（生物化学与分子生物学专业论文）里氏木霉swollenin在米曲霉中的表达和纯化.pdf

浙江理工大学学位论文版权使用授权书 学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留 并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅或借阅。 本人授权浙江理工大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进 行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于 保密口，在 不保密口 。 学位论文作者签名：书劭 日期：伽jo 年弓月v f 日 年解密后使用本版权书。 指导教师签名： 日期：妒o 年 弓月刎日 本研究由 国家8 6 3 计划 ( n o 2 0 0 7 a a 0 2 1 7 0 3 ，n o 2 0 0 7 a a l 0 0 5 0 4 ) 和浙江省自然科学基金 ( n o y 3 0 8 0 1 8 3 ) 提供资助 at h e s i ss u b m i t t e dt oz h e j i a n gs c i t e c h u n i v e r s i 钾 - f o r d e g r e e o fm a s t e ro fs c i e n c e c a n d i d a t e sn a m e ： 业n gm 逊丛a 一 s u p e r v i s o r ： s u b m i s s i o nd a t e ： 坠金。2 q q 2 研究生学号 0 7 2 0 2 010 40 浙江理工大学硕士学位论文 摘要 s w o ll e n i n 蛋白与植物e x p a n s i n 相似，虽然本身没有水解活性，但是能够使 滤纸能结晶纤维素结构疏松，协同纤维素酶降解纤维素，因其对棉纤维的膨胀作 用被命名为s w o l l e n i n ，基因名为s w o 。 纤维物是地球上最丰富的碳水化合物，在生产能代替汽油的化学物质方面具 有良好的应用前景。但是，用纤维素酶降解纤维材料使得该过程花费高。因此， 尽管s w o l l e n i n 和植物e x p a n s i n 本身缺乏水解活性，它们在纤维素酶降解纤维材 料的过程中具有非常重要的作用。植物e x p a n s i n 跨物种表达困难，分离纯化的分 离方法不能满足工业上的需要，而s w o l l e n i n 蛋白则有在微生物宿主中异源表达 的优势，能够通过微生物发酵提高s w o l l e n i n 的产量，从而满足应用需要。目前 对s w o l l e n i n 蛋白的研究主要集中在该蛋白的活性方面，而很少有培养基成分和 培养条件对s w o l l e n i n 蛋白活性影响的研究。 s w o 基因编码4 9 3 个氨基酸残基，生物信息学方法预测s w o l l e n i n 蛋白分子 量为5 1 5k d ，等电点为4 8 。对s w o l l e n i n 蛋白的结构域分析表明，它主要有纤 维素结合域、e x p a n s i n - e g 4 5 和e x p a n s i n c b d 三个结构域。对该蛋白的二级结构 分析表明，它以p 折叠和无规卷曲为主，催化域的结构最为松散。我们成功表达 了重组米曲霉中的s w o l l e n i n 蛋白，并以该蛋白的协同活性为指标，对碳源、氮源 等培养基成分和部分培养条件进行了优化并得到最适合s w o l l e n i n 表达的培养条 件：以甘油为碳源，以花生饼粉为氮源，接种量为1 5 1 0 7 个孢子4 0m l 培养基， p h5 6 ，培养8 8 h 。在该发酵条件下，s w o l l e n i n 的最高产量为5 0m g l 。分别用亲 和层析和离子交换层析对发酵液中的s w o l l e n i n 蛋白进行纯化，但是亲和层析分离 得到的蛋白没有协同活性，可能原因是蛋白变性；用硫酸铵沉淀和离子交换层析 两步法成功分离得到s w o l l e n i n 蛋白，纯化后蛋白的纯度为9 5 1 ，总回收率为 5 3 2 ，从1 l 发酵液中分离得到2 6 6m gs w o l l e n i n 蛋白。最后，我们对纯化蛋白 的协同活性进行了研究，结果表明，纯化后的s w o l l e n i n 蛋白具有显著的协同活性， 当含有0 。0 6f p u 纤维素酶和3 0 0i t gs w o h e n i n 蛋白g 滤纸的混合溶液作用于滤纸 时，水解产生的还原糖含量比对照多8 1 7 。 