（临床兽医学专业论文）玉米赤霉烯酮单抗的制备及初步应用.pdf

中文摘要 中文摘要 玉米赤霉烯酮( z e a r a l e n o n e ，z e n ) ，主要是由禾谷镰刀菌和黄色镰刀菌等镰 刀菌产生的真菌毒素。z e n 主要污染玉米、大麦、小麦、燕麦和高粱等作物，其 主要作用类似于雌激素，可导致不孕或流产，具有较强的生殖和发育毒性。z e n 还具有免疫毒性、基因毒性等，对人也有雌激素作用及可疑致癌性。近年来，因 玉米发霉导致动物玉米赤霉烯酮毒素急、慢性中毒的病例屡见不鲜，因此加强对 z e n 的检测，对确保食品安全具有重要意义。 目前，z e n 的的检测方法主要有薄层层析法、高效液相色谱法及免疫学方法 等。薄层层析法灵敏度不高，特异性不强，易被其它荧光物质干扰，且分析时间 较长；高效液相色谱法虽然灵敏度高，但检测仪器化程度高、设备昂贵，操作技 术要求高，前处理净化要求高；免疫学方法由于其特异性强、灵敏度高，前处理 简单，操作简便，比较容易推广使用。酶联免疫吸附法可同时检测多个样品，特 异性强、灵敏度高、速度快，是一种准确性、安全性高，实用性强的检测技术。 本研究运用化学合成方法制备z e n 完全抗原，采用单克隆抗体技术制备了灵 敏度高、特异性强、效价高的抗体，建立了z e n 的c i e l i s a 测定方法。玉米样品 加标回收试验证明，建立的检测玉米中z e n 的c i e l i s a 测定方法是稳定、可靠的。 1 完全抗原的合成与鉴定。用z e n 与羧甲基羟胺半盐酸盐在吡啶中反应生成 玉米赤霉烯酮肟( z e n o ) 再用活性酯法将z e n o 与蛋白质偶联合成完全抗原。 用t l c 法对z e n o 的转化进程进行实时监测；另外，实验用质谱检测法对合成的 z e n 0 结构进行鉴定；用紫外扫描法鉴定每步反应的合成效果，并根据扫描结果计 算载体蛋白与毒素的结合比。结果显示：经改进的方法合成过程更为简单，同时 z e n 的肟化率较高，达到7 9 3 。紫外扫描初步判定偶联成功，两种完全抗原 z e n b s a 、z e n o v a 的结合比分别为1 2 ：1 和2 1 ：1 。 2 z e n 单抗的制备。用z e n 。b s a 免疫b a l b c 小鼠，五免后阳性血清效价在 1 ：l o ，0 0 0 以上。利用单克隆抗体技术和现代细胞融合技术，经过筛选，获得一株单 克隆抗体杂交瘤细胞株3 f l l ，稳定性实验表明，这株单抗细胞株可稳定地分泌抗 z e n 单克隆抗体。 3 e l i s a 检测方法的建立。通过建立间接竞争e l i s a 方法，测定腹水最佳工 作浓度在1 ：3 2 ，0 0 0 。用3 f l l 制备的腹水作出的z e n 药物抑制标准曲线，其线性方 程为：y = 0 2 9 8 9 x o 0 2 9 2 ( r 2 = 0 9 8 9 8 ) ，l o d 为2 1 6 n 幽 i l l ，l o q 为2 2 3 7 n g m l 。 通过对同类真菌毒素的交叉反应实验表明该z e n 单抗的特异性良好，对其他真菌 中文摘要 毒素的抑制率均小于0 5 。 4 玉米中z e n 添加回收试验。对玉米样品中的z e n 提取方法进行了优化， 当提取液作8 倍以上稀释时，基质干扰基本消失，且在1 n g m l 5 0 0 n g m l 范围内， 标准曲线的线性方程为y = 0 3 0 7 6 x o 0 5 ( r z = o 9 9 3 1 ) ，l o d 为1 9 p g 爪g 。用5 0 ， 1 0 0 ，5 0 0 g l ( gz e n 做加标回收试验，经检z e n 回收率在7 2 9 1 0 0 之间，批 内差异在2 4 6 5 7 3 之间，批间差异在4 3 7 9 5 4 之间。 关键词：玉米赤霉烯酮；完全抗原；单克隆抗体；间接竞争e l i s a ；玉米 a b s t r a c t 坐 a b s t r a c t t h em y c o t o x i nz e a r a l e n o n e ( z e n ) i sa 如n g a lm e t a b o l i t e ，m a i n l yp r o d u c e db y f 舒锄i n e a n 】i i la n df c u l m o r u m ，w h i c ha r ek n o w n t oc o l o i l i z ec o m ，b a r l e y w h e a t ，o a t s a 1 1 ds o 唱h u m z e ns h o wm a r k e de s t r o g e i l i cp r o p e r t i e si nr a t s ，m i c e ，p o u l 臼了a i l di n s w i n e z e na n di t sr e l a t e dc o m p o u n d sc a l lc a u s eh y p e r o e s t r o g e n i s ma n dr e p r o d u c t i v e a l l d i n f e r t i l i 够p r o b l e m