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原花青素提取方法的研究进展【摘要】原花青素是一种具有重要生理活性的多酚类化合物。本文综述了天然原花青素的提取方法,其中包括有机溶剂提取、微波提取、超声波提取、超临界CO2萃取以及酶法等,以期为开发利用原花青素提供依据。【关键词】原花青素;提取方法;研究进展原花青素(简称PC)是植物界中广泛存在的一大类多酚类化合物。植物化学家通常将从植物中分离得到的一切无色的、在无机酸存在和加热处理下能产生红色的花青素(Cyanidin)的一类多酚化合物统称为原花青素。许多研究表明,原花青素是清除自由基很强的抗氧化剂,其抗氧化、清除自由基的能力是VE的50倍、VC的20倍,它能防治80多种因自由基引起的疾病,包括心脏病、关节炎等,还具有改善人体微循环功能。目前,原花青素已广泛应用于食品、药品、化妆品等领域。全世界对原花青素的研究越来越深入,其中对原花青素提取方法的研究是一大重点。原花青素传统的提取方法是有机溶剂提取法,但这种方法存在着对有效成分损失大、周期长、工序多、提取率不高等缺点,因此近10年来,在植物有效成分的提取方面出现了许多新技术、新方法,如超临界CO2萃取技术、超声波提取技术、微波萃取技术以及酶解技术等。现将原花青素提取方法综述如下。1原花青素的分类及分布原花青素是一大类多酚化合物的总称,起初统称归于缩合鞣质或黄烷醇类。最简单的原花青素是儿茶素、表儿茶素或儿茶素与表儿茶素形成的二聚体。此外,还有三聚体、四聚体等直至十聚体。按聚合度的大小,通常将二四聚体称为低聚体(ProcyanidolicOligomers,简称OPC),将五聚体以上的称为高聚体(ProcyanidolicPolymers,简称PPC)。OPC为水溶性物质(PPC水溶性较差)、极易吸收;OPC消除自由基的能力与分子结构、聚合度有关。二聚体中,因两个单体的构象或键合位置的不同,可有多种异构体,易分离鉴定的8种结构形式分别命名为B1B8,其中,B1B4是由C4C8键合,B5B8是由C4C6键合。在各类原花青素中,二聚体分布最广,研究得最多,也是最重要的一类原花青素。三聚体中,也因组成的单体及其相连接碳原子位置的不同形成各种各样的结构并命名为C1、C2等,其中C1在自然界中分布最丰富。研究表明,原花青素主要分布于以下的植物中:葡萄、英国山楂、单子山楂、花生、银杏、日本的罗汉柏、北美的崖柏、土耳其的侧柏、花旗松、白烨树、野生刺葵、番荔枝、野草萄、日本莽草、扁桃、高粱、耳叶番泻、两谷椰子、可可豆、贯叶金丝桃、头状胡枝子、粘胶乳香树、海岸松、洋萎陵菜和大黄等。2提取方法21水提取法由于有机溶剂会带来环境污染和产品的有毒有机物残留,人们在大力发展对环境友好的绿色提取技术水提取法。Masquelier最早从松树皮中用沸水粗提、乙酸乙酯纯化得到原花青素。1998年Duncan和Gilmour发明一种从植物材料(树皮、树叶、葡萄籽、皮、大豆、绿茶)中提取原花青素的方法。将材料粉碎(15mm),常压、60100或高压100125条件下采用脱氧热水提取(1min20h),过滤采用超滤或反渗透或两者连用,浓缩滤液,真空喷雾或冷冻干燥,此法主要是提取分子量5000D的水溶性原花青素,得率为05100之间,通常为6596(随取样部位的差异而定),分离得到原花青素B1、B3、B6和C2。获得的产物对AAPH引发的亚油酸的氧化有明显抑制作用,1gmL能达到7079的抑制率。毒理学检测表明:对于按人体重剂量给药组和100倍人体质量的剂量给药组24h内无毒害和副作用产生,慢性毒理学(5个月)试验也无明显毒、副作用。1999年Karim等人发明了在加压条件下,采用脱氧去离子水提取植物材料中的原花青素。将提取液超滤后,采用疏水性微孔聚合物树脂作填料的柱色谱方法,选用极性洗脱液(乙醇水)洗脱,将洗脱液采用反渗透方法除去乙醇,干燥得到原花青素。选水作为提取剂,浸提耗时长,温度高,容易造成原花青素的损失;同时水的极性较大,溶出杂质也较多,很少单独使用。