关键词s w o l l e n i n ：米曲霉；膨胀素；纯化；协同活性 浙江理工大学硕士学位论文 a bs t r a c t t h es w o l l e n i np r o t e i ni ss i m i l a rt op l a n te x p a n s i n , i tc a na c to nc e l l u l o s em a t e r i a l s a n dc a u s el o o s es t r u c t u r e ，p r o m o t ec e u u l a s et od e c o p o s i t o nc e l l u l o s ed e s p i t et h el a c ko f h y d r o l y t i ca c t i v i t yi t s e l f t h ep r o t e i nw a sn a m e ds w o l l e n i na n dt h eg e n ew a sn a m e d s w o ld u et oi t sa b i l i t yt os w e l lc o t t o nf i b e r s c e l l u l o s ei st h em o s ta b u n d a n tf o r m so fc a r b o h r r d r a t ei nn a t u r ea n dr e p r e s e n t s p o t e n t i a lf e e d s t o c k sf o rt h ep r o d u c t i o no fc h e m i c a l st or e p l a c ep e t r o l e u m o na c o m m e r c i a ls c a l e ，t h ec o n v e r s i o no fc e l l u l o s i cb i o m a s s r e q u i r e st h eu s eo f c e l l u l a s et h a t m a k e st h ep r o c e s sm o r ec o s t l y a c c o r d i n g l y ，t h ea c t i v i t yo fs w o l l e n i na n dp l a n t e x p a n s i ni sv e r yh e l p f u lt oc e l l u l o s ed e c o m p o s i t i o nb yc e l l u l a s ed e s p i t et h el a c ko f h y d r o l y t i ca c t i v i t yt h e m s e l v e s h o w e v e r ，i ti sd i f f i c u l tt oe x p r e s sp l a n te x p a n s i ni n o t h e rs p i e c e s ，o n l yp u r i f i c a t i o nc a nn o tm e e tt h ei n d u s t r i a ln e e d , s w o l l e n i nh a v ea n a d v a n t a g ei nt h a ti tc a nb ee x p r e s s e dh e t e r o l o g o u s l yi nad i f f e r e n tm i c r o o r g a n i s mh o s t ， a n dt h u st h ee x p r e s s i o nl e v e lc a nb ei m p r o v e dt h r o u g hm i c r o o r g a n i s mf e r m e n t a t i o n m o s to ft h ep r e v i o u sw o r k so ns w o l l e n i nm a i n l yf o c u s e do nt h e i n v e s t i g a t i o no f s w o l l e n i na c t i v i t y ，l i t t l ei n f o r m a t i o na b o u tt h ee f f e c t so fm e d i u mc o m p o s i t i o na n d e x p r e s s i o n c o n d i t i o n so nt h ep r o d u c t i v i t yo fs w o l l e n i n p r o t e i ni sa v a i l a b l e t h es w o lg e n ee n c o d e sap o l y p e p t i d eo f4 9 3a m i n oa c i dr e s i d u e s ，t h e b i o - i n f o r m a t i c ss o f t w a r ea n a l y s i sr e s u l ti n d i c a t e st h a tt h ep r e d i c t e dm o l e c u l a rw e i g h t a n dp io ft h ep r o t e i nw a s51 5k da