（应用化学专业论文）中低密度生物芯片点样仪研制及亲疏水基底研究.pdf

摘要 摘要 生物芯片是指通过微加工工艺同时将大量的探针分子固定到固相支持物上 后与标记的样品分子进行杂交配对，通过检测每个探针分子的杂交信号进而实现 对细胞、蛋白、核酸以及其他生物组分的准确、快捷、大信息量的检测。它是集 物理学、化学、微电子学、机械学和生命科学等相关学科交叉综合的高科技研究 课题，是一门既具有重大的学术价值，又同时具有明显产业化前景的快速发展的 高新科技学科。随着研究的不断深入，人们发现低密度生物芯片是生物芯片进入 临床检测的切入口，因此，作为生物芯片关键部分一点样头也随之进入中低密 度的研究。针对国内外现有微阵列制备技术在中低密度存在的一些不足，主要研 究内容及结果如下： 1 提出一种新型的、实用的微阵列生物芯片制各技术集成化低密度表 面张力驱动微阵列液体转移芯片，根据实际需求与工作原理设计芯片结构由储液 槽、微通道、亲水膜组成。实验使用c 0 2 激光为主要加工设备制作液体转移芯 片，其主要参数：芯片大小为7 5 x 3 0 m m 2 ，内有3 x 8 椭圆阵列，行中心间距为4 m m ， 列中心间距为8 m m ，储液槽为5 x 3 m m 2 ，深2 m m ，微通道设计平均直径为0 5 m m ， 长l m m ，亲水膜附着于微通道尾端中心，平均直径为1 9 7 m m 。 2 参照现有点样仪主要参数，组装点样仪并进行改进，调试。点样仪每次 点样最多2 x 6 片，在点样针高为5 m m 时，最高效率为1 7 0s p o t s s ，最低效率为： 1 7s p o t s s 。分析了操作过程中各参数意义及其设定时应注意的事项。 3 使用自制点样头及点样仪点样。在不同的基底材料上，点样参数相同， 所得样点直径不同，样点直径c v 值均在0 3 以下。采用f i t c 荧光物质样品点 样发现，样点荧光强度基本相同，说明各样点点样体积基本一致；单一样点内荧 光强度呈中间最大、扁平，边缘逐渐衰减，消除了传统针式点样样点内荧光“咖 啡环”效应，样点中间荧光强度大且扁平说明样点内部样品分布均一，能显著提 高样点质量。从点样原理和实验结论对点样过程中的影响因素进行讨论，影响样 点质量的主要因素有点样头本身及基底表面性质、点样过程中因素如点样接触时 间与间隔时间、点样环境因素及样品物化性质等。 4 初步探索了超疏水表面的一般性质，模板法制备了间距缸m ，边长1 4 t m ， 塑l 璧一 _ _ 一一一一 高1 私m 微柱阵列的规则超疏水p d m s 表面，其静态接触角为1 5 1 。制备了亲 疏水图案化基底，对并其在生物芯片点样中的应用作了初步考察，研究表明，亲 疏水基底作为生物芯片基底比具有单一性质基底优越，具体表现为样点面积均一 性良好，形状一致性加强，检测灵敏度得到提高，即很大程度上提高了样点质量。 关键词：微阵列生物芯片；c 0 2 激光加工；点样仪；点样；亲疏水基底 n a b s t r a c t a b s t r a c t m i c r o m a r r a y sb i o c h i p si sae x a c t ，q u i c ka n dh i 【g ht h r o u g h o u td e t e c t i o no fc e l l ， p r o t e i n ，d n aa n do t h e rb i o - c o n s t i t u e n t sb yo b s e r v eh y b r i d i z es i g n so fe a c hs a m p l e ， t h es a m p l el a b e l l e df l u o r e s c e n c em a t e r i a l sh y b r i d i z et op r o b ew h i c hi m m o b i l i z eo n s o l i ds u b s t r a t eb ym i c r o f a b r i c a t o nt e c h n o l o g y m i c r o m a r r a y sb i o c h i p si n t e g r a t e p h y s i c s ，c h e m i s t r y , m i c r o e l e c t r o n i c s ，m e c h a n i c sa n dl i f es c i e n c ea n do t h e rc o r r e l a t i v e f i e l d s i ti sah i g hs c i e n c ea n dt e c h n o l o g yp r o b l e mb o t hw i t hi m p o r t a n c ea c a d e m i c v a l u ea n db r i g h ti n d u s t r i a l i z a t i o nf o r e g r o u n d a sr e s e a r c hf o rm o r et h a n1 0y e a r s ， m i d d l e