（微生物学专业论文）信号蛋白tor与杆状病毒感染和昆虫细胞凋亡的关系.pdf

信号蛋门t o r 与杆状病毒感染和昆虫细胞凋亡的关系 论文题目 信号蛋白t o r 与杆状病毒感染和昆虫细胞凋亡的 关系 专业 微生物学 硕士生 杨亦 导师 庞义教授 中文摘要 雷帕霉素靶蛋白 t a r g e to fr a p a m y c i n t o r 属于磷脂酰肌醇激酶的相关激酶 p h o s p h a t i d y l i n o s i t o lk i n a s e r e l a t e dk i n a s e p i k k 超家族 是一类进化上非常保守 的蛋白激酶 广泛存在于各种生物细胞 信号蛋白t o r 是磷脂酰肌醇 3 激酶 p h o s p h a t i d y i i n o s 的l3 k i n a s e p 1 3 k a k t 信号通路下游的一个效应蛋白 在细胞 存活中处于核心地位 在多种因素的活化下参与基因转录 蛋白质翻译起始 细胞 凋亡等多种生物学过程 很多病毒在感染过程中可通过调控宿主细胞 p 1 3 k a k t t o r 信号通路来完成病毒的复制 此外 p 1 3 k a k t t o r 信号通路的参 与还参与了肿瘤坏死因子 t u m o r n e c r o s i sf a c t o r t n f 放线菌素d a c t i n o m y c i n d a c t d 等细胞外因子诱导的细胞凋亡 先前本室已表明草地贪夜蛾 s p o d o p t e r a f r u g i p e r d a 细胞s f 9 中存在p 1 3 k a k t 信号通路 且该通路在杆状病毒感染昆虫细胞以及诱导昆虫细胞凋亡过程中起着重 要作用 为了对鳞翅目昆虫细胞中p 1 3 k a k t 信号通路进行较为完整和全面的研究 本文对p 1 3 k a k t 信号通路的下游信号蛋白t o r 在杆状病毒代表种 苜蓿丫纹夜 蛾核多角体病毒 a u t o g r a p h ac a l i f o m i c am u l t i p l en u c l e o p o l y h e d r o v i r u s a c m n p v 感染s f 9 细胞过程中所起的作用进行了研究 同时也对t o r 在s t 9 细胞凋亡过程 中所起的作用进行了初步的探索 使用t o r 的特异性抑制剂雷帕霉素 r a p a m y c i n 处理s t 9 细胞 随着雷帕霉 信号蛋向t o r 与杆状病毒感染和昆虫细胞凋亡的关系 素浓度的升高 被处理细胞的增殖率降低 说明雷帕霉素对s t 9 细胞增殖起到了抑 制作用 且此抑制作用为浓度依赖型 此外 r n a 干扰 r n ai n t e r f e r e n c e 下调 s t 9 细胞中t o r 的表达也能抑制细胞的增殖 表明s f 9 细胞中存在信号蛋白t o r 利用特异性识别磷酸化t o r 的抗体进行w e s t e r nb l o t 分析表明 a c m n p v 感 染导致s t 9 细胞中磷酸化t o r 的水平在lh p i h o u r sp o s t i n f e c t i o n y l 高 且高水 平的磷酸化t o r 可持续到1 8h p i 结果表明a c m n p v 感染s f 9 细胞能磷酸化激活 细胞中的信号蛋白t o r a c m n p v 在s i 9 细胞中的有效增殖需要t o r 在病毒感染细胞后各时间点利 用雷帕霉素处理细胞抑制t o r 后 芽生型病毒 b u d d e dv i r u s 和包涵体 o c c l u s i o n b o d y 的产量都显著降低 在2h p i 加入雷帕霉素处理细胞 对予代病毒产量的影 响与感染前加入雷帕霉素的相近 说明雷帕霉素并不影响病毒进入细胞 在8 h p i 和1 2h p i 加入雷帕霉素对子代病毒产量的影响逐渐降低 2 4h p i 加入雷帕霉素则不 影响子代病毒的复制 这些结果表明 病毒进入细胞后的早期复制过程对 p 1 3 k a k t t o r 信号通路的依赖性较强 随后逐渐减弱 感染2 4h 后病毒不再依靠 此信号通路进行增殖 s l o tb l o t 和w e s t e r nb l o t 检测发现当t o r 受到抑制后 病毒 d n a 合成 以及病毒晚期基因 3 豚 和极晚期基因 多角体蛋白 的表达均受到 一定程度的抑制 但病毒早晚期基因 g p 6 4 的表达水平接近 上述结果证明t o r 对a c m n p v 在s 固细胞中复制具有重要作用 t o r 在调节细胞存活和凋亡过程中起着关键性的作用 利用雷帕霉素抑制 t o r 后 杆状病毒或放线菌素d 诱导的s t 9 细胞凋亡受到抑制 关键词 t o r 信号蛋白 苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒 细胞凋亡 信号蛋白t o r 与杆状病毒感染和昆虫细胞凋亡的关系 t i t l e t h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nt o r s i g n a l i n gp r o t e i na n d b