s i na n i m a l s ，e s p e c i a l l yi ns w i n e i ta l s oh a sg e n o t o x i c i 劬 i m m u n o x i c i 够a n dc a r c i n o g e i l i c i t ) ，t oe x p e r i m e n 协la n i m a l s z e nh a se s t r o g e i l i ce f r e c t a n dp o s s i b l ec a r c i n o g e n i c 埘o nh u m 锄i nr e c e n ty e a r s ，c o mi sf r e q u e n t l ym a d ei n t o a i l i m a lf e e d si n0 1 1 rc o u n t r y ，m o u l dd e v e l o p m e n to fc o mo r e nl e a d st 0a c t i v ec h r o n i c t o x i c o s i s s oi ti sv e wi m p o r t a n tf o re n s u r i n gf o o ds a f e 够t oi 1 1 1 1 a n c et h ed e t e c t i o no f z e n a tp r e s e n t ，t h e r ea r es e v e r a lh 1 e m o d st od e t e c t 也ec o n t e n to fz e n ，i n c l u d i n gn d n l a y e rc h r o m a t o g r 印h y ，h i 曲p e r f o m a i l c el i q u i dc 1 1 r o m a t o g r 印h y 趿di n u n u n o l o g i c a i m e t h o d t 1 1 i nl a y e rc 1 1 i d m 纳d g r 蜀l p h yi si n s e n s i t i v e ，i n s p e c i f i c ，t i m e - c o n s 啪i n g ，a 1 1 d e a s i l yi n t e r f e r e db yf l u o r e s c e n tm a t e r i a l h i g hp e f f o n n a n c el i q u i dc 1 1 1 1 0 m a t o 铲a p h yi s s e n s i t i v ea l l da c c u r a t e ， h o w e r e v e r ，t h ee q u i p m e m i s v e r ) ，e x p e n s i v e a n dt h e p r e - p r o c e s s i n gi sc o m p l i c a t e d c o m p a r e dw i t ht h et v 旧m e t h o d si n t r o d u c e db e f o r e ， e n 巧m e - l i m 【e di m m l l r l o s o r b e n ta s s a y ( e l i s a ) c a nb eu s e dt os c r e e nal a r g em 1 1 1 1 b e ro f s a m p l e s ，m e a n w h i l e ，i ti sas e n s i t i v e ，s p e c i a la n dr 印i dm e t l l o d 1 0e s t a b l i s ht h ee l i s am e m o df o rd e t e c t i n gz e n ，m i sr e s e a r c hs ”l t h e s i z e d c 0 h l p l e t e 眦i g e n ，d e v e l o p e dh i 曲一g r a d e 珊i b o d i e su s i n gt h et e c 量l n o l o g yo f m o n o c l o n a l a n t i b o d y ，i ka d d i t i o na n dr e c l a m a t i o nt e s to fc o ms a i l l p l e sp r o v e dt h a tt h ee s t a b l i s h e d c i e l i s am e t h o df o rd e t e c t i n gz e ni nc o mw a u ss 协b l e 锹l dr e l i a b l e 1 t h es y n m e s i sa 1 1 di d e n t m c a t i o n0 fc o m p l e t e l ya 1 1 t i g e n o 一( c 抽o x y m e n l y l ) h y d r o x y l 锄i n