（动物学专业论文）大熊猫基因组bac文库及Ⅱ类mhc基因组物理图谱构建.pdf

浙江大学博士学位论文 大熊猫基因组b a c 文库及 类m h c 基因组物理图谱构建 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果 据我所知 除了文中特别加以标注和致谢的地方外 论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果 也不包含为获得逝鎏盘堂或其他教育机构 的学位或证书而使用过的材料 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均 已在论文中作了明确的说明并表示谢意 学位论文作者签名 曾长军签字日期 2 0 0 7 年8 月2 7 日 浙江大学博士学位论文 大熊猫基因组b a c 文库及 类m h c 基冈组物理图谱构建 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解逝望盘鲎 有关保留 使用学位论文的规定 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘 允许论文被查阅和 借阅 本人授权逝鎏盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索 可以采用影印 缩印或扫描等复制手段保存 汇编学位论文 保密的学位论文在解密后适用本授权书 学位论文作者签名 导师签名 签字日期 年月日 签字日期 年月日 学位论文作者毕业后去向 工作单位 通讯地址 电话 邮编 浙江大学博士学位论文 大熊猫基因组b a c 文库及 类m h c 基因组物理图谱构建 中文摘要 大熊猫 a i l u r o p o d am e l a n o l e u c a 是我国特有的珍稀濒危野生动物 长期以 来 栖息地片段化和种群数量下降 致使其野外仅分布于秦岭 岷山 邛崃 大 相岭 小相岭和凉山等6 个相互隔离的山系 并分化为两个独立的亚种 秦岭 亚种和指名亚种 为抢救性的保护大熊猫这一珍稀濒危物种 我国政府于2 0 0 3 年启动了大熊 猫的离体保护工程 该工程的主要内容之一 就是通过建立大熊猫的基因组d n a 文库 达到保护其遗传资源 并为相关的基础科学研究提供基因材料平台的目的 本论文以细菌人工染色体 b a c 为载体 建立了高容量的大熊猫基因组 d n a 文库 进一步地 通过对大熊猫i i 类主要组织相容性复合体 m h c 基因 组物理图谱的构建 既验证了该文库的有效性 又对文库进行了基础研究的应用 达到了立题目的 其主要研究结果如下 1 以新鲜外周血为材料 利用p c c l b a c 载体 成功构建了大熊猫的基因 组细菌人工染色体 b a c 文库 文库包含的2 0 5 8 0 0 个b a c 克隆 保 存于2 1 0 0 块9 6 孔培养板上 经对随机挑取的1 7 4 个b a c 克隆进行脉冲 电泳检测 计算出文库的平均插入片段为9 7 k b 覆盖大熊猫基因组约6 8 倍 除去5 7 4 的空载体 同时 从文库中获得任一单拷贝或多拷贝大 熊猫基因的概率为9 9 9 3 2 1 6 对p c r 引物平均每对能够在文库中成功扩增到6 4 个阳性克隆 表明 了所建文库具有较高的覆盖率 3 运用4 d p c r 文库筛选技术 建立了大熊猫基因组b a c 文库的高效p c r 筛选文库 该文库包括4 3 个超级库和1 4 6 2 4 3 x 3 4 个1 d 2 d 3 d 4 d 超级亚库 任一引物或探针只需7 7 个p c r 反应 即可从b a c 文库 中筛选到所需的阳性b a c 克隆 4 以大熊猫皮肤成纤维细胞为材料 运用染色体荧光原位杂交 f i s h 技 术 成功地将大熊猫的m h ci i 类基因组定位于第9 号染色体的长臂上 浙江大学博士学位论文 大熊猫基因组b a c 文库及i i 类m h c 基因组物理图谱构建 5 通过g e n b a n k 数据库中的同源序列 设计了1 0 对大熊猫m h ci i 类基因 的特异性引物 并成功扩增到了大熊猫l i 类m h c 的b t l 2 d r a d q a d r b l d o b l m p 2 d m a d m b c o l l l a 2 和d a x x 基因 基因序 列已提交g e n b a n k 数据库 6 运用b a c 克隆的末端测序方法 并利用上述1 0 对引物 构建了大熊猫 m h ci i 类基因组的物理图谱 进一步地 利用限制性酶切指纹图谱法 证明了所构建的物理图谱中的b a c 克隆是有效重叠的 其m h ci i 类基 因组的长度约为6 5 0 k b 关键词 大熊猫 基因组b a c 文库 染色体荧光原位杂交 m h c 基因组染色体 定位 m h ci i 类基因组物理图谱 限制性酶切指纹图检验 2 浙江大学博士学位论文 大熊猫基因组b a c 文库及l l 类m h c 基因组物理图谱构建 a b s t r a c t t h eg i a n tp a n d a a i l u r o p o d am e l a n o l e u c a p a n d ai sr a r ea n de n d a n g e r e ds p e c i e s e n d e m i ct oc h i n a u n f o r t u n a t e l y d u et oh a b i t a tf r a g m e n t a t i o n t h ep o p u l a t i o ns i z eo f g i a n tp a n d ad e c l i n er a p i d l y n o w t h ew i l dg i a n tp a n d a sd i s t r i b u t es i xc o m p l e t e l y i s o l a t e dm o u n t a i nr a n g e ss u c ha sq i n l i n gm o u n t a i n m i n s h a nm o u n t a i n q i o n g l a i m o u n t a i n x i a n g l i n gm o u n t a i na n dl i a n g s h a nm o u n t m n m o r e o v e r t h eg i a n tp a n d a p o p u l a t i o ns h o w ss i g n i f i c a n tg e n e t i cd i f f e r e n t i a t i o na n dy i e l dt w oe v o l u t i o n a r i l y s i g n i f i c a n tu n i t s e s u an e wq i n l i n gs u b s p e c i e sf r o mt h en o m i n a t es i c h u a n s u b s p e c i e s i no r d e rt op r o t e c tt h i sr a r ea n de n d a n g e r e ds p e c i e s t h ec h i n e s eg o v e r n m e n t i m p l e m e n t st h eg e n er e s o u r c e sc o n s e r v a t i o np r o j e c tf o l l o w e db yt h e n s i t ua n d e x s t uc o n s e r v a t i o np r o