a c u l o v i r u si n f e c t i o no ri n s e c tc e l la p o p t o s i s m a j o r m i c r o b i o l o g y n a m e y a n gy i s u p e r v i s o r p r o f p n a gy i a b s t r a c t t o r t a r g e to fr a p a m y c i n i sa ne f f e c tp r o t e i nd o w n s t r e a mp 1 3 k a k ts i g n a l i n g p a t h w a y w h i c hb e l o n g st ot h ep i k k t h ep h o s p h a t i d y l i n o s i t o lk i n a s e r e l a t e dk i n a s e s u p e r f a m i l y i ti sak i n do fe v o l u t i o n a r yc o n s e r v e dp r o t e i n k i n a s e w i d e l ye x i s t e di nl o t s o fc e i l t o rc a nb ea c t i v a t e da n di n v o l v e di nm a n yc e l l u l a rp r o c e s s e s s u c ha sg e n e t i c t r a n s c r i p t i o n p r o t e i nt r a n s l a t i o n a p o p t o s i sb yt h ea c t i o no fs e v e r a lf a c t o r s a n di tp l a y sa c e n t r a lr o l ei n c e l ls u r v i v a l p r o c e s s m a n yv i r u s e sm o d u l a t et h ep 1 3 k a k t t o r s i g n a l i n gp a t h w a yi no r d e rt oa u g m e n tt h e i rr e p l i c a t i o n p 1 3 k a k t t o rs i g n a l i n g p a t h w a yh a sb e e ns h o w nt o m e d i a t ep r o t e c t i o nf r o ma p o p t o s i si n d u c e db ye x t e m a l s t i m u l i s u c ha st u m o r n e c r o s i sf a c t o r a n da c t i n o m y c i ndi nav a r i e t yc e l lt y p e s i th a sb e e nc o n f i r m e dt h a tp 1 3 k a k tp a t h w a yd i de x i s ti nl e p i d o p t e r ai n s e c tc e l l s a n dp l a y e da ni m p o r t a n tr o l ei nb a c u l o v i r u sr e p l i c a t i o na n da p o p t o s i so fi n s e c tc e l l f o r t h ei n t e g r a t e dr e s e a r c ho np 1 3 k a k tp a t h w a yi nl e p i d o p t e r ai n s e c tc e l l s w ei n v e s t i g a t e d h o w s i g n a lp r o t e i nt o r w o r k si na u t o g r a p h ac a l i f o r n i c am u l t i p l en u c l e o p o l y h e d r o v i r u s a c m n p v i n f e c t e ds p o d o p t e r a f r u g i p e r d a s t 9 c e l l s a n dt h er o l eo f t o ri ns t 9c e l l a p o p t o s i sw a sc h a r a c t e r i z e d f i r s t l y s 1 9c e l l sw e r et r e a t e dw i t hr a p a m y c i n ak i n do ft o rs p e c i f i ci n h i b i t o r t o i n v e s t i g a t ei ft o rw o r k si ns t 9c e l l s t h er u s l u ts h o w e dt h a tt h et r e a t e