eh e m i h y d r o c h l o r i d ea n dz e ni np 如d i n er e a c t e da i l dg e n e r a f t e dz e n o x i m a t i o n ，t 1 1 e nt h el a t t e rc o r 巧u g a t e dw i t hp r o t e i nf 0 肿i n gc o m p l e t ea n t i g e n i nm e c o u r s eo fr e a c t i o n ，t l cm e t h o dw a su s e dt 0m o l l i t o rt h ec o n v e r t i o no fz e ni nr e a lt i m e i na d d i t i o mm a s ss p e c t r o m e t r yi n e t h o dw a su s e dt 0t e s tt l l es y n t h e s i sz e n os 仃l j c t u r e ， u vs c a 姗i n gm e t h dt oi d e n t i 母l ee 侬c to fs y n t h e s i s ，a n dt l l er a t i oo fz e nt op r o t e i n w 弱c a l c u l a t e do nt h eb a s i so ft h er e s u l to fu vs c a n n i n g t h er e s u l t ss h o w ：a a e rt 1 1 e p r o c e s so fc o m l ) o s i t i o ni m p r o v e d ，t 1 1 e0 x i m a t i o nr a t i oo fz e ni n c r e a s e da1 0 t a 1 1 d a b s t r a c t r e a c h e d7 9 3 r e s p e c t i v e l y u v s c a n n i n gi d e n t i f i e dt h ec o 蝎u g a t e s t h er a t i oo fh a p t e n s t 0c a r r i e rp r o t e i ni s1 2 ：la n d2 1 ：lf o rz e n b s a a n dz e n - o v a 2 1 1 1 ep r 印a r a t i o no ft h em o n o c l o n a la n t i b o d i e sa g a i n s tz e a r a l e n o n e z e n b s a w a sl l s e dt 0i m m l u l i z eb a l b cm o u s e ，m et i t e ro fb l o o ds e m mc o l l e c t e da & rt l l ef i f i h i l 姗u i l i z a t i o nr e a c h e d1 ：10 ，0 0 0 n 啪u 曲t h em o n o c l o n a la n t i b o d yt e c l m o l o g ya i l d m o d e mc e l l 向s i o nt e c l u l i q u e ，o n em o n o c l o n a lh y b r i d o m ac e l ll i n cc a l l e d3 f1 1w a s o b t a i n e d s t a b i l i t ye x p e r i m e n t s h o w e dt h a tm i sc e l ll i n ec o u l ds e c r e t em o r m c l o n a l a i l t i b o d ya g a i n s tz e ns t a b l y 3 7 1 1 1 ef o u i l d a t i o no fe l i s a m e t h o d t l l r o u g h t h ef o u n d a t i o no fi n d i r e c t c o m p e t i t i o ne l i s am e t h o d ，t h eb e s tw o r kc o n c e n t r a t i o no fa s c i t e sw a sg o t ，w h i c hi s 1 ：3 2 ，0 0 0 z e ns t a l l d 捌c u ew a sp r e p a r e d b y3 f1 1 锻c i t e s ，w i t ht h el i n e a re q u a t i o n ：y 2 0 2 9 8 9 x 一0 0 2 9 2 ( r 2 = o 9 8 9 8 ) ，l o d2 1 6n g 1 1 1 l ，l o q2 2 3 7n m 1 n l ec r o s s r e a c t i o n