l o w d e n s i t ys p o ti sas u i t a b l ea p p l i c a t i o nf o rc l i n i cd e t e c t i o n a sar e s u l t ，t h e k e yt e c h n o l o g yo fm i c r o m a r r a y sb i o c h i p s - - - - - d i s p e n s e r , t u mt om i d d l e l o w - d e n s i t y s p o t t i n g r e s e a r c h f o c u so nt h ew e a k n e s s e so ft h ef a b r i c a t em i d d l e l o w - d e n s i t y s p o t t i n gt e c h n o l o g i e sa tp r e s e n t ，t h em a i nw o r ka n dr e s u l t sa r es u m m a r i z e da s f o l l o w s ： 1 p r o p o s e d an e wt y p e ，p r a c t i c a b l y m i c r o m a r r a y sb i o c h i p f a b r i c a t i o n t e c h n o l o g y - _ i n t e g r a t em i d d l e l o w - d e n s i t yd i s p e n s e rs p o t t i n gb ys u r f a c et e n s i o n d r i v i n g a c c o r d i n gt or e q u i r e m e n ta n dw o r k i n gp r i n c i p l e ，t h ed i s p e n s e rc o n t a i n s r e s e r v o i r s ，c h a n n e la n dh y d r o p h i l i cm e m b r a n e c 0 2l a s e rw a su s e dt o a b l a t et h e 7 5 x 3 0 m m 2d i s p e n s e rw h i c hc o n t a i n s3 x 8e l l i p s er e s e r v o i r s e a c hr e s e r v o i ri sa sl a r g e a s5 x 3 m m z ，d e e pi n2 m m t h ec e n t e rd i s t a n c eo fl i n ea n dr o wb e t w e e nr e s e r v o i r sa r e 4 m m ，8 m mr e s p e c t i v e l y t h ec h a n n e lw i t ht h ea v e r a g ed i a m e t e ro f0 5 m m ，l e n g t ho f l m mh a sah y d r o p h i l i cm e m b r a n ew h i c hd i a m e t e ro f1 9 7 r a mo nt h eb o t t o m 2 a s s e m b l e dm i c r o m a r r a y e rs y s t e ma n dd e b u g g i n gb yr e f e r e n c ec o m m e r c i a l m i c r o m a r r a y e r t h em i c r o m a r r a y e rc a ns p o t2 x 6t i m e sa t at i m e ，w i t hah i 【g h e f f i c i e n c yo f1 7 0s p o t s sa n dl o we f f i c i e n c yo f1 7s p o t s sw h i l et h ed i s p e n s e rl i f t sa h i 曲o f5 m m t h em e a n i n go fo p e r a t i o np a r a m e t e ra n dn o t e so fo p e r a t i o na r e a n a l y s i s 3 s p o t t i n gu s i n gs e l f - f a b r i c a t i o nd i s p e n s e r t h es p o td i a m e t e rc h a n g ew i t ht h e s u b s t r a t ec h a n g ea tt h es a m es p o t t i n gp a r a m e t e r , t h ec vo ft h ed i a m e t e ro