dc e l l p r o l i f e r a t i o nr a t ew a sl o w e rw h i l em o r er a p a m y c i ne x i s t s u g g e s t i n gt h a tr a p a m y c i n i n h i b i tp r o l i f e r a t i o no fs t 9c e l l s a n dt h i si n h i b i t i o nw o r k si nad o s e d e p e n d e n tm a n n e r f u r t h e r m o r e e x p r e s s i o no ft o ri ns 1 9c e l l sw a sk n o c k d o w nw i t hr n a i n t e r f e r e n c e r n a i m e t h o d a n dt h er e s u l ts h o w e dt h a tt h ec e l ip r o l i f e r a t i o nw a sa l s or e d u c e d t oi n v e s t i g a t ei fa c m n p vi n f e c ts f 9c e l l sc a na c t i v a t et o r w e s t e r nb l o tw i t h s p e c i f i ca n t i b o d yo fp h o s p h o r y l a t e dt o rw a sc a r r i e do u t t h er e s u l ts h o w e dt h a t 1 1 i 信号蛋白t o r 与杆状病毒感染和昆虫细胞凋亡的关系 i n f e c t i o no fs dc e l l sw i t ha c m n p va c t i v a t e dt o rp h o s p h o r y l a t i o na t1 h p i p o s t i n f e c t i o n t h em a x i m u mt o rp h o s p h o r y l a t i o no c c u r r e da t6h p ia n dr e m a i n e d h i g hl e v e lu n t i l 18h p ii na c m n p v i n f e c t e ds t 9c e l l s t h i ss u g g e s t st h a ta c m n p v i n f e c t i o nc a na c t i v a t et o r w ed e t e r m i n e dw h e t h e ri n h i b i t i o no ft o rh a da n ye f f e c t so nt h ea c m n p vl i f e c y c l e i tw a ss h o w e dt h a ti n h i b i t i o no ft o ra c t i v a t i o nb yr a p a m y c i ns i g n i f i c a n t l y r e d u c e dt h ev i r a ly i e l d i n c l u d i n gar e d u c t i o ni nb u d d e dv i r u s e s b v a n do c c l u s i o n b o d i e s o b p r o d u c t i o n w h e nr a p a m y c i nw a sa d d e da t1hp r i o rt oi n f e c t i o n i n d i c a t i n g t o ri sr e q u i r e df o re f f i c i e n ta c m n p v r e p l i c a t i o n w h e nr a p a m y c i nw a sa d d e de i t h e r p r e i n f e c t i o no ra t2h p i t h ei n h i b i t o r ye f f e c to nb va n do bp r o d u c t i o nw a ss i m i l a r t h i ss u g g e s t st h a tr a p a m y c i nd i dn o ta f f e c tv i r a le n t r y w h e nr a p a m y c i nw a sa d d e da t8 o ra t12h p i b va n do bp r o d u c t i o nw e r ea l s or e d u c e dt oal e s s e rd e g r e e w h e n r a p a m y c i nw a sa d d e da t2 4hp o s t i n f e c t i o n n e i t h e rb vn o ro bp r o d u c t i o nw a