（药理学专业论文）铜对小脑颗粒神经元细胞的作用研究.pdf

铜对小脑颗粒神经元细胞的作用研究中文摘要 铜对小脑颗粒神经元细胞的作用研究 专业 药理学 硕士研究生 蓝秀健 导师 皮荣标副教授 中文摘要 铜是人体内必需的微量元素 正常人血浆铜浓度约为1 5um 微量的铜是细 胞色素氧化酶 超氧化物歧化酶 酪氨酸酶等必需的组成部分 现大量研究工作已表明 环境或基因因素的变化可能会导致铜在体内平衡的 破坏并最终导致各种神经退行性疾病 n e u r o d e g e n e r a t i v ed i s e a s e 如阿尔茨海 默病 a l z h e i m e r sd i s e a s e a d 帕金森病 p a r k i n s o n sd i s e a s e p d 亨廷 顿舞蹈病 h u n g t i n g t o nd i s e a s e h d 而遗传性铜代谢异常更能引起严重的神 经系统变性疾病 m e n k e s 病和w i l s o n 病 m e n k e s 病 1 w i l s o n 病两者基冈5 5 6 0 具有同源性 临床表现亦十分相近 m e n k e s 病由于a t p 7 a 基冈缺陷而导致体内经肠道吸收铜障碍 肝和脑组织内的 铜含量降低 临床有智能减退和共济失调等神经系统变性表现 组织学上特别是 小脑变化具有特征性 包括颗粒细胞层变薄 神经元细胞减少等 w i l s o n 病则由 于a t p 7 b 基因缺陷导致胆道排铜减少 铜与组织中蛋白结合而沉积于神经系统中 引起神经系统变性 组织学及电镜观察显示神经细胞变性坏死 在其毛细血管基 底膜可见高电子密度物质 铜颗粒 沉积等病理改变 铜代谢异常的机理 迄今尚未完全阐明 y a n 等发现低钾可诱导小脑颗粒神 经元 c e r e b e l l a rg r a n u l en e u r o n s c g n s 凋亡 去极化浓度的k 培养液中含 2 5m m o l l 的k c i 抑制体外培养c g n s 的凋亡 而低钾 培养液中含5m m o l l 的 k c i 则诱导c g n s 凋亡 且其凋亡具有典型的形态学和生化特征 包括细胞核 铜对小脑颗粒神经元细胞的作用研究 中文摘要 明显固缩 凝聚和断裂 该模型现已成为研究神经元凋亡及其信号转导机制的经 典模型之一 研究表明 磷脂酰肌醇3 一激酶 p h o s p h a t i d y l i n o s i t 0 1 3 k i n a n e p 1 3 一k 及其下游激酶a k t 一1 与神经元存活密切相关 是神经元存活的重要通路 微量的 铜是否干扰低钾诱导c g n s 凋亡 以及通过什么机制影响c g n s 的存活尚未见报 道 另一方面 近期的研究也表明 铜的神经毒性作用可能与细胞的氧化应激有 关 铜在神经元中与活性氧离子反应并诱导氧自由基的生成 造成细胞内自由基 生成和清除能力失衡 后者进 步导致a t p 合成减少 d n a 损伤和神经元的凋亡 但其详细机制还不完全清楚 而细胞凋亡的发生发展与钙超载作用密切相关 钙 作为凋亡的触发者 可能通过激活钙依赖的核酸内切酶或通过其他效应 调控信 号的转导 细胞内c a 2 浓度升高是细胞损伤的重要原因 细胞内 c e i 的变化可 能是铜诱导神经元细胞凋亡 死亡的关键信号 基于钙在凋亡中的重要作用 任何可抑制钙离子进入细胞的介入方式均可能 有神经保护作用 尼莫地平作为l 型钙通道拮抗剂 可特异性地阻断神经细胞膜 上的c a 2 通道 且对神经元的钙通道有特别高的亲和力 它可能对铜诱导神经元 细胞凋亡 死亡有保护作用 因此 我们设计本课题 在细胞水平上反映铜与神经系统退行性疾病的关系 研究目的 1 利用低钾诱导c g n s 凋亡模型 观察微量的铜对c g n s 凋亡是否具有神经保护 作用 探讨其量效及时效关系 并观察该作用与p 1 3 一k a k t 通路的关系 2 建立铜诱导c g n s 凋亡模型 研究铜与c g n s 的凋亡量效及时效关系 观察多 种药物对铜诱导c g n s 的凋亡是否有保护作用 并研究其作用的机制 观察尼 莫地平对铜诱导c g n s 凋亡是否具有保护作用 并进一步探讨其与r o s 及 c a 2 i 的信号转导机制 研究方法 铜对小脑颗粒神经元细胞的作用研究 中文摘要 1 s d 大鼠乳鼠c g n s 的分离和原代培养 2 以神经元存活率 m 丌法 细胞形态学 相差 h o e c h s t 3 3 3 2 5 8 染色 p i 染色 d n a 凋亡梯带 流式细胞仪 f c m 观察d n a 亚二倍体凋亡峰等为 指标评价铜对c g n s 的双向作用 3 用蛋白免疫印迹法 w b 检测m a p k 级联传导途径3 个成员 p e r k p j n k 和p 3 8 蛋白水平的变化来探讨铜对c g n s 的凋亡的信号转导机制 4 给予多种药物干预微量铜对c g n s 的双向作用 并探讨其机制 5 用激光共聚焦法检测d c f h 荧光来评价铜对c g n s 的损伤作用与r o s 的关 系 6 用激光共聚焦法检澳l j f u r a 荧光探讨铜对c g n s 损伤与 c a 2 i 的关系 7 用激光共聚焦荧光检测法等探讨尼莫地平抗铜对c g n s 损伤的作用机制 结果 1 m t t 结果显示 铜对c g n s 有双向作用 一方面适量的铜可对低钾诱导 c g n s 神经元凋亡有保护作用 l 4 0um o l