n d4 8 ，r e s p e c t i v e l y t h es w o l l e n i np r o t e i nh a st h r e e m a i n l yd o m a i na sf o l l o w s ：c e l l u l o s eb i n d i n gd o m a i n , e x p a n s i n e g4 5d o m a i na n d e x p a n s i n - c b d t h es e c o n d a r ys t r u c t u r eo fs w o l l e n i ni sm a i n l yp - s h e e ta n dr a n d o nc o i l ， e s p e c i a l l yt h e s t r u c t u r eo fc b di st h em o s tl o o s y w es u c c e s s f u l l ye x p r e s s e dt h e s w o l l e n i np r o t e i ni nr e c o m b i n a n ta s p e r g i l l u so r y z a e ，w i t hr e g a r dt ot h es w o l l e n i n b i o a c t i v i t y ，i n v e s t i g a t i o n so nt h ee f f e c t so fc u l t u r ec o m p i s i t o n ( s u c ha sc a r b o ns o u r c e a n dn i t r o g e ns o u r c e ) a n dc u l t u r ec o n d i t i o n sd e v e l o p m e n tw e r ep r e s e n t e dh e r e t h e o p t i m a lc o n d i t i o n sw e r ed e t e r m i n e da sf o l l o w s ：c u l t i v a t i o ni nt h em e d i u m 、析mg l y c e r i n a n dp e a n u ta st h ec a r b o na n dn i t r o g e ns o u r c e ，r e s p e c t i v e l y ，研也t h e1 5 10 7 s p o r e si n 4 0 m lc u l t u r e ，a tp h5 6 ，a n de x p r e s s i o nf o r8 8h u n d e rt h ea b o v eo p t i m a lc o n d i t i o n s ， t h eh i g h e s tp r o d u c t i v i t y ( 5 0 m g l ) o fs w o l l e n i nw a sa c h i e v e d s w o l l e n i ni nc u l t u r a l 浙江理工大学硕士学位论文 s u p e t n a t a n t w i l l s p u r i f i e db ya f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h y a n dc a t i o n i c e x c h a n g e c h r o m a t o g r a p h y ，b u tt h es w o l l e n i np u r i f i e db ya f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h yd i dn o ts h o w s y n e r g i s t i ca c t i v i t y ，t h ep r o b a b l er e a s o ni st h a tt h ep r o t e i nh a db e e nd e n a t u r e d ；t h e s o l u b l es w o l l e n i np r o t e i n sw e r et h e ns u c c e s s f u l l yr e c o v e r e df r o mt h ec u l t u r a l s u p e r n a t a n tb ya n a m o n i u ms u l f a t ep r e c i p i t a t i o na n dc a t i o n i ce x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h y t h ep u r i t ya n do v e r a l l r e c o v e r yo ft h es w o l l e n i nw a s9 5 1 