sa f f e c t e d i m p l y i n gt h a tt o rp l a y san e c e s s a r yr o l ei nv i r u se a r l yi n f e c t i o n c o r r e s p o n d i n g l y b o t h v i r a ld n a r e p l i c a t i o na n dl a t e 3 8 k a n dv e r yl a t e p o l y h e d r i n v i r a lp r o t e i ne x p r e s s i o n w e r ei m p a i r e db yr a p a m y c i nt r e a t m e n t r a p a m y c i nh a dal i t t l ee f f e c to ne a r l y l a t e g p 6 4 p r o t e i ne x p r e s s i o n a l lt h e s er e s u l t ss h o wt h a tt o rp l a y sa ni m p o r t a n tr o l ei n v i r a l r e p l i c a t i o n t o rp l a y sac r u c i a lr o l ei n r e g u l a t i n gc e l ls u r v i v a la n da p o p t o s i s s ow e i n v e s t i g a t e dt h er e l a t i o n s h i pb e t w e e np 1 3 k a k t t o rs i g n a lp a t h w a ya n da p o p t o s i si n s t 9c e l l s t h er e s u l ts h o w e dt h a tw h i l es 1 9c e l l sw e r et r e a t e dw i t hr a p a m y c i n t h e a p o p t o s i s i n d u c e db yv a c p 3 5 k 0 p h 而即i n f e c t i o no rb ya c t i n o m y c i nd w a si n h i b i t e d k e y w o r d s t o r s i g n a l i n g n u e l e o p o l y h e d r o v i r u s c e l la p o p t o s i s i v c a l i f o r n i c am u l t i p l e 信号蛋白t o r 与杆状病毒感染和昆虫细胞凋亡的关系 缩略词 信号通路相关名词 a p a f 1a p o p t o t i cp r o t e a s ea c t i v a t i n gf a c t o r b a d b c l x l b c l 2a s s o c i a t e dd e a t hp r o m o t e r b c l x l b c l 2 相关死亡促进因子 c a r d c a s p a s er e c r u i t i n gd o m a i n c y t cc y t o c h r o m ec d dd e a t hd o m a i n d i s c d e a t h i n d u c i n gs i g n a l i n gc o m p l e x e g t a e t h y l e n eg l y c o lt e t r a a c e t i ca c i d 乙二醇二乙醚二胺四乙酸 e r k e x t r a c e l l u l a r s i g n a l r e g u l a t e dk i n a s e f a tf o c a la d h e s i o nt a r g e t i n gd o m a i n f a t 结构域 f a t c f r b g l u t g s l o i r s s 刷k m a p k m t o l 乇c n f r b p t o s 6 k 凋亡蛋白激活因子 c a s p 嬲e 招募结构域 细胞色素c 死亡结构域 死亡诱导信号复合物 细胞外信号调节激酶 f o c a la d h e s i o nt a r g e t i n gd o m a i no f c t e r m i n a l f a t c 结构域 f k b p l 2 r a p a m y c i nb i n d i n gd o m a i n f k b p l 2 雷帕霉素绑定结构域 g l u c o s et r a n s p o r t e r葡萄糖转运蛋白 g l y c o g e ns y n t h a s ek i n a s e 3糖原合成激酶3 i n s u l i nr e c e p t o rs u b s t r a t e s 胰岛素受体底物 c j u nn t e r m i n a lk i n a s ec