红色菌落有黑心；金黄色葡萄球菌 抑制生长保存 贮存于4有效期5天。 3.SS琼脂(SalmonellaShigella agar) 用途 供沙门菌属和志贺菌属的分离培养用。 配法 月示胨 5g 牛肉膏 5g 乳糖 10g 琼脂 1520g 胆盐(No.3) 3.5g 枸橼酸钠(2H2O) 8.5g 硫代硫酸钠(5H2O) 8.5g 枸橼酸铁 1g 1%中性红水溶液 2.5ml 0.1%煌绿水溶液 0.33ml 蒸馏水 1L pH 7.07.1 将上述成分(除中性红，煌绿外)混合于水中，加热煮沸溶解，校正pH，然后加入中性红和煌绿水溶液，充分混匀冷却至50时倾注平板。 将标本接种平板，置35培养1824h。沙门菌属其菌落呈无色半透明，产生H2S者菌落中心呈黑色。志贺菌属的菌落呈无色半透明。大肠菌属呈红色浑浊。宋内志贺菌能延缓发酵乳糖，培养24h后可以出现红色菌落。肠道致病菌的菌落均可达1.5mm以上。 质量控制大肠埃希菌菌落 呈红色；痢疾志贺型、福氏志贺菌和伤寒沙门菌 生长良好，菌落无色；肠炎或猪霍乱沙门菌菌落 呈黑色；粪肠球菌、金黄色葡萄球菌 不生长。保存 避光，3天内用完。注：煌绿要新配，中性红要优质。 4.麦康凯琼脂(Maconkey agar) 用途 供肠道致病菌的分离培养和非发酵细菌鉴别用。 配法 蛋白胨 20g Nacl 5g 胆盐(猪、牛、羊) 5g 乳糖 10g 琼脂 1520g 1%中性红溶液 5ml 蒸水 1L pH 7.2 将上述成分(除中性红外)称量加入水中，加热溶解，校正pH，加入中性红溶液，分装灭菌11520min，冷却至50左右时倾注平板。 取标本或增菌培养物接种平板，置35培养1824h。不发酵乳糖的肠道细菌呈无色菌落，直径约2.0mm左右，光滑半透明。质量控制大肠埃希菌菌落 呈桃红色；痢疾志贺菌菌落 呈无色；伤寒沙门菌菌落 无色；金黄色葡萄球菌 不生长。保存 置4冰箱(避光)，1周内用完。注：非发酵细菌在该平板上是否生长，是临床鉴定某些非发酵细菌的指标之一。 5.伊红美蓝琼脂(Eosin methylene blue agar) 用途 供肠道致病菌及大肠菌群的分离培养。 配法 蛋白胨 10g 乳糖 10g 磷酸氢二钾 2g 20g/L伊红Y水溶液 20ml 65g/L美蓝水溶液 10ml 琼脂 17g 蒸馏水 1L pH 7.1 将蛋白胨、磷酸盐、琼脂称量混合于水中，并加热煮沸溶解，校正pH，分装灭菌12115min备用。临用时加热溶化琼脂加入乳糖，冷至5055时加入伊红和美蓝水溶液，摇匀倾注平板。 取粪便标本或增菌培养物接种平板，置35培养18h24h。根据检验目的不同，挑取无色菌落或挑选紫红色及有金属光泽的菌落转种克氏双糖或三糖铁琼脂进行鉴定。质量控制 大肠埃希菌菌落 呈紫红色，有时有金属光泽，直径2.3mm。伤寒沙门菌菌落呈灰白色，直径1.8mm。金黄色葡萄球菌不生长。保存 置4冰箱，1周内用完。 6.克氏双糖铁琼脂(Kliger iron agar) 用途 供肠杆菌科细菌的初步鉴定用。 配法 蛋白胨 20g 牛肉膏 3g 酵母膏 3g 乳糖 10g 葡萄糖 1g Nacl 50g 枸橼酸铁铵 0.5g 硫代硫酸钠 0.5g 0.2%酚红水溶液 5ml 琼脂 12ml 蒸馏水 1L pH 7.5 将上述成分（除琼脂、酚红外）称量混合于水中，加热溶解，校正pH，再加入琼脂和酚红溶液，煮沸溶解分装试管，每管4ml，经115灭菌20min，立即制成高层斜面，待凝固后经无菌试验备用。 取待检菌纯培养物，用接种针作底层穿刺和斜面划线接种，置35培养1824h，观察结果。斜面变黄，底层变黄，产气者或不产气者多属大肠埃希菌群及发酵乳糖的菌株。斜面变红，底层变黄，为不发酵乳糖菌株。产H2S菌株可使底层或全管产生黑色反应。质量控制奇异变形杆菌 K/A H2S阳性；大肠埃希菌 A/A；志贺痢疾杆菌 K/A；伤寒沙门菌 K/A H2S阳性；铜绿假单胞菌 K/K。 保存 置4冰箱，2周内用完。注:该培养基pH尤为重要，pH7.5时使用效果最佳。 7.三糖铁琼脂(Triple sugar iron agar) 用途 供肠杆菌科细菌初步生化鉴定用。 配法 蛋白胨 15g 月示胨 5g 牛肉膏 3g 酵母膏 3g 乳糖 10g 蔗糖 10g 葡萄糖 1g Nacl 5g 硫酸亚铁 0