fs p o t si s h i a b s t r a c t b e l o w0 3 f i t ca sas p o t t i n gs a m p l ef o rr e s e a r c h ，t h ei n t e n s i t yo ff l u o r e s c e n c eo f s p o t sa r ct h es a m ew i t ht h es a m es p o tv o l u m e ；i nas i n g l es p o t ，f l u o r e s c e n c ei n t e n s i t y i sf l a ta n dm a x i m u mi n s i d e ，w h i l ea t t e n u a t et oz e r oa tt h ec d g e t h e “c o f f e er i n g e f f e c tw h i c ho c c u r su s i n gc o n v e n t i o n a lm i c r o m a r r a y e rs p o r i n gw a sd i s a p p e a r e d f l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yi sf l a ta n dm a x i m u mi n s i d em e a n i n gt h a tt h es a m p l ew a s d i s t r i b u t eh o m o g e n e o u si n s i d e ，t h i sc a ni m p r o v es p o tq u a l i t yo u to fq u e s t i o n i n f l u e n c eo fs p o tq u a l i t yw h i c hw a sd i s c u s s e df r o ms p o t t i n gp r i n c i p l ea n dr e s u l t sa s f o l l o w s ：d i s p e n s e ra n ds u b s t r a t e ，c o n t a c tt i m ea n di n t e r v a l t i m ed u r i n gs p o t t i n g ， c i r c u m s t a n c ea n dp h y s i c a l c h e m i c a lc h a r a c t e ro fs a m p l e 4 g e n e r a lc h a r a c t e ro fs u p e r d y d r o p h o b i cw a gs t u d i e d am i c o p i l l a ra r r a yp d m s s u r f a c ew h i c ht h eb i g g e s to fw c ac a nr e a c ht oa b o u t1 5 1 0a tt h es i z e , d i s t a n c e , h e i g h t o ft h em i c r o p i l l a ro f1 4 m ，单m ，1 4 z mr e s p e c t i v e l yw a sp r e p a r e db yi c pe t c h i n g m o d e l s e v e r a ls u b s t r a t e sw i t hh y d r o p h i l i c h y d r o p h o b i cp a t t e r nw e r ef a b r i c a t e da n d d o i n gs o m ep r i m a lr e s e a r c ho fe f f e c to fa p p l i e dt h i s s u b s t r a t et ob i o c h i p s i t s i n d i c a t e st h a ts u b s t r a t e sw i t hh y d r o p h i l i c h y d r o p h o b i cp a t t e r na sab i o c h i ps u b s t r a t e h a v em a n ym e r i t s ：h o m o g e n e o u ss p o ts i z e ，u n i f o r ms p o tt o p o g r a p h y , h i g hd e t e c t i o n s e n s i t i v i t y i naw o r d ，t h i ss u b s t r a t ec a l li m p r o v es p o tq u a l i t yo fb i o c h i p k e yw o r d s ：m i c r o m a r r a y sb i o c h i p s ；c o ：l a