l 的铜可抗低钾所致的大鼠c g n s 凋亡 明显提高c g n s 的存活率 铜的神经保护作用可以持续7 2h 以上 另一方面 铜可 诱导c g n s 凋亡 甚至坏死 其损伤具有时间和剂量依赖性 其中 铜5 0l x m 作 用2 4h 最适合作为铜诱导的c g n s 凋亡模型 2 通过观察细胞形态学改变 h o e c h s t 3 3 2 5 8 染色 p i 染色 d n a 凝胶电泳 结果等进一步验证 2 0i t m 的铜对低钟诱导c g n s 经元凋亡具保护作用 能够 明显抑制低钾诱导的c g n s 核固缩 碎裂 另一方面 铜诱导的c g n s 凋亡具有时 间和剂量依赖性 高剂量铜 大于5 0l a m 更多的是导致c g n s 坏死 3 f c m 检测亚二倍体峰结果显示 铜 2 0l x m 对低钾诱导c g n s 凋亡具有 保护作用 4 w b 结果显示 铜5 0j t m 作用c g n s l 1 2h 内 p e r k 的表达逐渐加强达峰 值后转弱 以6h 表达最强 p 3 8 也在是1 1 2h 内表达逐渐加强达峰值后转弱 以 3 h 表达最强 而p j n k 在铜5 0 1 x m 作用c g n s l 1 2 h 内无明显的变化 因此 铜对 c g n s 的毒性作用可能激活m a p k 中的e r k 及p 3 8 通路 但可能与j n k 通路无关 铜对小脑颗粒神经元细胞的作用研究 中文摘要 5 激光共聚焦荧光检测法结果显示 铜对c g n s 的毒性作用可能与r o s 及 c a 2 的激活有关 6 m t t 结果显示 磷脂酰肌醇3 一激酶 p 1 3 一k 抑 蛴u l y 2 9 4 0 0 2 可阻断铜的 保护作用 7 m t t 结果显示各种药物对细胞生存率的作用 1 微管蛋白聚合剂 t a x 0 1 对铜诱导c g n s 凋亡无保护作用 2 影响n a k 泵的锂离子对铜诱导c g n s 凋 亡无保护作用 3 j n k 通路上游激酶阻断药c e p 1 3 4 7 对铜诱导c g n s 凋亡无 保护作用 4 j n k 抑制剂s p 6 0 0 1 2 5 对铜诱导c g n s 凋亡也无保护作用 5 n 甲基 d 天 门 冬氨酸 n m d a 拮抗剂m k 8 0 1 对铜诱导c g n s 凋亡无保护作 用 6 尼莫地平对铜诱导c g n s 凋亡有很强的保护作用 7 p 3 8 通路阻断药 s b 2 0 3 5 8 0 对铜诱导c g n s 凋亡有保护作用 8 m a p k 通路阻断药p d 9 8 0 5 9 对 铜诱导c g n s 凋亡有保护作用 9 s b 2 0 3 5 8 0 与p d 9 8 0 5 9 合用对铜诱导c g n s 凋 亡也有保护作用i 一1 0 非特异性钙拮抗剂稀土元素镧对铜诱导c g n s 凋亡有保 护作用 小结 1 首次发现 铜对c g n s 具有双向作用 低浓度的铜对低钾诱导c g n s 凋亡 有保护用 其保护作用在一定的浓度范围内是长时效的 p 1 3 k a k t 信号传导通 路可能参与其保护作用 高浓度的铜可诱导c g n s 凋亡或坏死 且具剂量和时间 依赖性 2 铜对c g n s 的毒性作用可能激活m a p k 中的e r k 及p 3 8 通路 但可能与j n k 通路无关 3 铜对c g n s 的毒性作用可能与r o s 的产生及钙通道的激活有关 4 尼莫地平能较好地阻断铜对c g n s 的毒性作用 提示尼莫地平可能有助 于神经退行性疾病的治疗 关键词 铜 小脑颗粒神经元 凋亡 磷脂酰肌醇3 一激酶 氧化应激 钙通道 尼莫地平 一i v 铜对小脑颗粒神经元细胞的作用研究 英文摘要 t h ee f f e c t so f c o p p e r o nc e r e b e l l a r p g r a n u l ene u r o n s m a j o r p h a m a c o l o g y n a m e l a nx i u j i a n s u p e r v i s o r p r o f e s s o rp ir o n g b i a o a b s t r a c t c o p p e ri sa ne s s e n t i a lt r a c ee l e m e n ti nh u m a n sb o d y a n dt h ec o n c e n t r a t i o no f c o p p e r i nh u m a nn o r m a l p l a s m a i sa b o u t15 g m m a n ye n z y m e s l i k e c y t o c h r o m e o x y d a s e c y t o x u p e r o x i d ed i s m u t a s e s o d a n dt y r o s i n a s e r e l yo n c o p p e ri o nf o rt h e i rs t r u c t u r ea n df u n c t i o n i n f a c t g r o w i n ge v i d e n c eh a sb e i n gc o l l e c t e df o rr e l a t i o n s h i p sb e t w e e nt h e d i s o r d e ro fc