j u n 氨基端激酶 m i t o g e n a c t i v a t e dp r o t e i nk i n a s e丝裂原活化蛋白激酶 m a m m a l i a nt a r g e to fr a p a m y c i nc o m p l e x 哺乳动物雷帕霉素靶点复合物 n u c l e a rf a c t o r1 c b 核因子r b p t 0r i b o s o m a ls 6k i n a s e 核糖体蛋白s 6 激酶p 7 0 信号蛋白t o r 与杆状病毒感染和昆虫细胞凋亡的关系 p d k l p h p 1 3 k p i p 2 p i p 3 p k a p k b p t d i n s p t e n s h 2 s h 3 t b p t n f t n f r t s c l 2 病毒 a c m n p v b m n p v c p g v c v b 3 e b v f m d v h b v h c m v h c v 3 p h o s p h o i n o s i t i d e d e p e n d e n tp r o t e i nl i n a s e 一1 磷脂酰肌醇依赖性蛋白激酶 1 p l e c k s t r i nh o m o l g yd o m a i n 血小板同源结构域 p h o s p h a t i d y l i n o s i t o l3 k i n a s e磷脂酰肌醇 3 激酶 p h o s p h a t i d y l i n o s i t o l 4 5 b i s p h o s p h a t e磷脂酰肌醇二磷酸 p h o s p h a t i d y l i n o s i t o l 3 4 5 b i s p h o s p h a t e磷脂酰肌醇三磷酸 p r o t e i nk i n a s ea蛋白激酶a p r o t e i nk i n 硒eb蛋白激酶b p h o s p h a t i d y l i n o s i t o l磷脂酰肌醇 p h o s p h a t a s ea n dt e n s i nh o m o l o g yd e l e t e do nc h r o m o s o m et e n 第1 0 号染色体丢失的张力蛋白同源的磷酸酶 s r c h o m o l o g yd o m a i n2 3s r c 同源结构域2 或3 t a t a b i n d i n gp r o t e i nt a t a 结合蛋白 t u m o rn e c r o s i sf a c t o r 肿瘤坏死因子 t u m o rn e c r o s i sf a c t o rr e c e p t o r 肿瘤坏死因子受体 t u b e r o u ss c l e r o s i sc o m p l e x l 2 结节性脑硬化复合物1 2 a u t o g r a p h ac a l i f o r n i c am u l t i p l en u c l e o p o l y h e d r o v i r u s 苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒 b o m b y xm o r in u c l e o p o l y h e d r o v i r u s 家蚕核多角体病毒 c y d i ap o m o n e l l ag r a n u l o v i r u s 苹果小蠹蛾颗粒体病毒 c o x s a c k i ev i r u sb 3 科萨其病毒 e p s t e i n b a n v i r u s 艾伯斯坦 巴尔病毒 f o o t a n d m o u t hd i s e a s ev i r u s 口蹄疫病毒 h e p a t i t i sb v i r u s 乙肝病毒 h u m a nc y t o m e g a l o v i r u s 人类巨细胞病毒 h e p a t i t i sc v i r u s 丙肝病毒 6 7 信号蛋白t o r 与杆状病毒感染和昆虫细胞凋亡的关系 h h p v l 6 k s h v r s v s a r s c o s v 4 0 其它 a c t d b p b v c a s p a s e c d n a d d h 2 0 d m s o d n a d n t p d t t e d t a g f p g v h h p i l a p k b k d a m l n h u m a n i m m u n o d e f i c i e n c yv i r e s人类免疫缺陷病毒 h u m a np a p i l l o m av i r u st y p e1 6 1 6 型人类乳头瘤病毒 k a p o s i ss a r c o m a a s s o c i a t e dh e x e sv i r u s 卡波氏肉瘤相关疱疹病毒 r e s p i r a t o r ys y n c y t i a lv i r u s呼吸道合胞病毒 s e v e