s e ra b l a t i o n ；m i c r o m a r r a y e r ；s p o t t i n g ； h y d r o p h i l i c h y d r o p h o b i cs u b s t r a t e 本文中用到的缩写词列表 本文中用到的缩写词列表 英文缩写英文全名中文名 d n a d e o x y r i b o n u c l e i c脱氧核糖核酸 p c r p o l yc h a i nr e a c t i o n聚合酶链式反应 m b 蝎m a s k l e s sa r r a ys y n t h e s i z e r非掩蔽膜阵列合成 器 d m d d y n a m i c m i c r o m i r r o rd e v i c e动态微透镜装置 p o s a mp i e z o e l e c t r i co l i g o n u c l e o t i d e压电寡核苷酸微阵 s y n t h e s i z e ra n dm i c r o a r r a y e r列合成器 c vc o e f f i c i e n tv a r i a t i o n变异系数 p d m s p o l y ( d i m e t h y l s i l o x a n e ) 聚二甲基硅氧烷 m e m sm i c r o e l e c t r om e c h a n i c a ls y s t e m s微机电系统 c c d c h a r g ec o u p l e dd e v i c e 电荷耦合装置 t s p st - s t r u c t u r ep o l y d i m e t h y l s i l a x a n e多聚二甲基甲硅烷 p p l p o l y ( p h e n y l a l a n i n e )聚苯丙氨酸一赖氨 酸 f i t cf l u o r e s c e i ni s o t h i o c y a n a t e荧光素异硫氰酸脂 d p i d o t p e r i n c h分辨率 p p ip i x e lp e ri n c h图像分辨率 3 a p s 3 - a m i n o p r o p y l t r i m e t h o x y s i l a n e 氨基硅烷 i c p i n d u c t i v e l yc o u p l e dp l a s m a感应耦合等离子体 r s dr e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o n相对标准偏差 w c a w a t e rc o n t a c ta n g l e水接触角 p m m a p o l y ( m e t h y l m e t h a c r y l a t e ) 聚甲基丙烯酸甲酯 n d ：y a g n e o d y m i u m ：y t t r i u ma l u m i n u mg a r n e t 钕：钇铝石榴石 1 0 2 厦门大学学位论文原创性声明 兹呈交的学位论文，是本人在导师指导下独立完成的研究 成果。本人在论文写作中参考的其他个人或集体的研究成 果，均在文中以明确方式表明。本人依法享有和承担由此论 文而产生的权利和责任。 声明人( 签名) ：苏f 虱卉 明年么月心日 厦门大学学位论文著作权使用声明 本人完全了解厦门大学有关保留、使用学位论文的规定。厦 门大学有权保留并向国家主管部门或其指定机构送交论文的纸 质版和电子版，有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允 许论文进入学校图书馆被查阅，有权将学位论文的内容编入有关 数据库进行检索，有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密 的学位论文在解密后适用本规定。 本学位论文属于 1 、保密() ，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密( ) ( 请在以上相应括号内打“4 ”) 作者签名： 导师签名： 日期：年月日 日期：年月 日 第一章绪论 第一章绪论 九十年代初生命科学及相关科学研究的需要，促使一门新兴的交叉学科 生物芯片的诞生。生物芯片( b i o c h i p ) 是指通过微加工工艺同时将大量的探针分子 固定到固相支持物上后与标记的样品分子进行杂交配对，通过检测每个探针分子 的杂交信号进而实现对细胞、蛋白、核酸以及其他生物组分的准确、快捷、大信 息量的检测。它是集物理学、化学、微电子学、机械学和生命科学等相关学科交 叉综合的高科技研究课题，是一门既具有重大的学术价值，又同时具有明显产业 化前景的快速发展的高新科技学科。狭义上的生物芯片也称为微阵列生物芯片， 包括基因芯片、蛋白( 多肽) 芯片、多糖芯片和神经元芯片、细胞芯片、组织原 位芯片等种类1 2 l 。 生物芯片的主要特点是高通量、微型化和自动化。