o p p e rh o m o s t a s i si nt h eb o d yw h i c hi si n d u c e db yt h ee n v i r o n m e n t a lo r g e n i em u t a t i o n sa n dt h en e u r o d e g e n e r a t i v ed i s e a s e si n c l u d i n ga l z h e i m e r sd i s e a s e a d p a r k i n s o n sd i s e a s e p d a n dh u n g t i n g t o nd i s e a s e h d t h ei m p o r t a n c eo f c o p p e rf o rh u m a n si si l l u s t r a t e db yt w oi n h e r i t e dd i s o r d e r so fc o p p e rm e t a b o l i s m m e n k e sa n dw i l s o nd i s e a s e m e n k e sa n dw i l s o nd i s e a s ea r ep r o v i d e dw i t h5 5 6 0 g e n i eh o m o l o g ya n d t h e i rc l i n i c a lm a n i f e s t a t i o n sa r ea l s ov e r ya l i k e m e n k e sd i s e a s ei sc a u s e db y m u t a t i o n si nt h eg e n ea t p 7 a t h er e d u c e da b s o r p t i o no fc o p p e rf r o mi n t e s t i n a lc e l l s a n dd e f e c t i v ed i s t r i b u t i o na r o u n dt h eb o d yi nt h i sd i s e a s el e a d st or e d u c t i o ni nt h e a c t i v i t yo fi m p o r t a n tc o p p e r d e p e n d e n te n z y m e s k e yf e a t u r e so fm e n k e sd i s e a s ei s p r o g r e s s i v ec e r e b e l l a rd e g e n e r a t i o n i n c l u d i n gg r a n u l a rc e l ll a y e r st h i n n i n g za n d n e u r o n i cc y t o r e d u c t i o n w i l s o nd i s e a s ei sa na u t o s o m a lr e c e s s i v ed i s o r d e rc a u s e db ya m u t a t i o no fa t p 7 b w h i c hr e s u l t si nt o x i cc o p p e rb i n d i n gw i t hp r o t e i na c c u m u l a t e d i nt h eb r a i n p a t i e n t sw i t hw i l s o nd i s e a s es h o wn e u r o l o g i c a ld i s t u r b a n c e si n c l u d i n g v 一 铜对小脑颗粒神经元细胞的作用研究 英文摘要 n e r v ec e l l sd e g e n e r a t i o na n dn e c r o s i s i nt h eb a s e m e n tm e m b r a n eo ft h eb l o o d c a p i l l a r yt h e r ea r es o m ep a t h o l o g i c a lc h a n g e si n c l u d i n ge l e c t r o n d e n s ed e p o s i t i o n s c u p r i cp a r t i c l ed i a m e t e r s t h em e c h a n i s mo fa b n o r m a lc u p r i cm e t a b o l i s mi sn o ti l l u m i n a t e dc o m p l e t e l y n o w y a n st e a md i s c o v e r e dt h a tt h el o wp o t a s s i u m c o n d i t i o n 5m m o l lk c l i n d u c e da p o p t o s i si nc e r e b e l l a rg r a n u l en e u r o n s c g n s a n dt h eh i g hp o t a s s i u m c o n d i t i o