r ea c u t er e s p i r a t o r ys y n d r o m ec o r o n a v i r u s 严重急性呼吸综合症冠状病毒 s i m i a nv i r u s4 0 猴病毒4 0 a c t i n o m y c i nd 放线菌素d b a s ep a i r 碱基对 b u d d e dv i r u s 芽生型病毒 e y s t e i n ea s p a r t i ca c i cs p e c i f i cp r o t e a s e 天冬氨酰特异性的半胱氨酸蛋白酶 c o m p l e m e n t a r yd n a 互补脱氧核糖核酸 d o u b l ed i s t i l l e dw a t e r 双蒸水 d i m e t h y ls u l f o x i d e 二甲基亚砜 d e o x y n u e l e o t i d et r i p h o s p h a t e 脱氧核糖核甘酸 d e o x y n u c l e o t i d et r i p h o s p h a t e 脱氧三磷酸核甘酸 d i t h i o t h r e i t o l 二硫苏糖醇 e t h y l e n ed i a m i n e t e t r a a c e t i ca c i d 乙二胺四乙酸 g r e e nf l u c r e s c e n c ep r o t e i n 绿色荧光蛋白 g r a n u l o s i sv i r u s 颗粒体病毒 h o u r s 小时 h o u r sp o s ti n f e c t i o n 感染后 i n h i b i t o ro f a p o p t o s i s 凋亡抑制蛋白 k i l o b a s e 干碱基对 k i l o d a l t o n 千道尔顿 m i n u t e 分钟 信号蛋白t o r 与杆状病毒感染和昆虫细胞凋亡的关系 m o i n b t n p v o b o d v p b s p c r p m s f p o l h 印m s d s s d s p a g e s e c t b s t c i d s o t e t e m e d 确s l n w 硪 n m u l t i p l i c i t yo f i n f e c t i o n 感染复数 n i t r o b l u et e t r a z o l i u m 氮蓝四唑 n u c l e o p o l y h e d r o v i r u s 核多角体病毒 o c c l u s i o nb o d y 包涵体 o c c l u s i o n d e r i v e dv i r u s 包埋型病毒 p h o s p h a t eb u f f e r e ds a l i n e 磷酸盐缓冲液 p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n 聚合酶链式反应 p h e n y l m e t h a n e s u l f o n y lf l u o r i d e 苯甲基磺酰氟 p o l y h e d r i n 多角体蛋白基因 r e v o l u t i o np e rm i n u t e 每分钟转数 s o d i u md o d e c y ls u l p a t e 十二烷基硫酸钠 s d s p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s s d s 聚丙稀酰胺凝胶电泳 s e c o n d 秒 t r i sb u f f e r e ds a l i n e 三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水 5 0 t i s s u ec u l t u r ei n f e c t i o nd o s e 半数组织培养物发生感染的病毒剂量 t r i s e d t a b u f f e r t r i s e d t a 缓冲液 t e t r a m e t h y l e t h y l e n e d i a m i n e 四甲基乙二胺 ir i s h y d r o x y m e t h y l 一a m i n o m e t h a n e 三 羟甲基 氨基甲烷 v o l u m e v o l u m e 体积 体积 w a t t 瓦特 w e i g h t v o l u m e 重量 体积 原创性及学位论文使用受权声明 原创性声明 本人郑重声明 所呈交的学位论文 是本人在导师的指导下 独立进行研 究工作所取得的成果 除文中已经注明引用的内容外 本论文不包含任何其他 个人或集体已经发表或撰写过的作品成果 对本文的研究作出重要贡献的个人 和集体 均已在文中以明确方式标明 本人完全意识到本声明的法律结果由本 人承担 学位论文作者签名 舷 日期 2 矽i 汐年易月 日 学位论文使用授权声明 本人完全了解中山大学有关保留 使用学位论文的规定 即 学校有权保 