芯片上集成的分子微阵列 能在短时间内同时分析大量的生物分子，效率是传统检测手段的成百上千倍。生 物芯片和传统仪器相比具有体积小、重量轻、便于携带、污染小、分析过程自动 化、分析速度快、所需样品和试剂少等诸多优点。 生物芯片技术的飞速发展引起了世界各国的广泛关注和重视。1 9 9 8 年6 月 2 9 日美国宣布正式启动生物芯片计划，美国国立卫生部、能源部、商业部、司 法部、国防部、中央情报局等均参与了此项目。世界大型知名公司如a f f y m e t r i x 、 a g i l e n t 、m e r g o n 也介入这一领域，开发和销售自己的芯片设备和技术。英国剑 桥大学、欧亚公司也正在从事该领域的研究。以生物芯片为核心的相关产业已在 全球崛起。我国政府、科技界和商业界几乎同时意识到生物芯片技术的重大战略 意义和蕴藏的无限商机，开展了生物芯片技术研发。其中最具代表性的事件就是 2 0 0 0 年初由国内从事生物芯片技术研究的多家单位进行强强联合成立了国家生 物芯片技术中心。目前国内已有多家科研单位开始从事这方面的研究。例如，清 华大学、中国科学院、军事医学科学院等几十家单位在国内开展了生物芯片技术 研究，建立了生物芯片技术体系，并己在生物芯片技术和产品开发方面取得了较 大突破。 生物芯片用途广泛，如可以应用于寻找新基因、d n a 测序、疾病诊断、药 厦门大学工学硕士学位论文 物筛选、毒理基因组学研究、农作物优育和优选、环境监测和防治、食品卫生监 督以及司法鉴定等等。生物芯片技术的深入研究和广泛应用，将对2 1 世纪人类 生活和健康产生极其深远的影响。 1 1 微阵列生物芯片的历史及研究现状 1 1 1 微阵列生物芯片的发展简史 2 0 世纪9 0 年代初，为适应“后基因组时代”的到来，产生了一项新的技术， 即以基因芯片为先导的生物芯片技术。从起源上来说，生物芯片技术可追溯到一 个多世纪前。e d s o u t h e r n 等发现被标记的核酸分子能够与另一被固化的核酸分 子进行配对杂交，并建立了现在普遍应用的s o u t h e r n 印迹技术【。因此，s o u t h e r n 印迹可以看作最早的生物芯片。早在1 9 8 8 年，w b a i n s 等人就将短的d n a 片段 固定到支持物上，借助杂交方式进行测序。生命科学与众多相关学科，如计算机 科学、材料科学、微加工技术、有机合成技术等的迅猛发展，为生物芯片技术的 发展提供了理论和技术基础。探针固相原位合成技术和照相平版印刷技术的有机 结合，以及激光共聚光显微镜的引入，促使基因芯片从实验室研究走向工业化应 用。以上这些技术使得合成、固定高密度的数以万计的基因探针分子变得切实可 行，而且借助激光共聚焦显微镜扫描技术可以实现杂交信号进行实时、灵敏、准 确的检测和分析。 从2 0 世纪8 0 年代初杂交测序( s e q u e n c i n gb yh y b r i d i z a t i o n ，s b h ) 的概念的提 出，到9 0 年代初以美国为主开始研究和开发各种生物芯片的短短1 0 年时间，生 物芯片技术获得了迅速发展： ( 堇) 1 9 9 1 年s f o d o r 等人首先提出d n a 芯片的概念【2 】 用光刻技术经过十步 光控合成，制成含有1 0 2 4 个缩氨酸样点的微阵列芯片，并利用落射式荧光显微 镜检验其与单克隆抗体的反应。同年a f f y m e t f i x 公司率先生产了世界上第一块寡 核苷酸基因芯片【3 1 ，用于科研领域。这两个工作开创了制备微阵列生物芯片的原 位合成技术。 ( g ) 1 9 9 5 年，m s c h e n a 首次发表关于基因芯片的论文【4 1 ，介绍他们使用高速 机械手在玻璃片上点上d n a 探针，并利用双荧光标记一次性检测4 5 个基因表 2 第一章绪论 达的结果。该工作则开创了制备微阵列生物芯片的点样技术。 1 9 9 7 年已在a f f y m e t r i x 公司的s f o d o r 充分结合光控合成和激光共聚焦扫 描两种技术，并借助照相平板印刷、计算机、半导体、d n a 合成、荧光标记、 探针杂交及分子生物学的其他技术，创造了第一块成熟的基因芯片【5 1 。 生物芯片技术已成为生物学研究的一种重要手段，同时也显示出很好的市场 开发前景。目前，国际上已有上百家从事生物芯片研究和开发的专业公司。其中， 以应用专利性光蚀刻技术通过原位合成制备寡核苷酸芯片的a f f y m e t r i x 公司被 公认为生物芯片行业的领头羊，主导并影响生物芯片行业的发展方向。 生物芯片的出现和应用，引起了国际上的广泛关注。美国商业权威杂志 f o r t u n e 在1 9 9 7 年3 月刊中以封面为题撰文对生物芯片的重要性进行了阐述， “微处理器在本世纪是我们的经济结构发生了根本改变，基因芯片给人类带 来的影响可能会更大，它可以从根本上改变医学行为和我们的生活质量，从而改 变世界面貌”。s c i e n c e 期刊还把生物芯片技术评选为1 9 9 8 年的世界十大科 技突破之一。 