n 2 5m m o l lk c l c o u l di n h i b i tt h o s ec g n s sa p o p t o s i s t h ea p o p t o s i sh a d t y p i c a lf e a t u r e so fm o r p h o l o g ya n db i o c h e m i s t r yi n c l u d i n gc e l l n u c l e u sp y k n o s i s c o n d e n s ea n db r e a k a g e t h i sc g n s sa p o p t o s i si n d u c e db yl o wp o t a s s i u mc o n d i t i o n h a sb e e no n eo fc l a s s i cm o d e lf o rs t u d y i n gn e u r o n i ca p o p t o s i sa n dt h es i g n a l t r a n s d u c t i o nm e c h a n i s m s l o t so fr e s e a r c h e s i n d i c a t e dt h a t p h o s p h a t i d y l i n o s i t o l 一3 一k i n a n e p 1 3 一k a n di t sd o w n s t r e a mk i n a s ea k t 1w e r e c o r r e l a t e dw i t hn e u r o n a ls u r v i v a l w h i c hw a sa ni m p o r t a n tp a s s a g e w a yf o rn e u r o n a l s u r v i v a l w h e t h e rd o e st h ec o p p e rp r o t e c tc g n sa p o p t o s i si n d u c e db yl o wp o t a s s i u m c o n d i t i o n w h a ti si t sm e c h a n i s m i fc o p p e rh a sn e u r o p r o t e c t i v ee f f e c t t h e s ew e r e n o tr e p o r t e db e f o r e i na d d i t i o n ag r e a to fr e s e a r c h e si n d i c a t e dt h a tc u p r i cn e u r o t o x i ce f f e c tw a s p o t e n t i a l l yc o n c e r n e dw i t ho x i d a t i v es t r e s s c o p p e ro f i n t r a c e l l u l a rr e a c t sw i t ha c t i v e o x y g e n a n di n d u c e st h e g e n e r a t i o no fo x y g e n f r e er a d i c a l t h ei m b a l a n c ei n p r o o x i d a n t v sa n t i o x i d a n th o m e o s t a s i sr e s u l t si n o x i d a t i v es t r e s s w i t ht h e g e n e r a t i o no fs e v e r a lp o t e n t i a l l yt o x i cr e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s r o s l e v e l so fr o s e x c e e d i n gt h en o r m a ln e e d so ft h e c e l la r ep o t e n t i a l l yv e r yd a n g e r o u sf o rt h e s t r u c t u r a la n df u n c t i o n a li n t e g r i t yo ft h ec e l li t s e l f i nf a c t r o sc a ne i t h e rg r o w s d o w n w a r d sa t pg e n e r a t i o no rd i r e c t l yd a m a g ec e l l u l a rd n a a n dl e a d st on e u r o n i c a p o p t o s i s b u tt h ec u p r i cn e u r o t o x i ce f f e c tm e c h a n i s m sa r en o tc o m p l e t e l yd i s t i n c t s t u d i e sh a v er e v e a l e dt h a tt h ec e l l sa p o p t o t i cd e v e l o