留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电子版和纸质版 有权 将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进入学校图书馆 院系资料 室被查阅 有权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索 可以采用复印 缩印或其他方法保存学位论文 学位论文作者签名i 叼每碲 日期 硇口年汐月 日 导师签名 日期 d 存歹月岁日 信号蛋向t o r 与杆状病毒感染和昆虫细胞凋亡的关系 士 日 j吾 杆状病毒 b a c u l o v i r u s 是 类重要的无脊椎动物病毒 具囊膜 基因组为一 条分子量在8 0 一l8 0k b 之间的闭合环状双链d n a 其宿主主要为鳞翅目 双翅目 和膜翅目昆虫 由于杆状病毒的寄主专一 对人畜安全 且能引起昆虫流行病的发 生 因而在害虫生物防治中具有广阔的应用前景 l u m i l l e r 1 9 9 6 杆状病毒科 b a c u l o v i r i d a e 包括四个属 伍 杆状病毒属 a l p h a b a c u l o v i r u s b 杆状病毒属 b e t a b a c u l o v i r u s 丫 杆状病毒属 g a m m a b a c u l o v i r u s 和6 杆状病毒属 d p i t a b a c u l o v i r u s 其中 a 杆状病毒属的模式种是苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒 a u t o g r a p h ac a l i f o m i c am u l t i p l en u c l e o p o l y h e d r o v i r u s a c m n p v 杆状病毒在其生 活史中存在两种病毒粒子 芽生型病毒粒子 b u d d e dv i r u s b v 和包埋型病毒粒 子 o c c l u s i o nd e r i v e dv i r u s o d v v o l k m a ne t a l 1 9 7 6 b v 主要在宿主细胞之间 进行传播 而o d v 位于包涵体 o c c l u s i o nb o d y o b 内 通过口服感染在虫体之 间进行传播 f e d e r i c i 1 9 9 7 磷脂酰肌醇 3 激酶 p h o s p h a t i d y l i n o s i t o l3 k i n a s e p 1 3 k 是一个包括许多脂质 激酶的蛋白家族 兼具蛋白激酶和脂质激酶活性 d h a n de ta 1 1 9 9 4 n u r n b e r g 2 0 0 3 p 1 3 k 由一个调节亚基 p 8 5 和一个催化亚基 p 1 1 0 组成 c u i l y e t a l 2 0 0 6 可被多种受体激酶激活 s t o y a n o v e t a l 1 9 9 5 当激活受体后 p 8 5 调节亚基先被 激活 并募集p 1 10 催化亚基到细胞膜附近 活化后的p l l o 进而催化膜内的磷脂酰 肌醇二磷酸 p h o s p h a t i d y l i n o s i o l 4 5 b i s p h o s p h a t e p i p 2 磷酸化成为磷脂酰肌醇三 磷酸 p h o s p h a t i d y l i n o s i t o l 3 4 5 b i s p h o s p h a t e p i p 3 p i p 3 作为第二信使激活a k t 和肌醇磷脂依赖性激酶一l 3 p h o s p h o i n o s i t i d e d e p e n d e n tp r o t e i nk i n a s e l p d k 1 等 多种激酶 a k t 和反转录病毒a k t 8 中的致癌因子v a k t 为同系物 且与p k a 和p k c 具有 同源性 因而又称作蛋白激酶b p r o t e i nk i n a s eb p k b s c h e i d w o o d g e t t 2 0 0 1 a k t 是p 1 3 k 重要的下游分子 包括至少有3 种形式 a k t l a k t 2 和a k t 3 它们调 控细胞多种生理过程 其中a k t l 促进细胞存活和增殖 a k t 2 参与胰岛素调节的代 谢过程 而a k t 3 则对细胞的大小以及数目起着重要的调节作用 r o s e n s h e 信号蛋白t o r 与杆状病毒感染和昆虫细胞凋亡的关系 2 0 0 6 a k t 激活是通过磷酸化其3 0 8 位苏氨酸 t h r 3 0 8 和4 7 3 位丝氨酸 s e r 4 7 3 完成的 磷酸化后的a k t 可调节下游多种信号分子 包括哺乳动物雷帕霉素靶点蛋 白 m a m m a l i a nt a r g e to fr a p a m y c i n m t o r b c l x l b c l 2 相关死亡促进因子 b c l x l b c l 2a s s o c i a t e dd e a t hp r o m o t e r b a d 天冬氨酰特异性的半胱氨酸蛋白酶 