22传统有机溶剂提取传统的有机溶剂提取法有回流、渗漉及恒温水浴等方法。甲醇、丙酮、乙醇和乙酸乙酯是提取葡萄籽原花青素常用的有机溶剂,它们对原花青素有很好的溶解性,它们的极性大小顺序为甲醇乙醇丙酮乙酸乙酯。乙醇是常用的提取溶剂,价格低廉,来源丰富。乙酸乙酯提取出的原花青素成分生物活性较好,但是由于极性较小,对原花青素的提取并不完全。甲醇和丙酮水溶液(5075)对原花青素都有较好的提取性能,同时也多用做原花青素含量测定时的提取溶剂。熊何健等人比较了甲醇、乙醇、丙酮水溶液对多酚的提取效果,结果表明:70丙酮水溶液为最好溶剂。丙酮水溶液提取效果好的原因:原花青素分子含有多个苯环和醚键,油溶性较强,同时又有大量的羟基连接在分子骨架上,在水中具有很好的溶解性,拥有油水双溶性的丙酮与之相互匹配,原花青素的溶解度自然增加,其提取率相应得到提高。Sun等人认为葡萄籽中的原花青素物质通常以结合态与蛋白质、纤维素结合在一起,一般不易提出,通常选用有机溶剂或水提取,具有断裂氢键的作用。同时由于有机溶剂的渗透性较差,一般不单独使用,常需要水作为传质剂。Romanczyk等人发明从可可中提取原花青素时,对脱脂可可豆用质量分数70甲醇去离子水提取后,再用质量分数70丙酮去离子水溶剂提取2次,真空浓缩,除去有机溶剂后,再溶于水中,用CHCl3提取,其水相用乙酸乙酯提取后,真空浓缩除去乙酸乙酯,水相冷冻干燥,得到原花青素。由于有机溶剂提取时间长,对热不稳定成分易被破坏,杂质含量高,不易纯化,萃取溶剂消耗量大以及污染环境等缺点,许多学者都在研究开发新型提取方法。23微波辅助提取法微波辅助提取过程中,微波辐射导致植物细胞内的极性物质,尤其是水分子,产生大量热量,使得细胞内的温度迅速上升,液态水汽化产生的压力将细胞膜和细胞壁冲破,形成微小的孔洞,进一步加热,导致细胞内部和细胞壁水分减小,细胞收缩,表面出现裂纹。由于孔洞和裂纹的存在,胞外溶剂容易进入细胞内,溶解并释放细胞内原花青素。微波的频率很高,能深入渗透物体,对细胞的结构有较大作用。微波加热的热效率高,温度升高快速而均匀,因此,应用微波加热提取手段,能够显著缩短提取时间,较大程度地提高原花青素的提取效率。刘征涛等人发明了一种采用频率为2450MHz或915MHz、功率为50015000W的微波对葡萄籽在选自水、碳链长为C1C3的醇、乙醚、丙酮、乙酸乙酯、甲苯或其混合物的溶剂中进行处理,从葡萄籽提取原花青素类物质的新方法。该方法较常规化学法工艺简便、高效、快速,成本低,废液排放量少。王克亮等人利用微波辅助提取葡萄整籽中的原花青素,研究了不同操作条件及不同因素对原花青素浸取率的影响。试验结果表明,对葡萄整籽最佳提取条件为:浸泡时间48h,固液比13,微波作用时间30min,溶剂浓度40,占空比30。当满足上述条件时浸取率高达5976。经正交分析可知,在5个影响因素中微波作用时间和溶剂浓度对原花青素浸取率的影响最显著。李凤英等人研究了微波对葡萄籽原花青素的浸出和结构的影响。结果表明,以乙醇为介质,微波处理有利于葡萄籽中原花青素的浸出,葡萄籽整粒用料液比(gL)11的体积分数70乙醇溶液,微波处理10s,在50水浴浸提30min,原花青素浸提量为4109mgg,较不用微波处理同等水浴条件浸提量增加1715mgg。通过对微波联合水浴浸提和单纯水浴浸提的原花青素的紫外图谱显示短时微波处理对原花青素的分子结构没有破坏作用。微波辅助提取原花青素根据提取设备的不同一般提取时间从几分钟到几十分钟不等,同时在操作方面也具有一定的优越性,但是提取过程使用了有机溶剂,这是微波辅助提取的最大缺点。24超声辅助提取法应用超声技术来强化提取过程,可有效提高提取效率,缩短提取时间,而且,超声波破碎过程不会改变被浸泡的化学成分的结构和性质。超声的机械作用通过破坏细胞壁和加强细胞内的传质作用,提高了植物中有机化合物的提取速度。超声波在液体内传播时,液体介质不断受到压缩和拉伸,在拉力作用下,液体断裂形成暂时的近似真空的空洞,压缩时,这些空洞就会发生崩溃,出现局部高温以及放电现象,产生空化作用。