a n d5 3 2 a f t e r p u r i f i c a t i o n , r e s p e c t i v e l y 2 6 6m gs w o l l e n i nc o u l db ep u r i f i e df r o m1l f e r m e n t a t i o n m e d i u m f i n a l l y ，t h es y n e r g i s t i ca c t i v i t yo fp u r i f i e ds w o l l e n i nw a si n v e s t i g a t e d ，a n dt h e p r o t e i ne x h i b i t e das i g n i f i c a n ts y n e r g i s t i ce f f e c to nc e l l u l o s eh y d r o l y s i s 、析也c e l l u l a s e w h e nam i x t u r ec o n t a i n i n go 0 6 f p uc e l l u l a s ca n d3 0 0l x go fs w o h c n i np e rgo ff i l t e r p a p e rw a se v a l u a t e d , t h er e l e a s e dr e d u c i n gs u g a ry i e l dw a s81 7 h i g h e rt h a nt h a to f c o n t r 0 1 k e yw o r d ss w o l l e n i n ；a s p e r g i l l u so r y z a e ；e x p a n s i n ；p u r i f i c a t i o n ；s y n e r g i s t i ca c t i v i t y 浙江理1 二大学硕士学位论文 摘要 目录 i i v a b s t r a c t 目录 缩略语 第一章文献综述 l 2 1 1 概述2 1 2 纤维材料的结构特征3 1 2 1 纤维素的组成结构3 1 2 2 植物材料的结构特征4 1 3 纤维素的生物降解6 1 3 1 酶解机制6 1 3 2 纤维素降解中的非酶因子7 1 4 膨胀因子e x p a n s i n 及其膨胀作用8 1 4 1e x p a n s i n 的分类8 1 4 2e x p a n s i n 的结构一9 1 4 3e x p a n s i n 的作片j 机制1 0 1 4 4e x p a n s i n 的生化性质l l 1 4 5e x p a n s i n 的生物功能12 1 4 6 其他物种中的e x p a n s i n 1 2 1 5 真菌s w o l l e n i n 1 3 1 5 1s w o l l e n i n 的研究进展1 3 1 5 - 2 真菌s w o l l e n i n 对纤维素材料的膨胀作用及其在降解纤维素中的协同作用。1 4 1 6 论文的选题依据1 5 1 7 主要研究内容1 6 第二章序列分析 1 7 2 1 生物信息学工具1 7 2 2 方法1 7 2 3 结果17 2 3 1s w o l l e n i n 蛋白氨基酸序列1 7 2 3 2 理化性质预测1 8 2 3 3 疏水性分析1 9 2 3 4 信号肽的预测2 0 2 3 与功能位点分析2 0 2 3 6 二级结构的预测2 2 2 3 7s w o l l e n i n 氨基酸序列同源性分析2 2 2 4 本章小结2 3 第三章s w o l l e n i n 蛋白的表达 3 1 主要材料与试剂2 4 3 1 1 菌种2 4 3 1 2 纤维素酶作用底物2 4 w 浙江理工大学硕士学位论文 3 1 3 试剂2 4 3 1 4 试剂的配制2 4 3 2 主要仪器2 6 3 3 方法2 6 3 3 1 菌种活化2 6 3 3 2 摇瓶发酵培养2 6 3 3 3s d s p a g e 电泳分析2 7 3 3 4 发酵液的活性测定2 8 3 3 5 还原糖浓度测定方法：2 9 3 4 结果与讨论2 9 3 4 1s w o l l e n i n 的表达情况分析2 9 3 4 2 葡萄糖标准曲线3 0 3 4 3 发酵液与纤维素酶的协同活性3 l 3 5 本章小结。3 2 第四章培养基成分和培养条件的优化 4 1 材料与试剂3 3 4 1 1 材料3 3 4 1 2 试剂3 3 4 1 3 试剂配制3 3 4 2 主要仪器3 3 4 3 方法3 4 4 3 1 碳源的优化3 4 4 3 2 氮源的优化一3 4 4 3 3 微量元素的影响3 4 4 3 4 最适接种量的选择3 4 4 3 5 发酵时间的选择一3 4 4 3 6 起始p h 的选择一3 5 4 4 结果与讨论3 5 4 4 1 反应p h 对纤维素酶活性的影响3 5 4 4 2 碳源的优化3 5 4 4 3 氮源的优化3 8 4 4 4 微量元素的影响3 9 4 4 5 接种量的影响3 9 4 4 6 发酵时间的选择4 0 4 4 7 起始p h 的选择4 l 4 5 本章小结4 2 第五章s w o l l e n i n 蛋白的纯化及活性研究 5 1 材料与试剂4 4 5 1 1 材料4 4 5 1 2 试齐u z m 5 1 3 试剂配制4 4 5 2 主要仪器4 5 5 3 方法4 6 5 3 1 亲和层析4 6 v 浙江理工大学硕七学位论文 5 3 2c m - s e p h a r o s e 离子交换层析4 6 5 3 3 蚩白浓度的测定4 8 5 3 。