p m e n ti sr e l a t e dw i t ht h ec a l c i u m o v e r l o a dp o s s i b l y t h ea b n o r m a li n f l u xo fc y t o s o l i cc a 2 i nn e u r o n si sat r i g g e ro f a p o p t o s i s w h i c hm a ya c t i v a t e n u c l e a t ee n d o n u c l e a s eo ro t h e rp a s s a g e w a y sa n d r e g u l a t es i g n a lc o n d u c t i o n s t h ec y t o s o l i c c a 2 io fn e u r o n sm a yb eak e yp o i n tf o r c o p p e r i n d u c e dc g n sa p o p t o s i so rd e a t h 一v t o na c c o u n to ft h ei m p o r t a n c eo ft h e c a 2 i a n y w a y sw h i c hc a ni n h i b i tt h e a b n o r m a li n f l u xo fc y t o s o l i cc a 2 o fn e u r o n ss h o u l dp o s s i b l yh a v en e u r o p r o t e c t i v e e f f e c t t h ev o l t a g eo p e r a t e dl t y p ec a 2 c h a n n e lb l o c k e r l i k e n i m o d i p i n e w h i c hh a s e x t r ah i g hc h e m i c a lf o r c ew i t hn e u r o n i cc a l c i u m c h a n n e l s m i g h tp a l l i a t et h e p r o g r e s s i o na n dp o s s i b l yp r e v e n tt h em a j o r i t yo fc o p p e r i n d u c e dc g n sa p o p t o s i so r d e a t h a c c o r d i n g l y w ed e s i g n e dt h i sq u e s t i o nf o rs t u d y t h ee f f e c t so fc o p p e ro n c e r e b e l l a rg r a n u l e n e u r o n s t or e f l e c tt h er e l a t i o nb e t w e e nc o p p e ra n dt h e n e u r o d e g e n e r a t i v ed i s e a s e so nc e l l u l a r1 e v e l o b j e e t i v e s o no n eh a n d w eo b s e r v e dw h e t h e rt h ec o p p e rc o u l dp r o t e c ta p o p t o s i so fc g n s i n d u c e d b yl o wp o t a s s i u m i n v e s t i g a t e d i t s q u a n t i t y e f f e c t a n dt i m e e f f e c t r e l a t i o n s h i p s a n ds t u d i e dt h er e l a t i o nb e t w e e nt h i sn e u r o p r o t e c t i v ee f f e c ta n dp 1 3 k a k tp a s s a g e w a y o nt h eo t h e rh a n d w ee s t a b l i s h e dt h e c o p p e r i n d u c e dc g n s a p o p t o s i sm o d e l s t u d y i e di t sq u a n t i t y e f f e c ta n dt i m e e f f e c tr e l a t i o n s h i p s o b s e r v e d t h ee f f e c t so fd i f f e r e n tm e d i c i n e so nt h i sm o d e l d i s c u s s e dt h e i rm e c h a n i s m s i n a d d i t i o n w es t u d i e dt h ee f f e c to f n i m o d i p i n eo nc o p p e r i n d u c e dc g n s a p o p t o s i s a n d o b s e r v e dt h e s i g n a l