c y s t e i n ea s p a r t i ca c i cs p e c i f i cp r o t e a s e c a s p a s e 家族 糖原合成激酶3 g l y c o g e n s y n t h a s ek i n a s e 3 小鼠双微体 2 m u r i n ed o u b l em i n u t e2 和叉头框 f o r k h e a db o x 蛋白家族等 在调节细胞存活 糖原代谢 细胞周期和有丝分裂等方面发挥重要作 用 d a t t a e t a l 1 9 9 9 y a o c o o p e r 1 9 9 5 t o r 是一种与p 1 3 k a k t 通路相关的蛋白激酶 它是调节细胞存活 增殖和血 管生成的信号转导途径中的重要调控蛋白 t o r 通过磷酸化激活m r n a 翻释相关 的蛋白1 7 0 核糖体蛋白s 6 激酶 p 7 0r i b o s o m a ls 6k i n a s e p 7 0 s 6 k 从而增强 m r n a 的转录和翻译 另外t o r 还能通过磷酸化抑制真核起始因子4 e 结合蛋白 1 e u k a r y o t i ci n i t i a t i o nf a c t o r4 eb i n d i n gp r o t e i n l 4 e b p 1 等的活性 a k t 通过直接 或间接磷酸化m t o r 的s e r 2 4 4 8 位点而激活m t o r 提高m r n a 翻译的效率 从 而增加一系列与细胞生长和分化相关蛋白的表达 加快肿瘤的发生 s t a m b o l i ce ta l 1 9 9 8 在果蝇中 幼期时敲除t o r 基因导致了成体形态变小 敲除t o r 基因的 细胞形态变小 w u l l s c h l e g e r e t a l 2 0 0 6 p 1 3 k a k t t o r 信号通路是一条在进化上高度保守的信号通路 在人类 果蝇 线虫 酵母中都发现了该信号通路存在 许多病毒在感染细胞的过程中可通过调节 控制细胞存活的信号通路 以利于病毒复制 p 1 3 k a k t t o r 信号通路就是其中之 一 c o o r a y 2 0 0 7 j i l i u 2 0 0 8 有研究表明 卡波希氏瘤疱疹病毒 k a p o s i s s a r c o m ah e r p e s v i r u s 感染内皮细胞后诱发p 1 3 k a k t m t o r 信号通路的活化 从而 调节细胞信号转导使其利于病毒有效复制 w a n g d a m a n i a 2 0 0 8 此外 人巨 细胞病毒 c y t o m e g a l o v i r u s j o h n s o ne ta 1 2 0 0 1 和柯萨奇病毒b 3 c o x s a c h i ev i r u s e s f a n d i a r e ie l a l 2 0 0 4 在细胞中的的有效复制也都需要p 1 3 k a k t m t o r 通路的 激活 几乎所有哺乳动物病毒在感染过程中都可以调节p 1 3 k a k t r o t o r 信号通路 b u c h k o v i c he t a l 2 0 0 8 但是 对于无脊椎动物病毒 如杆状病毒 如何调节该 2 信号蛋自t o r 与杆状病毒感染和昆虫细胞凋亡的关系 信号通路却鲜有研究 此前本室在研究p 1 3 k a k t 信号通路在a c m n p v 感染草地贪 夜蛾 s p o d o p t e r af r u g i p e r d a s o 细胞过程中的重要作用时 发现a c m n p v 可以 通过p 1 3 k 途径激活s t 9 细胞中的a k t p 1 3 k a k t 信号通路的失活将抑制病毒d n a 合成 病毒晚期和极晚期蛋白质表达以及子代病毒产生 x i a oe ta l 2 0 0 9 在此 基础上 本文对p 1 3 k a k t 信号通路上的信号蛋白t o r 在a c m n p v 感染s t 9 细胞 过程中的作用进行研究 结果表明a c m n p v 感染s o 细胞能够磷酸化激活细胞中 的t o r t o r 特异性抑制剂雷帕霉素可抑制a c m n p vd n a 在s o 细胞中的复制 由于p 1 3 k a k t t o r 信号通路在调节细胞存活和凋亡过程中起着关键性的作用 本 文也对该信号通路与s f 9 细胞凋亡的关系进行了初步探索 结果表明雷帕霉素抑制 并推迟了放线菌素d 诱导的s 侈细胞凋亡 本研究为更加全面和完整地研究杆状病 毒在感染过程中如何调节p 1 3 k a k t t o r 信号通路 以及p 1 3 k a k t t o r 信号通路 与鳞翅目昆虫细胞凋亡的关系奠定基础 信号蛋白t o r 与杆状病毒感染和昆虫细胞凋亡的关系 第一章文献综述 1 1 杆状病毒与细胞凋亡 杆状病毒占所有已知昆虫病毒的6 0 以上 是一类在自然界中仅感染节肢动物 的病毒 其宿主主要是鳞翅目 双翅目和膜翅目的昆虫 因此 杆状病毒是所有已 知病毒种类中对人类最为有益的病毒 其作为一类重要的昆虫流行病病原因子 可 有效地控制农林害虫的发生 且对环境不造成污