e x p e r i m e n to fc o n g e n e r i cm y c o t o x i ns h o w e dt h 戤t h ez e nm o n o c l o n a l 删i b o d yh a s9 0 0 ds p e c i f i c 埘，w i t hl e s st h a l lo 5p e r c e n ti 1 1 1 1 i b i t i o nr a t ea n t io t h e r m y c o t o x i n s 4 t h ea d d i t i o na n dr e c i 锄a t i o nt e s to fz e ni nt h ec o m t 0c u t ( 1 0 啪t h e i n t e m r e n c eo fe x 仃a c ta i l dr a i s ee x t r a c t i o nr a t e ，t h em e t h o do fe x t r a c t i n gz e n 舶m c o mw a so p t i m i z e d ，i n t e r v e n t i o nd i s a p p e a r e dw h e nt h ee x t r a c e 、e r ed i l u t e de i g h tt i m e s i nm er a n g e 舶mlt 05 0 0n g ，m l ，t h el i n e a r e q u a t i o nw a sy _ o 3 0 7 6 x o 0 5 ( 影= o 9 9 31 ) a i l dl o dw a s1 9n m 1 ，n l er e c o v e 巧r a t i ow e r eb e t w e e n7 2 5 9 2 9 w h e na d d i n g5 0 ，1o oa i l d5 0 0 p g 1 ( gz e nt 0c o m t h ei n t r a a s s a yc o e 伍c i e n to f v a r i a t i o nw e r eb e t w e e n2 4 6 5 7 3 ，鲫dt h ei n t e r a s s a yc o e f f i c i e n to fv 撕a t i o nw e r e b e 撕e e n4 3 7 9 5 4 ，n l er e p r o d u c i b i l i t ) rw a sf i n e k e yw o r d s ：z e a r a l e n o n e ；c o m p l e t ea n t i g e n ；m o n o c l o n a la n t i b o d y ；i n d i r e c tc o m p e t i t i o n e l i s a ；c o m 符号说明 缩写 z e n f a o p e g e r a o a c b s a h s a o v a f a i f a c m c d c c n h s c m o z e n o e l i s a i e l i s a c i e l i s a r l i a c p b s p b s t i g g - h i 冲 t m b d m s o t l c c e h p l c g i c a g c m s 符号说明 中文名称 玉米赤霉烯酮 世界粮农组织 聚乙二醇 雌激素受体 官方农业化学家协会【美】 牛血清白蛋白 人血清白蛋白 卵清蛋白 弗氏完全佐剂 弗氏不完全佐剂 羧甲基纤维素钠 n ，n 二环己基碳二亚胺 n 羟基琥珀酰亚胺 羧甲基羟胺半盐酸盐 玉米赤霉烯酮( 羧甲基) 肟 酶联免疫吸附测定 间接e l i s a 间接竞争e l i s a 放射免疫分析法 免疫亲和柱法 磷酸盐缓冲液 磷酸盐一吐温缓冲液 辣根过氧化物酶标记免疫球 蛋白g 3 ，3 ，5 ，5 ，四甲基联苯 胺 二甲基亚砜 薄层层析 毛细管电泳法 高效液相色谱 胶体金免疫层析技术 气相色谱 质谱 英文名称 z e a r a l e n o n e f o o da n da g r i c u l n l r eo r g a n i z a t i o n p o l y e t h y l e n eg l y c o ls o l u t i o n e s n d g e nr e c 印t o r a s s o c i a t i o no fo f f i c i a la g r i c u l t 啪l c h e m i s t s b 0 v i n es e r 吼a l b u m i n h i l i n a ns e 门m 1a l b u l n i n o v a l b 【1 1 i n f i - e u n d sa d i u v a n t ， c o m p l e t e f r e u n d sa d j u v a n t ， i n c o m p l e t e c a r b o x y i n e t h v l c e n u l o s e n ，n - d i c