4 回收率的计算4 8 5 3 5s w o l l e n i n 蛋白对纤维素水解的协同作用4 9 5 3 6s w o l l e n i n 蛋白浓度对协同活性的影响4 9 5 4 结果与分析5 0 5 4 1 亲和层析5 0 5 4 2 离子交换层析5 l 5 4 3b r a d f o r d 定量5 3 5 4 4 回收率5 4 5 4 5s w o l l e n i n 蛋白对纤维素水解的协同作用5 4 5 4 6s w o l l e n i n 蛋白浓度对协同活性的影响5 5 5 5 本章小结5 6 总结 参考文献 致谢 5 8 5 9 6 3 浙江理工大学硕士学位论文 嚼 b l a s t b p b s a c i ) n a c b d d n s f p u m n c b i o d p a g e r p m s d s t e m 匣d t r i s 缩略语 b a s i ca l i g n m e ms e a r c h t o o l b a s ep a i r b o v i n es e r u ma l b u m i n c o m p l e m e n t a r yd e o x y r i b on u c l e i ca c i d c e l l u l o s eb i n d i n gd o m a i n 3 , 5 - d i n i t r o s a l i c y l i ca c i d f i l t e rp a p e ru n i t k i l l o d a l t o n n a t i o n a lc e n t e rf o rb i o t e c h n o l o g yi n f o r m a t i o n o p t i c a ld e n s i t y p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s r e v o l u t i o n s p e rm i n u t e s o d i u md o d e c y ls u l f a t e 十二烷基硫酸钠 n n n ，n t t e t r a m e t h y l e t h y l e n e d i a m i n en , n , n ，n 四甲基乙二胺 t r i s0 a y d r o x y m e t h y l ) a m i n o m e t h a n e 3 羟甲基氨基甲烷 浙江理丁大学硕士学位论文 1 1 概述 第一章文献综述 石油、煤炭等矿产资源是当前最主要的能源物质和化工原料，但是它们不可 再生，大量消耗必将导致快速枯竭，这将导致现代工业化社会的发展规模难以维 系。寻找可再生的替代能源和化工原料，已成为维持人类社会可持续发展的紧迫 任务。利用高新技术手段开发生物质能源，已成为当今世界发达国家能源战 略的重要内容。 生物质是太阳能最主要的吸收器和储存器，这些能量是人类发展所需能源的 源泉和基础。生物质能既不同于常规的矿物能源，又有别于其他新能源，兼有两 者的特点和优势，是人类最主要的可再生能源之一。 生物质具体的种类很多，植物类中最主要也是我们经常见到的有木材、 农作物( 秸秆、稻草、麦秆、豆秆、棉花秆、谷壳等) 、杂草、藻类等。 纤维素是自然界分布最广、含量最多的一种多糖，是植物细胞壁的骨架物质， 占植物干重的3 5 - - 5 0 。一些植物纤维几乎是纯纤维素，如棉纤维的纤维素含 量接近1 0 0 ，为天然的最纯纤维素来源，麻纤维中纤维素含量为7 0 8 0 ，一 般木材中，纤维素占4 0 5 0 。纤维素是地球上最丰富、最廉价的可再生资源， 如何把纤维素转化成为人类可以直接利用的能源和资源，是人们长期渴望解决的 重大课题。当今世界，能源和资源日趋危机，开发高效转化木质纤维素类可再生 资源的技术，利用工农业废弃物等发酵生产燃料、化工产品和解决环境污染问题， 具有极其重要的意义和发展前景。2 0 世纪3 0 年代，巴西就已经开始用甘蔗进行 发酵生产乙醇燃料，目前，它是世界上唯一不使用纯汽油做汽车燃料的国家。 1 9 7 9 年，美国采用生物质燃料直接燃烧发电，在2 0 世纪9 0 年代建立了利 用稻壳等纤维素废料发电的电站。 纤维素酶是多组分酶系，在分解纤维素时起生物催化作用。自从1 9 0 6 年s e i l l i e r e 在蜗牛消化道中发现纤维素酶以来，人们就开始关注纤维素的微生物 降解问题。