超声波空化可以从稳态空化转化成瞬态空化,空化泡瞬间长大破裂,吸收的能量在极短的时间和极小的空间内释放出来,形成高温高压的环境,同时伴随有一定强度的冲击波和微声流,从而破坏细胞壁结构,使其在瞬间破裂,释放细胞内的有效成分,使溶剂渗透到细胞中,令其中的化学成分溶于溶剂中,从而大大提高了提取率。在提取原花青素之类的热敏性物质显示出了优越的性能。钟振声等人研究了从葡萄籽中提取原花青素的改进工艺,主要考察超声波作用对原花青素提取率和提取物含量的影响,并与传统溶剂法进行了对比。试验表明,把风干的葡萄籽破碎成061mm的微小颗粒,先按1g葡萄籽加3mL溶剂的比例加入石油醚,常温浸泡48h脱除油脂;再按照1g葡萄籽加20mL溶剂的比例,分别用乙醇(C2H5OH)95、丙酮(CH3COCH3)99和纯水在常温下浸泡2h,浸泡期间采用超声波震荡加强传质,原花青素的提取率分别达到463、459和255(以葡萄籽的投料质量计算),提取率分别比不施加超声波震荡的传统溶剂提取法提高11、66和48。吴澎等人采用超声波法,用乙醇作提取溶剂从西伯利亚白刺果籽中提取原花青素,研究了各种提取条件对白刺籽原花青素提取率的影响。试验结果表明,白刺果籽中原花青素提取的最佳工艺条件是:体积分数60,乙醇为浸提剂,超声波辅助提取,提取时间为20min,提取3次,料液比为1g4mL。波兰Oszmianski1996年申请专利,以丙酮为溶剂,采用超声波从葡萄籽中提取低聚原花青素,乙酸乙酯在18萃取,三氯甲烷沉淀产物。超声辅助提取原花青素根据提取设备的不同一般提取时间从几十分钟到一两个小时不等,但是提取过程使用了有机溶剂,这也是超声辅助提取的最大缺点。25超临界CO2萃取超临界CO2萃取是近20年来迅速发展起来的一种新型萃取分离技术,它是以超临界状态下的CO2流体为溶剂来提取分离混合物的过程,具有很强的溶解能力和渗透能力以及良好的流动性和传递性。超临界CO2萃取正越来越多的用于葡萄籽中原花青素的萃取,其萃取率高,而且使原花青素不受到空气和光的影响,但由于设备昂贵,推广使用比较困难。孙云鹏等人发明一种采用超临界CO2加丙酮和水组成的极性改性剂,从银杏叶中萃取原花青素的方法。在萃取温度6090,萃取压力2035MPa下加入5080丙酮与2050水组成的极性改性剂,萃取时间24h,进行静态、动态萃取。萃取液经传统的树脂浓缩和喷雾干燥器干燥,得到精制银杏叶提取物。产品含银杏黄酮甙35g100g,萜内酯8g100g,原花青素7g100g,酚酸5mgkg。该法的优点是流程短,能萃取最强的天然抗氧化剂原花青素。成智涛等人以“紫秋”刺葡萄种子为原料,采用单因素试验和正交试验,探讨了超临界CO2萃取刺葡萄籽原花青素的工艺。研究结果表明,最佳的萃取条件为萃取压力30MPa、萃取温度55、料液比108、60的乙醇为夹带剂、萃取时间60min,在此条件下,原花青素的产率为1758mg100g,纯度可达897。胡佳兴等人以原花青素含量为指标,考察了萃取温度、压力、CO2流量、萃取时间4个因素对葡萄籽中原花青素的超临界CO2流体萃取的影响。研究结果表明,以甲醇做夹带剂,药材质量30g,萃取压力32MPa,萃取温度40,CO2流量为10Lh的条件下萃取60min为最佳工艺。超临界CO2萃取法提取葡萄籽中原花青素耗时少、准确、效率高。吴朝霞等人采用超临界CO2萃取技术提取葡萄籽中低聚原花青素,并初步分析了产物的构成。结果表明,不使用夹带剂时,不能萃取出低聚原花青素;甲醇或乙醇作为夹带剂时可以增加低聚原花青素的提取率,且甲醇效果更好,但总体提取率仍较低;进一步的色谱分析表明,产物中含有儿茶素、表儿茶素及两种二聚体。超临界CO2萃取原花青素需要使用丙酮、水、甲醇或乙醇等极性改性剂作夹带剂,提取的效果也根据提取设备和提取的条件的不同而不同,一般提取时间从几十分钟到一两个小时。26酶提取法酶反应较温和地将植物组织分解,可以较大辐度地提高收率,故不失为一种最大限度从植物体内提取有效成分的方法,是一项很有前途的新技术。