v c l o h e x v l c a r b o d i i m i d e n h v m x y s u c c i n i m i d e o 一( c a r b o x y m e t h y l ) h y d r o x y l a m i n e h e m i h v d r o c h l o r i d e z e a r a l e n o n eo x i m a t i o n e n z y m e 一1 i m ( e di m m u n o s o r b e n ta s s a y i n d i r e c te l i s a i i l d i r e c tc o m p e t i t i o ne l i s a r a d i o i m m u n o a s s a y h m n u n o a m l l i t 、，c o l u 舶n p h o s p h a t eb u f f e rs o d i u m p h o s p h a t eb u f r e rs o d i w nt w e e n i m m u n o g l o b u l i ng h o r s e r a d i s h p e r o x l d a s ec o 功u g a t e t e 仃锄e m y l b e n z i d i n e d e m e m v ls u l f o x i d e t h i nl a y c rc h r o m a t o a p h y c a p i l l a 巧e l e c t r o p h o r e s i s h i 曲p e m 嘞a 1 1 c el i q u i d c l 啪m a t o 掣a p h y g o l di m m u n o c l l r o m a t o 黟a p h ya s s a y g a sc h r o m a t o g r 印h y m a s ss p e c 仃i d g 阳p h v i i 笪呈望塑 型 d m f g m g p g n g l m l 山 h m l n m o l l p g 瓜g n m l o d 4 5 0 s d n ，n 二甲基甲酰胺 克 毫克 微克 纳克 升 毫升 微升 小时 分钟 摩尔每升 微克每千克 纳克每毫升 波长4 5 0 衄处的光吸收值 标准差 c v ( r s d ) 变异系数 r m i n转每分钟 l o d检测下限 l o q 定量限 d i m e t l w l f o m a m i d e g r 甜n m i l l i g r a m m l c r o g 舢 彻n o g r a l l i t r e m i l l i l i t e r m i c r 0 1 i t r e h o u r m i n u t e m o l e p e r l i t r e m i c r o g r 锄p e rk i l o 铲a m n a n o g r a n lp e r m i l l i l i t e r o p t i c a ld e n s 埘a t4 5 0 咖 s t a u l d a r dd i f f e r e n c e c o e f 致c i e n to fv a r i a t i o n r o u n dp e rm i n u t e l i t t l eo x f 0 r dd i c t i o n a r ) ， l i m i to fq 啪t i f i c a t i o n 声明与授权 扬州大学学位论文原创性声明和版权使用授权书 学位论文原创性声明 4 7 本人声明：所呈交的学位论文是在导师指导下独立进行研究工作所取得的研 究成果。除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含其他个人或集体已经发表 的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。 本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名： 新 签字日期：沙 年6 月7 日 学位论文版权使用授权书 本人完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向 国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子文档，允许论文被查阅和借阅。 本人授权扬州大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索， 可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权中国科学 技术信息研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库，并通过网络向 社会公众提供信息服务。 学位做作者签名：黟哆 期护卜6 月日 导师签秒五矽彦 导师签叩- 锣厉 签字日期：z 口。