1 1 2 微阵列生物芯片的研究现状 1 121 国外研究现状 在过去的十年里，美国政府和产业界共投入2 0 亿美元用于以基因芯片为主 的生物芯片技术的研究开发与产业化；欧洲与日本对生物芯片的研究支持力度也 越来越大；国际著名跨国公司，如摩托罗拉、惠普、m m 以及日立都开始投资 和开发基因芯片技术；几乎所有的跨国制药公司都投入巨资建立生物技术平台， 开展新药的超高通量筛选和对药物毒理学、药物基因组学等进行研究。美国于 1 9 9 8 年正式启动生物芯片计划。美国国立卫生研究院( h i 、能源部、商业部、 司法部、国防部、中央情报局等均参与了此项目。几乎美国所有的大学和研究机 构如斯坦福大学、麻省理工学院以及a r g o n n eo a k r i d g e 国家实验室都参加了生物 芯片的研究和开发。至今，美国已有多家生物芯片公司产品开始投放市场，纳斯 达克( m 峪d a q ) 反应热烈。 生物芯片的发展方向主要有三个方面【6 】：( 1 ) 无标记杂交信号检测；( 2 ) 高度 自动化的杂交流水作业系统；( 3 ) 强大的数据处理软件。根据芯片载体中的探针 3 厦门大学工学硕士学位论文 数量，可将生物芯片分为高密度生物芯片和中低密度生物芯片。高密度生物芯片 主要用于基因功能研究，疾病相关基因研究和疾病诊断，药物作用机理，毒理研 究与新药筛选等方面。迄今为止，细菌、真菌、植物、高等哺乳动物及人类的高 密度基因表达谱芯片都在研究和开发中。低密度生物芯片主要用于按功能分类的 基因表达谱分析、基因突变检测或特异性抗原抗体检测等领域。低密度生物芯片 主要集中在c d n a 芯片和蛋白质芯片，并相继开发了一系列相关产品。 1 1 2 2 国内研究现状 我国对生物芯片十分重视。早在1 9 9 7 年国家科委( 现国家科技部) 就专门讨 论了生物芯片的发展大计。在基金支持上，2 0 0 2 年国家科技部在8 6 3 高技术项 目中正式启动了功能基因和生物芯片重大专项，对生物芯片研发给予了强大的支 持。在组织机构上，2 0 0 0 年和2 0 0 3 年分别成立了国家生物芯片技术北京工程中 心和生物芯片上海国家生物芯片工程中心。此外，国内从事生物芯片研究和开发 的单位超过几十家。 从目前研究来看，国内尚无成型的高密度芯片研究成功，基本处于研发状态 或与国外进行合作研发。中低密度生物芯片是国内生物芯片技术研究和开发的主 流，但还处于研发阶段，产业化受技术原因( 稳定性、特异性、重复性、敏感性 等) 还无法生产出完全符合潜在客户需要的能实际使用的产品。今年来，在农产 品检测芯片、乙肝病毒基因检测、病毒耐药性检测和病毒分型芯片等方面取得了 较大进展，相关产品也陆续投放市场。 1 2 微阵列生物芯片的基本原理及关键技术 微阵列生物芯片技术包括四个基本步骤【7 1 ，分别是： 芯片微阵列的构建：通常采用硝酸纤维素膜、尼龙膜、玻璃、硅片等固相 支持物作为基底。在构建阵列前首先需要对基底表面进行活化处理，即通过化学 反应用各种不同的活化试剂在基底表面键合上各种各样的活性基团，用来固定各 种不同的活性生物分子。 而阵列的构建则是其中最为关键的步骤，目前构建阵列主要通过原位合成法 或点样法将大量不同探针阵列式固定在基底上。 4 第一章绪论 样品的获得和标记：样品的获得主要通过聚合酶链式反应( p c r ) j 差行体外 扩增，然后用荧光进行标记。 杂交反应：主要是利用特异性的分子间相互作用，如核酸杂交、抗原一抗 体特异行结合、蛋白一蛋白间特异性结合等使已经标记了的待测样品与生物芯片 反应。 信号检测与结果分析：目前主要是利用激光共聚焦荧光扫描仪等检测手段 获取反应信息，经电脑系统处理，分析得到信号值，而这个信号值就代表了结合 在探针上的待测样本中的特定大分子的信息。 以上四个基本步骤包括的细节即是生物芯片技术的关键部分。 1 3 微阵列生物芯片制备技术 微阵列生物芯片以样点的微阵列存在形式为主要特征，所以微阵列的构筑技 术在生物芯片中有着极其重要的地位。目前微阵列生物芯片的微阵列构筑方法主 要有原位合成法( j ns i t us y n t h e s i s ) 和合成后微点样法两大类【8 9 1 ，后者也称合成后 交联( p o s t - s y n t h e t i ca t t a c h m e n t ) 、离片合成等。 1 2 1 原位合成法 原位合成目前多采用光刻合成法、分子印章法、点合成法等，其主要适用于 商品化、规模化的高密度基因芯片的制备和应用领域。 在这种制备技术中，微阵列是在基底上用原位合成的方法逐步制备核酸和一 些其它的生物高聚物阵列。在每步的合成反应中，大量的核苷酸被加入而增加探 针的链长，直至达到所需要的长度。 在原位合成技术中，按合成的方式又分为以下四种： 1 2 1 1 光导化学合成法( 1 i g h t - d i r e c t e dc h e m i c a ls y n t h e s i s ) 光导化学合成法首先是由美国的a f f y m a t r i x 公司发展起来的，它是将光刻技 术( p h o t o l i t h o g r a p h y ) 和固相d n a 合成( s o l i d - p h a s ed n as y n t h e s i s ) 技术有机结合在 一起制造高密度核酸阵列基因芯片的一种技术【2 , 5 1 0 , 1 1 l 。