t r a n s d u c t i o nm e c h a n i s m sa b o u tt h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n n i m o d i p i n e se f f e c tw i t hr o sa n d c a 2 io fc g n s m e t h o d s 1 p r i m a r yc e r e b e l l a rg r a n u l en e u r o nc e l lc u l t u r e sw e r eo b t a i n e df r o mn e o n a t a lr a t s 2 a p o p t o s i sw a si n d u c e db yl o wp o t a s s i u mo rc o p p e ri nc u l t u r e dr a tc e r e b e l l a r g r a n u l en e u r o n s m o r p h o l o g yo fn e u r o n sw a so b s e r v e d b yp h a s e c o n t r a s t m i c r o s c o p ya n dh o e c h s t 3 3 2 5 8a n dp in u c l e u ss t a i n i n g t h en e u r o n a lv i a b i l i t yw a s m e a s u r e d b y m t t d n a f r a g m e n t a t i o n w a sa n a l y z e d b ya g a r o s eg e l e l e c t r o p h o r e s i sa n dt h er a t i oo fa p o p t o t i cc e l l sw a sd e t e c t e db yf l o wc y t o m e t r y v i i 铜对小脑颗粒神经元细胞的作用研究 英文摘要 f c m 3 t os t u d yc u p r i cs i g n a lt r a n s d u c t i o nm e c h a n i s m w e s t e r nb l o tw a su s e df o r a s s e s s m e n to ff o l l o w i n gp r o t e i n s p j n k p p 3 8 p e r k l 2 t o t a lj 3 t u b u l i n 禾t os t u d yc u p r i cm e c h a n i s m so fa c t i o n d i f f e r e n tm e d i c i n 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n i n g m i c r o s c o p e o l y m b u s f v 5 0 0 r e s u l t s 1 a c c o r d i n gt om t ta s s a y c o p p e rh a sb i d i r e c t i o n a le f f e c t so nc g n s o no n eh a n d a p p r o p r i a t ec o p p e r 1 4 0l a m b l o c k e da p o p t o s i so fp r i m a r yc u l t u r e dc e r e b e l l a r g r a n u l en e u r o n si n d u c e db yl o wp o t a s s i u m a n dt h en e u r o p r o t e c t i v e e f f e c t s u s t a i n e df o rm o r et h a n7 2 h o nt h eo t h e rh a n d c o p p e ri nh i g hc o n c e n t r a t i o n i n d u c e dc g n sa p o p t o s i so r a n dn e c r o s i s d a m a g e a n d t h e5 0 l x mc u p r i c c o n c e n t r a t i o np r o c e s s i n gf o r2 4 hc o n d i t i o nw a st h eo p t i m a lf o ra p o p t o s i sm o d e l 2 t h ee f f e c t so fm o r p h o c y t o l o g yc h a n g e h o e c h s t 3 3 2 5 8d y e i n g p id y e i n g d n a l a d d e rf u r t h e rv a l i d a t e dt h ec u p r i cb i d i r e c t i o n a le f f e c t so nc g n s 2 0p 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