刁年月7 日 唐宁：玉米赤霉烯酮单抗的制备及初步应用 i _ - _ l l - 刖盖 在经济全球化的当今世界，确保饲料和食品安全是国际和国家行动的重点之 。影响饲料和食品安全的潜在因素很多，其中化学有害物最令人关注。在化学 有害物中，真菌毒素( 真菌有毒代谢物) 对食品和饲料的污染，藻类毒素( 藻类 产生的毒素) 对水产品的污染以及植物毒素对可食用植物的污染，均被世界卫生 组织列为食源性疾病的重要根源。在这三大类的自然毒素中，迄今最受关注的还 是真菌毒素。 据世界粮农组织( f i a o ) 报告，全球每年约有2 5 的农作物遭受真菌及其毒 素污染，约有2 的农作物因污染严重而失去营养和经济价值。据保守估计，真菌 毒素对饲料和养殖业的影响，仅在美国和加拿大每年造成的损失就有5 0 亿美元。 近年来，在波多黎各有数以千计的儿童出现早熟、青春期变化的症状，经检测， 在部分患儿的血液中发现了玉米赤霉烯酮【l 一。加拿大儿童每天从小麦食品中摄入 玉米赤霉烯酮达0 0 5 p g 瓜gb w ，尽管g o o d m a i l 等【l 】将此水平定为安全水平，但低 剂量的玉米赤霉烯酮是否会对人体产生积累效应而具有潜在危害，还有待于进一 步研究。真菌毒素对人类和动物健康可产生严重的影响，许多国家在近几十年来 制定了诸多有关食品和饲料中真菌毒素的法规，以保护人类和动物的健康，并保 障生产者和贸易商的经济利益。制定真菌毒素法规是一项复杂的工作，包含诸多 的影响因素和利益相关方。到2 0 0 3 年末，大约有1 0 0 个国家已经为食品和饲料中 的真菌毒素制定了各种特定的限量标准，而且该数目还在继续增加之中。 玉米赤霉烯酮是诸多真菌毒素中的一种，近年来进出口商品中均有发现玉米 赤霉烯酮超标现象，由于其潜在的危害较大，许多国家纷纷在主要粮食及饲料卫 生标准中加以限制，因此，迫切需要建立满足各种需要的检测玉米赤霉烯酮含量 的多种方法。 玉米赤霉烯酮概述 1 1 玉米赤霉烯酮的理化特性及代谢 玉米赤霉烯酮( z e a r a l e n o n e ，z e n ，又称f 2 毒素) 为白色晶体，是由镰刀菌 产生的一种霉菌毒素。主要产毒菌株为禾谷镰刀菌，此外，粉红镰刀菌、尖孢镰 刀菌、三线镰刀菌、串珠镰刀菌、黄色镰刀菌以及雪腐镰刀菌等也能产生z e n 。1 9 6 2 扬州大学硕士学位论文 2 一 年s t o b 等【3 1 首先从发霉的玉米中分离出这种物质，8 0 年代来，我国孟繁静等【4 】又 从胡萝卜、油菜、葡萄、芹菜等多种植物中分离出玉米赤霉烯酮。 1 9 6 6 年u r r y f 5 】应用经典化学、核磁共振和质谱技术确定了z e n 的化学结构( 见 图1 ) ，属于二羟基苯甲酸内酯类化合物，化学名称为6 ( 1 0 羟基一6 氧基碳烯基) 一p 雷锁酸内酯，具有雌激素活性【6 l 。分子式为c 1 8 h 2 2 0 5 ，分子量为3 1 8 4 ，熔点1 6 1 1 6 3 。z e n 难溶于水、二硫化碳和四氯化碳，易溶于碱性水溶液、二甲基甲 酰胺、苯、氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯和醇类。由于玉米赤霉烯酮是一种内酯结 构，因此在碱性环境下可以将酯键打开，当碱的浓度下降时可将键恢复【7 j 。z e n 甲醇溶液在紫外光下呈明亮的绿蓝色荧光i 研。 o h oc 心 z 崞曩r 习1 0 n o n e 图l 玉米赤霉烯酮分子结构式 f i glt h ec o n f i g u r a t i o no f z e a r a l e n o n e z e n 可由胃肠道持续吸收，肝肠循环可使z e n 在胃肠道滞留时间延长。z e n 主要随粪便排出，少量z e n 可由乳汁排泄。z e n 在肝脏和肠粘膜中被3 o h - 类固 醇脱氢酶代谢为玉米赤霉烯醇( z e 锄l a i l o l ，z e l ) ，z e l 有两种非对应立体异构体仅 和d 。仅z e l 熔点较低( 1 6 8 1 6 9 ) ，而p z e l 熔点较高( 1 7 4 1 7 6 ) 。前 者的雌激素活性比z e n 高3 倍，后者与z e n 活性相同。 1 2 玉米赤霉烯酮的毒性 1 2 1 对动物和人的影响 z e n 可直接污染谷类等作物，从而进入人或动物体内，也可通过被污染的肉、 奶等动物性食品进入人体。 唐宁：玉米赤霉烯酮单抗的制备及初步应用 1 2 1 1 生殖发育毒性 早在1 9 2 8 年，m e n u 钍等【9 】就发现喂饲发霉玉米的猪发生雌激素综合征，表现 为外阴和乳腺肿大，有的出现阴道和直肠脱垂。单次给予未成熟大、小鼠1 m g 蚝 1 0 m 眺gb w ，引起子宫重量增加，连续7 d 反复给予使累积剂量达3 5 m g 瓜g 1 4 m g l ( gb w 时也有这种作用。此效应是子宫特异性的，且经口给予比其他途径更 有效。组织病理检查发现z e n 可促进子宫肌细胞的增殖和有丝分裂。 2 0 0 3 年秋季，我国大部分地区阴雨连绵，使得收获的玉米不能及时晾晒，玉 米中的水分过高，达到2 0 3 0 ，造成大部分玉米在储存过程中发生不同程度的 霉变。农户在用霉变玉米饲喂畜禽后，发现去势母猪有乳房肿大，还有假发情、 流产、死胎和产仔畸形等现象。