后来发现纤维素经微生物降解后，可转化为燃料、饲料及化工产品等 生产原料，且有望解决因自然界不断产生的工农业废弃物导致的环境污染问题， 2 浙江理t 大学硕+ 学位论文 于是纤维素酶得到了广泛的关注。随着人们对纤维素酶的深入研究，越来越多具 有不同结构和功能的纤维素酶被发现，使得纤维素酶的应用日益广泛。但是由于 对纤维素酶的结构了解得不够透彻，对其功能也还缺乏足够的了解，使得纤维素 酶在工业上的高效应用受到很大的局限。 1 2 纤维材料的结构特征 1 2 1 纤维素的组成结构 纤维素大分子的基环是d 一葡萄糖以p 1 ，4 糖苷键组成的大分子多糖， 分子量约5 0 k 2 5 0 0 k ，相当于3 0 0 , - 一1 5 0 0 0 个葡萄糖基脱水葡萄糖，其分子 式为：( c 6 h 1 0 0 5 ) n ，其化学组成含碳4 4 4 4 、氢6 1 7 、氧4 9 3 9 。 纤维素不溶于水和乙醇、乙醚等有机溶剂。 f i g1 1 纤维素的结构 f i g1 1t h es t r u c t u r eo fc e l l u l o s e 纤维素是线形葡萄糖，葡萄糖残基间形成大量氢键，相邻分子间氢键使带状 分子彼此平行地连在一起，这些纤维素分子链都具有相同的极性，这些相邻、平 行的伸展链在残基环面的水平向通过链内和链间的氢键网形成片层结构( s h e e t s t r u c t u r e ) ，这样若干条链聚集成紧密的有周期性晶格的分子束，称微晶( c r y s t a l l i t e ) 或胶束( m i c e l l e ) t 。多个这样的平行胶束组成了微纤丝( m i c r o f i b r i l ) ，若干个微纤 丝又组成大纤丝( m a c r o f i b r i l ) ，构成自然界不同类型、不同长度、不同大小的纤 浙江理工大学硕士学位论文 维素纤维。 在自然界中，纤维素分子一般与半纤维素、木质素一起以复合体形式存在， 形成较复杂的网状结构。天然的纤维素中存在排列相对松散的、不规则的无定形 区，其分子密度小，分子间隙小，定向差；除此之外，还存在分子密度大、平行 排列的结晶区。至今已发现固态纤维的五种结晶变体，即天然纤维素( 纤维素d ， 人造纤维素i i 、人造纤维素i 、人造纤维素、人造纤维素v 【2 】。纤维素的这种 结晶结构非常牢固，使细胞壁具有高强度，导致纤维素对生物降解的天然抗性【3 】。 纤维素具有两个结构特点：首先，纤维的各个分子包装的非常密，组装成细 胞壁、表皮等超结构，酶等大分子和水等小分子都不能渗透；其次，结构晶体化， 分布离散。纤维素的结构复杂性和不溶于水的性质给其处理过程带来很大的困 难，使得人们在研究各种纤维素酶，尤其是内切葡聚糖酶时，常用高水溶性的羧 甲基纤维素作为底物，但是这在一定程度上削弱了纤维素酶分解纤维素的意义， 毕竟羧甲基纤维素和天然的不溶于水的纤维素在结构和性质上还是有差别的，人 们希望用纤维素酶来处理大量的天然纤维素。 1 2 2 植物材料的结构特征 植物纤维是最主要的纤维原料，而纤维素则是植物纤维细胞细胞壁的主要成 分。植物细胞壁由胞间层( i n t e r c e l l u l a rl a y e r ) 、初生壁( p r i m a r yw a l l ) 以及次生壁 ( s e c o n dw a l l ) 组成( 图1 2 ) 。初生细胞壁的主要成分是多糖，蛋白以及一些离子 ( 图1 3 ) ，而多糖主要是纤维素，半纤维素和果胶质；次生壁又分内( s 1 ) 、( s 2 ) 、 外( s 3 ) 三层，外层和内层都很薄，只有中层最厚，占次生壁厚度的7 0 9 0 ， 主要成分是纤维素、半纤维素和木质素。次生壁中积累的生物质占植物生物质总 量的绝大部分，它是地球上生物质的主要形式和人类所需纤维材料和生物能源原 料【4 】。 4 浙江理工大学硕士学位论文 i 敲：藕舶l a t v i a 图1 2 植物细胞壁的亚显微结构 f 逛1 2t h es u b m i c r o s c o p i cs t r u c t u r eo fp l a n tc e l lw a l l 图1 3 初生细胞壁的纤维结构 r i g1 3t h ef i b e rs t r u c t u r eo fp r i m a r y c e l lw a l l 构成细胞壁的结构成分中，9 0 是多糖( p o l y s a c c h a r i d e s ) ，包括纤维素，半 纤维素、果胶物质，它们是由葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖醛酸等聚合而成；此外 还含有结构蛋白、酶类、木质素以及矿物质等( 表1 1 ) 。 (rj|兰 浙江理工大学硕士学位论文 表1 1 从悬浮培养的细胞分离的细胞壁的组成 t a b l e1 1t h ec o m p o s i t i o no fc e l lw a l ls e p a r a t e df r o ms u s p e n d e dc u l t u r e dc e h 1 3 纤维素的生物降解 在纤维素的生物降解过程中，除了微生物产生的纤维素酶的酶解作用，还发 现了一些新的蛋白因子。 