具体步骤主要是先将支持 物表面氨基化或羟基化，即在玻璃上铺上一层连接分子( 1 i n k e r ) ，然后修饰上光敏 保护基团，用光敏保护基团将支持物表面的氨基保护起来。当光线通过掩模( m a s k ) 5 厦门大学工学硕j j 学位论义 照在支持物上时，有光线通过的地方光保护基团脱去，表面氨基被活化。然后加 入第一批羟基保护的脱氧核苷酸，此单体分子就连接到支持物表面的氨基上。接 下去，通过不同的掩摸，光照选择性的激活表面氨基，用另一羟基保护的脱氧核 苷酸取代，并且循环发生着这些化学反应，直至合成所需要序列长度的寡核苷酸 阵列，如图1 1 。如果用氨基酸代替脱氧核苷酸来合成，则得到的是蛋白质芯片。 光导化学合成法主要优点是芯片密度高、分辨率高；以及设计方便，可以直 接制备探针；并且能够标准化、批量化、可靠性高。 光导化学合成法缺点也十分明显：利用光活性基团合成，其合成效率较低， 且每步合成有一定的错误率，导致只能合成较短的寡核苷酸探针( 低于2 5 m e r s ) ， 特异性较差。并且需要用到专利技术和大型复杂设备，造价较高。另外需要花费 大最的时和成本来制备掩模板，因为寡核营酸的每个碱基位需要4 块掩模板，合 成一个2 5 个碱基对的微阵列芯片就需要1 0 0 块掩模板，对杂交和检测的要求亦 高。只能分析一些已知基因，应用面较窄。 罱= 言罱百”“k 。io i 。i 。io i c h e m i c a i i f 甲1 i c 0 “p i 、 h oh 0 0 0 0 嬲目隧；粼 二二出_ 一溯 l l 口砷 i c c p r a k ，c n l 一r a 5 k 锄戳蹦 g tt0 0 0 瀚掰辩黜嚣ttc c 0 搿辫馥鞲。o i 甾盐；渤瞻e 一嗣王主主二主 r e p 到 曩赫裁薯 ttooo 三三三主 c a t at agctg - 了cc g 三主主主王 图1 1a ，光导向寡核苷酸阵列合成流程。b ，光源、掩模和阵列示意图，图片 复制f l 文献 1 1 】 在光导化学合成法当中制作每一块芯片都需要大量的掩蔽模，而制作掩模成 本很高，大大提高生物芯片的制作成本。所以一种不用掩蔽模的光化学合成法 ( m a s k l e s sa r r a ys y n t h e s i z e rm a s ) 1 2 ，1 3 】应运而生，这种方法主要用计算机产生的动 态微透镜装置( d y n a m i cm i c r o m i r r o rd e v i c ed m d ) 代替传统用铬做的掩蔽模，如图 1 2 。 该方法能显著提高合成效率，但制作的芯片密度较低，目6 仃芯片最多只能承 第一章绪论 载8 0 0 0 个探针，还不能得到广泛应用。 图1 2m a s 合成芯片原理示意图，图片复制自文献 a 2 】 i b m 公司所研发成功的光刻胶保护合成法则是在光敏保护基团上的改进 1 4 , 1 5 j 。光刻胶保护合成法首先在基底上涂抹上一层光刻胶，利用光刻显影得到图 案，通常用酸脱去三苯甲基保护基团，露出活性羟基就可以和与脱氧核苷酸氨基 磷酸脂反应，再将基片送入流通池，经过偶联、氧化、戴帽、脱保护和清洗程序， 不断重复这些步骤，按照设计的d n a 序列，就可构建不同密度不同序列的寡核苷 酸芯片。 对于蛋白芯片【1 6 2 1 1 ，一般采用图1 3 制作方法。 该方法适用于制备高密度的阵列芯片，所得芯片精度和准确度非常高，但同 样具有耗时、昂贵的缺点。 7 奎 一 厦门人学工学硕i j 学位论文 ； , 1 1 1 丫了甲? 丫下 ； 心垒 涣豢鼍 图1 3 蛋自芯片光导化学法制作方法不恿，图片复制自文献 2 0 1 2 i 2 点合成法( s p o t s y n t h e s i s ) 点合成法由r o n a l df r a n k 于1 9 9 2 首先年提出【2 1 。该方法的具体步骤是将大 量单独的点阵列式的排列在一层纤维素膜上，然后通过手工或者自动加入一些适 当的样品分别合成每一个不同的点【2 3 - 2 5 1 。 b l a n c h a r d 和h o o d 提出得压电喷印合成法也是一种点合成法。压电喷印合成 法其原理与喷墨打印类似，不过是芯片喷印头和墨盒有多个，墨盒装的是4 种碱 基等液体而不是碳粉。压电喷印合成法非常灵活，可快速合成寡核苷酸阵列。随 后很快发展到p o s a m ( p i e z o e l e c t r i co l i g o n u c l e o t i d e s y n t h e s i z e r a n d m i c r o a r r a y e r ) 2 6 , 2 7 】，该系统主要是利用连接有六条微通道的廉价压电喷印头，其 中四条用来转移氨基磷酸脂前体，另外两条用来转移催化剂和基底表面联结剂， 如图1 4 。合成时整个喷印头利用三维精密移动系统在芯片上移动，根据芯片上 不同位点的序列需要将特定的碱基喷印到芯片的特定位置。该技术采用的化学原 理和传统的d n a 固相合成一致，因此不需要特殊制备的化学试剂。 相对于传统的光化学合成法的耗时、昂贵，点合成法合成过程简单、设备廉 第一章绪论 价、并且能在一天内完成芯片的设计、合成、杂交反应和扫描。