病区玉米试样提取液中可检出z e n ，含量为 7 5 m g l ( g 2 0 0 m 眺g ，严重影响了我国的畜禽养殖业。 1 2 1 2 对肿瘤发生的影响 z e n 能增加雌性小鼠肝细胞腺瘤及垂体腺瘤的发生率，并有剂量反应关系 【l o 】 o s c h o n t a l 【l i 】在进行致癌试验时发现，试验组大鼠出现由致癌剂处理而诱发的肿 瘤，此外，试验组大鼠还发生了乳腺的腺纤维瘤、腺瘤、腺癌，垂体腺癌，睾丸间 质肿瘤以及子宫纤维瘤等。在其他致癌试验中也有类似情况发生，这些肿瘤所涉 及的器官表明它们可能与动物饲料中的雌激素物质有关。因此s c h o n t a l 认为它们 是由污染饲料的z e n 或其代谢产物引起的。 1 2 1 3 免疫毒性 已知t 细胞依赖性巨噬细胞对早期防御李斯特氏菌有重要作用，宿主随后的 抵抗力是由t 细胞介导的，并伴有特定致敏t 细胞和活化的巨噬细胞的产生。以 拌饲方式给予小鼠l o m 眺gz e n ，可显著降低小鼠对单核细胞增生李斯特氏杆菌 的抵抗力，但未引起组织病理学改变1 1 2 】。在有z e n 存在时用十四烷酰佛波醇乙酯 ( p m a ) 作用于胸腺瘤细胞系e l 4 ，z e n 能显著升高e l 4 的白细胞介素2 ( i l - 2 ) 和白细胞介素5 ( i l 5 ) 的水平【1 3 1 。z e n 能抑制植物血凝素刺激的人外周血淋巴细 胞增殖，还能抑制刀豆素a 和美洲商陆有丝分裂原刺激的b 细胞和t 细胞形成。 扬州大学硕士学位论文 1 2 1 4 对d n a 和染色体的影响 4 一 z e n 本身具有遗传毒性，可以增加人外周淋巴细胞姐妹染色体单体交换率和 哺乳动物细胞d n a 的加合物。z e n 可与1 7 p 雌二醇受体结合，导致脂肪氧化反 应、细胞凋亡并导致蛋白质和d n a 合成的抑制，还可抑制其他大分子的生物合成 f 1 4 - 1 5 1 o 目前已证实z e n 可导致染色体失常。o u a n e sz 等【1 6 】发现，1 7 p 雌二醇、孕酮 和v e 在体内和z e n 结合相同的受体，因此1 7 p 雌二醇、孕酮和v e 可以预防或 减轻z e n 造成的染色体失常。 1 2 1 5 肝毒性 由于z e n 主要在肝脏中进行代谢，因此肝脏也是z e n 重要的靶器官。研究表 明，z e n 对肝脏及肝细胞具有强烈的毒害作用。孙美乐等f 1 7 】测定大鼠肝细胞培养 液中乳酸脱氢酶( l d h ) 、白蛋白及细胞内d n a 的含量，探讨了z e n 对体外培养大 鼠肝细胞的损伤作用，结果表明，z e n 对肝细胞分泌l d h 无显著影响，但可使培 养液中自蛋白和细胞内d n a 含量下降。 1 2 1 6 促生长作用 z e n 可显著刺激小白鼠子宫生长，尤其是切除了卵巢的小白鼠对玉米赤霉烯 酮更敏感。将z e n 添加动物饲料中，可促进家畜( 猪、牛、羊、兔等) 体重增加， 从而提高饲料利用率。为此a n d r e w 和s t a b 早在1 9 6 5 年就曾申请美国专利，随后 被广泛用作肉用牛、羊生长促进剂。八十年代世界各地发生z e n 危害事件，欧洲 联盟于19 8 8 年禁用合成类生长促进剂【1 钔。 1 2 2 对植物的影响 1 2 2 1 对植物生长的调控作用 z e n 不但可以由霉菌产生，而且在许多高等植物体内也存在，并且是作为植 物体内的一种激素来调控植物的生长。例如小麦、大豆、棉花等植物，在开花的 时候z e n 达到峰值。在不断的研究当中表明：z e n 的作用与作物光期诱导作用是 十分密切的。例如在z e n 含量达到高峰后移栽的长日诱导下的冬小麦都能正常抽 唐宁：玉米赤霉烯酮单抗的制备及初步应用 5 一 穗，而在峰值出现前移栽的冬小麦最终则不能开花。通过傅永福、孟繁静的研究 表明，外源性的z e n 可部分代替冬小麦成花所需的日照条件，同时z e n 还可加速 烟草花芽和冬小麦穗的发育。这些都为人们利用z e n 来调控作物的成长提供了途 径l 嘲。 z e n 在植物当中，特别是在植物开花前后含量较高，而且z e n 有一定的残留 性，因此，在用作反刍动物的青贮饲料时值得注意。虽然z e n 在植物当中的最高 含量对于动物来说也不算高，但反刍动物的采食量较大，过多的蓄积也会对动物 造成一定的影响。所以，应避免在植物开花期前后作为青贮的原料或直接饲喂动 物。 1 2 2 2 在植物育种方面的利用 长期以来，农作物的育种是提高产量和质量的一项重要手段。现在利用z e n 可以提高玉米幼苗的抗旱和抗寒的能力。经过z e n 浸种的玉米其幼苗在干旱条件 下水分下降缓慢，相对导电率低，超氧化物歧化酶活性较高，游离脯氨酸的含量 升高。同时利用浸种的方法也可以得到抗寒能力较强的玉米幼苗，并且研究认为 0 1 m g lz e n 溶液浸种的效果较好1 2 0 】。在不断的研究和开发当中，更多的农作物通 过z e n 的作用而产生了育种的优势方向。 1 3 玉米赤霉烯酮的毒性机理 z e n 与内源性雌激素在结构上相似，能像雌激素一样，通过与雌激素受体( e r ) 竞争性的结合，激活雌激素反应元件，使受体发生二聚化，从而发生一系列拟雌 激素效应。 