1 3 1 酶解机制 纤维素酶是降解纤维素生成纤维素分子链、纤维二糖和葡萄糖的一类酶的总 称，主要作用于p 1 ，4 葡萄糖苷键，由于降解纤维素的微生物所产生的纤维素 酶是多种具有不同功能的组分，所以纤维素酶又有纤维素酶复合物之称。在纤维 素酶的分类上，最初是1 9 5 0 年由美国的r e e s e 等1 5 j 提出了c 1 c x 的概念。认为 主要包括c 1 酶、c x 酶和p 一葡萄糖苷酶。这三种不同的酶协同作用，且必须同 时存在，才能将纤维素彻底地水解为葡萄糖。c 1 酶主要作用于天然纤维素，进 攻纤维素的非结晶区，形成新的游离末端；c x 酶又可分为c x l 酶和c x 2 酶，c x l 酶是内断型纤维素酶，作用于水合非结晶纤维素分子内部的p 1 ，4 糖苷键，生 成纤维糊精和纤维二糖，c x 2 酶为外断型纤维素酶，作用于水合非结晶纤维素分 子非还原端的p 1 ，4 糖苷键；1 3 一葡萄糖苷酶将纤维二糖水解成两个葡萄糖分子， 因此又被称为纤维二糖酶。 目前公认的纤维素酶的分类方法是，根据各种酶催化反应功能的不同可分 为l ，g - i s 一葡聚糖水解酶或p 一1 ，4 一葡聚糖内切酶( 1 , 4 一p d g l u c a n g l u c a n o h y d r o l a s e 或e n d o - 1 ，4 - 1 3 d g l u c a n a s e ，e c 3 2 1 4 ，来自真菌的简称e g ， 6 浙江理工大学硕+ 学位论文 来自细菌的简称c e n ) 、外切葡聚糖酶( 1 ，4 d d g l u c a nc e l l o b i l h y d r o l a s e 或 e x o 1 4 - 1 3 d g l u e a n n a s e ，e c 3 2 1 9 1 ，来自真菌的简称c b h ，来自细菌的简 称c e x ) 和d 一葡聚糖苷酶( p 1 ，4 g l u c o s i d a s c ，e c 3 2 1 2 1 ，简称b g ) ，其 中葡聚糖水解酶作用于纤维素多糖链内部的无定型区，随机水解p 1 ，4 糖苷 键，将长链纤维素分子截短，产生大量的带有非还原性末端的小分子纤维素；外 切葡聚糖酶作用于还原性和非还原性的纤维素多糖链的末端，水解p 1 ，4 糖 菅键，每次切下一个纤维二糖分子，故又称为纤维二糖水解酶( c e l l o b i o h y d r o l a s e ) ： b 葡聚糖苷酶可水解纤维二糖或可溶性纤维糊精产生葡萄糖。 由于人们没有重视纤维素分子的结晶结构对降解的影响，在现代实验技术飞 速发展的情况下，虽然目前对纤维素酶水解纤维素的机理已基本清楚，但是高效 降解天然结晶纤维素的问题仍未得到解决，致使多年来进行的提高纤维素酶解效 率的工作成效不大。纤维素酶本身与淀粉酶在比活力方面差异不大，但是它们酶 解纤维素和淀粉的速度却差异较大，其主要原因是纤维素与淀粉的结构差异。 1 3 2 纤维素降解中的非酶因子 一些研究【鲫】通过蒸汽爆破等物理、化学方法对纤维材料进行预处理，结晶 区被“无定形”化后的纤维材料很容易被纤维素酶完全水解，水解速率与淀粉酶相 似，具有良好的应用前景。 纤维素糖苷键的酶解已被大量研究，一部分研究也显示，在纤维素的生物降 解过程中，除了酶解机制外还有其它降解机制或因子的存在。1 9 世纪5 0 年代初， r e e s e 等【5 j 提出能够破坏纤维素结晶结构的“氢键酶”的存在，但是至今仍没有研 究能很好地证实他的这一观点【1 0 1 。k n o w l e s 等人和阎伯旭等人f 1 2 1 对c b d 进 行的研究均证实了c b d 具有协同降解纤维素的作用，会破坏纤维素分子的高级 结构，但是不产生还原糖，即不水解糖苷键；另外还发现一些微生物产生的蛋白 和作用因子具有诱导和调节纤维素酶降解纤维底物的功能【1 3 1 4 1 。近年来在研究 中还发现一些低分子量的因子，这些组分虽然没有纤维素水解活性，但是能够促 进纤维素酶对结晶纤维素的降解【1 5 ，1 6 1 ，这些研究对人们研究纤维素的降解机制 有重要意义。 近年来，人们在植物细胞壁中发现了一类新的蛋白家族，被称为e x p a n s i n ( 膨 7 浙江理工大学硕十学位论文 胀素) 。该蛋白的发现起始于1 9 8 9 年c o s g r o v e 对黄瓜下胚轴的研究，该研究显示， 在对植物细胞壁进行酸诱导生长实验时，细胞壁仅在实验开始伸长很快，随后1 2 h 膨胀变慢，但黄瓜下胚轴细胞壁的膨胀持续时间比较长，这表明黄瓜下胚轴细 胞壁有稳定的壁膨胀机制。1 9 9 2 年，c o s g r o v e 实验室的m c q u e e n m a s o n 等首次用 细胞壁扩张体外重组方法从黄瓜幼苗下胚轴伸长区中分离鉴定出一种特异性蛋 白，这是一个重要突破。该蛋白能在离体条件下恢复变性细胞壁的伸展活性，而 其他蛋白质没有发现有这种性质。它能恢复热失活后的黄瓜下胚轴细胞壁的伸展 现象，而且细胞壁的伸展强度和动力学性质均与正常生长的细胞壁类