但是点合成法所 制备的芯片探针数量较少( 大约9 8 0 0 个) ，这样使其应用有一定的局限性。 嘲：i 瞒 图1 4p o s a m 系统实物图，图片复制自文献【2 6 】 1 2 1 3 微电子刻蚀技术合成法【2 8 】 微电子刻蚀技术主要指利用集成电路工艺中的氧化、化学气相沉积、蒸发、 溅射、光刻、腐蚀等一系列技术预先构建阵列小坑，这些小坑就是d n a 反应池。 然后在小坑内包被氨基硅烷或多聚赖氨酸，使其带上正电荷，以吸附带负电的碱 基。合成时按探针上预定的碱基种类，将芯片浸入该种类的碱基溶液中，每浸入 一次，就增加一个碱基。同样是采用屏蔽掩模系统和光敏覆盖物，重复操作就可 以合成所需要的探针( 图1 5 ) 。 该方法重复操作性好，有利于大批量生产，此外，该方法采用电化学检测方 法，避免使用庞大而又昂贵的激光诱导荧光检测系统，有利于发展芯片实验室。 但是目前来看，这种集成的电化学检测单元的灵敏度、可信度还有待于发展。 螺 竹 a 图1 5 ( a ) ，微流路版 到局部示意图。( b ) ，点阵版图局部示意图。 图片复制自文献【2 8 】 9 厦门大学工学硕士学位论文 l 214 分子印章法 分子印章法是由东南大学吴健雄实验室创建的【2 9 3 3 1 ，其原理如图1 6 所示。 他们设计了一台在片压印半自动合成d n a 芯片的装置，即采用分子印章方法多 次压印原位定点d n a 合成制备基因芯片。该方法首先根据所需制备的寡核苷酸 微阵列设计并制备出一组不同图形有凹凸的微印章，然后根据预先的设计在制备 印章上涂布对应的单核苷酸，最后按照设计的顺序依次压印在同一基片表面。利 用可以自动进行清洗和脱保护、氧化及封闭等化学反应的液体流动池，按照设计 的序列进行原位d n a 合成。每次压印后，基片表面的化学基团被重新激活，进 入下一次压印，在基片表面的活性基团上连接新的化学基团。通过一系列可控的 压印过程，最终得到所需要的序列长度寡核苷酸微阵列。 分子印章法采用商品化的十分成熟的d n a 合成试剂，进行d n s 探针的原 位合成，可节省原料成本和缩短研发周期。该方法利用的软光刻技术使得制备的 硅橡胶分子印章分辨率很高，可以达到亚微米量级。 不过目前分子印章法原位合成只是在化学合成原理上可行，实际应用中还远 远不够，而且其所合成的探针也由于合成效率的影响只能很短( 目前只成功的合 成了2 0 m e r 的寡核苷酸) 。 删咖。 辎a ：西_ 茵宝髓a gc t 至 删。斛| 四十黉至 删鼬叫；豳；霸主， 图1 6 分子印章原位合成芯片流程图 1 0 一碉 粕田 第一章绪论 1 2 2 合成后微点样法 合成后微点样法是采用传统的分子生物学方法预先合成所需的d n a 探 针，然后再通过特定的高速精密机械手将探针直接点在芯片上。常用的机械手有 一套计算机控制的三维移动装置，多个点样头、一个减震底座，上面可放内盛探 针的多孔板和多张芯片。根据需要还可以有温度和湿度控制装置、针洗涤装置， 打印喷印针将探针从多孔板取出直接打印或喷印于芯片上。根据探针转移时针 头有无与芯片接触分为接触式点样和非接触式喷点两种【州。 1 2 2 1 非接触式喷点( n o n c o n t a c ti n k j e tp r i n t i n g ) 3 5 】 非接触式喷点原理与工业喷墨印刷机相同，将探针样品放入印刷针头，然后 移动基底( 或针头) 的位置，来自印刷头的探针样品经加压后通过小口喷射到基片 表面( 图1 7 ) 。非接触式喷点法优点是定量准确，重现性好，使用寿命长，缺点 是喷印斑点大，探针用量大，制作的阵列密度低。根据加压方式不同和喷头不同 又可细分如下几种。 翠兰可兰孥! 竺 图1 7 非接触模式点样工作流程图，图片复制白文献【8 】 压电技术( p i e z o e l e c t r i ct e c h n o l o g y ) 3 5 】 压电技术是用一个压电晶体接通液休贮罐，样品从中吸出，当晶体加上偏压 时，偏压引起晶体变形，挤压玻璃毛细管，从针尖射出少量液休( 图1 8 ) 。 压电技术精度与喷头的口径大小和表面张力密切相关，一般压电喷管喷射体 积在皮升范围内，每秒可达1 0 0 0 - - 5 0 0 0 滴。此技术缺点在于其管口容易堵塞， 容易有气泡存在使得喷射不连续。 注射螺旋管技术( s y r i n g es o l e n o i dt e c h n o l o g y ) 3 6 , 3 7 】 注射螺旋管技术通过高分辨率注射器泵和微螺旋线管阀门有机结合来精确 控制喷射液滴，能提供纳升级的定量分配。高分辨的注射泵连接高速微螺旋阀和 厦门大学工学硕士学位论文 储液槽。注射器连接微螺旋阀，推动注射器使样品朝上移动到针尖，注射器给系 统加压打开微螺旋阀，使液滴注射到基片表面( 图1 9 ) 。 图1 8 压电晶体围绕着玻璃毛细管 的压电分配器，图片复制自文献p 4 】 图1 9 由高分辨注射泵连接一个高速螺 旋阀组成的注射螺旋管喷墨分配器图片 复制自文献 3 4 】 气泡喷射法( b u b b l ej e 0 c a n o n 公司提出的气泡喷射法在探针样品的引入和喷射方式不刚3 “。该法 先在喷头内加入样品，再通过加热器产生固定大小的气