z e n 在非雌激素浓度范围内( 导致不到1 0 细胞凋亡的浓度范围内) ，可影响 靶细胞主要代谢和及其合成，如抑制蛋白质合成；并影响细胞完整性，使细胞生 理机能发生改变。而且z e n 可作用于细胞膜的调节机制，使各种动物组织、细胞 发生变性坏死【2 1 1 。 d n a 的损伤主要表现在结构上失常，特别是出现缺口、环、破裂和中心融合 等，没有出现多倍体和非整倍的变性。 氧化损害可能是z e n 毒性的又一途径。v e 是一种有效的抗氧化剂，葡萄糖 醛酸( g a ) 是抗热应激反应一个异常诱导者，具有抗氧化特性。研究发现v e 和g a 扬州大学硕士学位论文 6 一 能阻止z e n 对细胞蛋白质毒害，暗示z e n 可能通过扰乱依赖性细胞的氧化还原状 况，导致毒性作用【2 2 】。 2 玉米赤霉烯酮的限量标准 2 0 0 3 年止，据世界粮农组织( f a o ) 公布已有1 9 个国家制定了食物中的z e n ( 含雌激素的真菌毒素) 的限量标准【2 3 】。2 0 0 4 年1 2 月，我国收到w t o s p s 通报， 欧盟修订( e c ) 4 6 6 2 0 0 1 法规( g s p s n e e c 2 5 3 ) ，修订草案对一些食品内的z e n 规定了欧盟统一的最大限量，主要内容如下：z e n 除玉米外的未加工谷物： 1 0 0 g k g ；除玉米粉外的谷粉：7 5 “l k g ；面包、面粉糕饼、饼干：5 0 p g l 【g ；除玉 米快餐食品及以玉米为主要成分的早餐食品外的谷物快餐食品及早餐谷类食品： 5 0 ”眺g ：以加工谷物为主要成分的婴幼儿食品：2 0 p g 他；玉米及玉米产品内z e n 的最大限量将是2 0 0 “眺g 。 表l 我国玉米赤霉烯酮含量限制标准( g b l 3 0 7 8 2 - 2 0 0 6 ) 1 a b l e1i 。i m i ts 切n d a r do fz e ni nc h i n a 食物 限量( m l s ) ( p g l ( g ) 配合饲料及玉米 供人食用的小麦及玉米 5 0 0 6 0 3 玉米赤霉烯酮检测方法 骤。 玉米赤霉烯酮的分析过程包括样品的采集，z e n 的提取、净化和测定三个步 3 1 样品的采集 待检样品中生长或污染有霉菌颗粒所占比例常较小，分布也不均匀。样品中 污染z e n 高的一粒霉变样品往往就会左右整个测定结果。有人认为，z e n 测定过 程中几乎9 0 的误差来源于采样和样品的提取净化过程。为避免取样带来的误差， 必须大量取样，充分混匀，才有可能得到有代表性的相对可靠的结果。在官方控 制中，已经根据不同物品的特性制定了多种采样方案。具体方法见于中华人民共 和国卫生部、中国国家标准管理委员会于2 0 0 3 年8 月1 1 日发布，2 0 0 4 年1 月1 日正式实施的g b r r1 4 6 9 9 1 关于饲料的采集方法1 2 4 】。 唐宁：玉米赤霉烯酮单抗的制备及初步应用 3 2 提取净化与富集 7 一 提取净化就是将z e n 从基质中提取出来，减少提取物中干扰物质的过程。一 般来讲，理化检测方法特异性差，应尽量避免样品中各种杂质的干扰，样品经溶 剂提取后还要用固相萃取或免疫亲和柱层析净化样品。免疫学检测法特异性强， 一般杂质，如维生素b 2 、喋呤等荧光物质都不会干扰测定结果，所以一般经溶剂 提取后就可直接用于检测。 z e n 的提取过程很大程度上依赖于食品和粮食作物的理化性质，没有一种方 法足以用于所有食品和粮食作物的提取。酯类色素含量高的物质，一般需要更具 选择性的提取方法并需要更完善的净化方法。z e n 能溶于中等极性溶剂，不溶于 非极性溶剂，常用的提取溶剂有三氯甲烷水、乙腈水、丙酮水和二氯甲烷一水等。 曾红燕等【2 5 】认为甲醇一水、乙腈水优于三氯甲烷水。甲醇水被广泛应用，已应用 于大麦、高粱以及玉米等多种食品的提取。为了提高提取效率，有效去除杂质， 有时在提取液中加入其它物质，如硅藻土、氯化钠等。 液液分离是根据z e n 在不同溶剂中的溶解度不同，而达到提取、净化和富集 的作用。该方法效率较低，净化程度不高，现在一般是与其它方法结合使用。固 相萃取技术的使用日益广泛，有多种不同类型的固相萃取柱，使用的填料有硅胶、 硅酸镁、c 1 8 键合相、f l o r i s i l 硅土和碱性氧化铝柱等。有些净化柱是在样品提取液 通过柱子时将z e n 保留住，而干扰物质随洗涤液流出，之后再用洗脱液将z e n 洗 脱下来。 与液液分离和固相净化柱相比，免疫亲和柱同时克服了前者提取效率低和后 者操作复杂的不足，能简单有效地去除干扰杂质。它是将特异性抗体结合到活化 的固相载体上填充而成。当样品提取液通过柱子时，特定抗原与抗体结合，其他 杂质则通过水或其它水溶液而洗掉，再通过有机溶剂甲醇或乙腈使抗原与抗体解 离而将抗原即毒素洗脱下来【2 6 1 。这种净化方法简单、快速、特异性高，几乎是当 前最受重视、最有发展前景的净化方法。 扬州大学硕十学位论文 3 3 测定方法 3 3 1 理化检测方法 3 3 1 1 薄层色谱法 8 一 薄层色谱法( t l c ) 是最早应用于z e n 检测的方法之一，在z e n 鉴定分离方 面具有重要地位。本法既可用于定性分析，