目前,应用较多的是纤维素酶,大部分植物的细胞壁是由纤维素构成的,植物的有效成分往往包裹在细胞壁内,纤维素酶是一组复合酶,能够水解纤维,使植物细胞壁破坏,充分释放细胞内含物,有利于对有效成分的提取,进而提高物料的利用率。吴春等人以葡萄籽中原花青素的提取率为指标,采用单因素法和正交设计法对纤维素酶解法提取工艺条件进行优选。试验结果表明,影响酶法提取原花青素的因素次序为:酶解温度酶解浓度pH值乙醇浓度,其最佳工艺条件为:酶解浓度为010,酶解温度为50,pH值为55,乙醇浓度为60,所得葡萄籽中原花青素的提取率为416。使用酶法提取原花青素环保无污染,是今后研究的一个重要方向。3展望原花青素是一类有特殊医疗保健功能的多酚物质,在化妆品、保健品、药品及多种饮料产品上都有着广泛的开发应用价值,且富含原花青素的野生植物非常丰富,提取天然原花青素,符合当今人们对保健品的新要求。原花青素的提取从传统的溶剂萃取法到微波辅助法、超声辅助法、超临界CO2萃取以及酶法的应用,总体来说,原花青素的提取效率和安全性都有所提高,对应的提取成本也就有所提高。对于不同的原花青素,要根据其所要达到的目的和具备的条件,采用不同的提取方法。为了达到最好的提取效果,可以将几种提取方法配合使用,例如可首先采用超临界CO2萃取葡萄籽油后再采用其他方法提取剩余物中的原花青素,这样可以排除油的存在对提取原花青素的影响。随着科学理论的不断发展,研究工作的深入,将会有更多、更有效的原花青素的提取方法涌现出来,并且各种提取方法也将逐步走向标准化。所有这些必将为原花青素的利用提供有利的技术支持。参考文献1MasquelierJPlantextractwithaproanthocyanidinscontentastherapeuticagenthavingradicalscavengereffectandusethereofPUSA,4698360198504092DuncanKandGilmourIProcessforExtractionofProanthocyanadinsfromBotanicalMaterialPUSA,5968517,199910193KarimNM,ThomasTS,WilliamASMethodforextractionofproanthocyanidinsfromplantmaterialUSA,5912363,199906154熊何健,陈益梅,吴国宏,等葡萄籽多酚提取条件的优化J食品工业科技,2004,25(4):1151165SunBS,PintoT,LeandroMC,etalTransferofcatechinandproanthocyanidinsfromsolidpartsofthegrapeclusterintowineJAmJEnolVitic,1999,50(2):1791846RomanczykLJ,HammerstoneJF,BuckMMProcyanidincompositionsandmethodsformakingthesamePUSA,6479539,200211127刘征涛,倪红,陈复微波提取葡萄籽中原花青素类物质的方法P中国,1281857,200101318王克亮,白光辉微波辅助提取原花青素最佳工艺条件的研究J兰州理工大学学报,2006,32(1):79819李凤英,崔蕊静,李春华采用微波辅助法提取葡萄籽中的原花青素J食品与发酵工业,2005,31(1):394210钟振声,冯焱,孙立杰超声波法从葡萄籽中提取原花青素J精细化工,2005,22(1):414311吴澎,王明林超声波辅助法提取白刺果籽中原花青素的工艺J食品与发酵工业,2005,31(5):15816012OszmianskiJMethodsofobtainingbiologicallyactiveoligomersofproanthocyanidinsfromplantsPPoland,169082,199613孙云鹏,孙明华,孙传经超临界二氧化碳从银杏叶中萃取含有原花青素物的方法P中国,1228432,1
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