j e c t so fg i a n tp a n d ai n2 0 0 3 o n eg o a lo ft h ep r o j e c ti s c o n s e r v e st h eg e n e t i cr e s o u r c e sb yc o n s t r u c t i n gt h eg e n o m i cd n a l i b r a r ya n dp r o v i d e t h eg e n er e s o u r c e sp l a t f o r mf o rr e l a t e ds c i e n t i f i cr e s e a r c h a st h em a i np a r to fg i a n tp a n d ag e n er e s o u r c e sc o n s e r v a t i o np r o j e c t t h ep r e s e n t s t u d yi st oc o n s t r u c t i o na n dc h a r a c t e r i z a t i o no fh i g hc o v e r a g eg e n o m i cd n al i b r a r y t h e nf u r t h e rr e s e a r c h ss h o wt h a t t h i sg e n o m i cb a cl i b r a r yi sh i g hq u a l i t ya n d e f f e c t i v eb yc o n s t r u c t i n gp h y s i c a lm a po fm h cc l a s si io fg i a n tp a n d a t h em a i n r e s u l t sa r ea sf o l l o w s 1 t h eg i a n tp a n d ab a c t e r i a la r t i f i c i a lc h r o m o s o m e b a c l i b r a r yc o n s i s t i n go f 2 0 5 8 0 0c l o n e sh a sb e e nc o n s t r u c t e du s i n gt h ew h o l eb l o o da n dp c c l b a c v e c t o r t h ea v e r a g ei n s e r ts i z ew a sc a l c u l a t e dt ob e9 7k bb a s e do nt h e e x a m i n a t i o no f16 4r a n d o m l ys e l e c t e dc l o n e s i n d i c a t i n gt h a tt h eg i a n tp a n d a l i b r a r yc o n t a i n e d6 8 f o l dg e n o m ee q u i v a l e n t s a b o u t5 7 4 n o n i n s e r tc l o n e s w e r eo b s e r v e di nt h e1 7 4c l o n e st e s t e d 1 0o u to f1 7 4 t h ep r o b a b i l i t yo fa n y g i a n tp a n d ag e n eb e i n gf o u n di nt h i sl i b r a r ys h o u l db ea b o u t9 9 9 3 2 t w oo rm o r ep o s i t i v ec l o n e s 2 16 w e r ef o u n df o rt h e s e16l o c i w i t ha n a v e r a g eo f6 4p o s i t i v ec l o n e sp e rl o c u s t h ep c rs c r e e n i n gr e s u l t sw e r et h u s 3 浙江大学博士学位论文 大熊猫基因组b a c 文库及i i 类m i i c 基因组物理图谱构建 i ng o o da g r e e m e n tw i t ha l le x p e c t e d6 8 一f o l dg e n o m i cc o v e r a g eo ft h el i b r a r y 3 c o n s t r u c t i o no fh i g h e f f e c t i v er a p i ds c r e e n i n gl i b r a r i e sb y4 d p c r t h e 2 0 5 8 0 0b a cc l o n e sw e r ed i v i d e di n t o4 3s u p e r p o o l sa n d1 4 6 2 4 3 x 3 4 s u b s u p e r p o o l so f1 d 2 d 3 d 4 d w ec a no b t a i nt h ed e s i r e dp o s i t i v eb a c c l o n e sb ya n yp r i m e r so rp r o b e st h r o u g h7 7p c rr e a c t i o n s 4 t h eg i a n tp a n d am e t a p h a s ec h r o m o s o m e sw e r ep r e p a r e df r o mf i b r o b l a s tc e l l s o fg i a n t p a n d a t h er e s u l t s i n d i c a t et h a tt h em h ci sl o c a t e do nt h e c h r o m o m s e9 q b yf l u o r e s e c e n c e ns t uh y b r i d i z a t i o n 5 w eh a v ed e s i g n e d1 0g i a n tp a n d am h cc l a s si ig e n ep c rp r i m e r sb yt h e h o m o l o g sc o u n t e r p a r to ft h em h c c l a s si ii nt h eg e n b a n kd a t a b a s e a l lt h e p r i m e r sw e r ea m p l i f i e ds u c c e s s f u l l ya n dt h ep c rp r o d u c t so fb t l 2 d r 气 d q a d r b l d o b l m p 2 d m a d m b c o l l l a 2a n dd a x xw e r e s u b m i t t e dt og e n b a n k 6 t h ep h y s i c a lm a po fm h cc l a s si io fg i a n tp a n d aw a sc o n s t r u c t e db y s c r e e n i n gt h eg e n o m i cb a cl i b r a r yu s i n g1 0m h c c l a s si ig e n ep r i m e r s t h e e n ds e q u e n c i n gp r i m e r sw e r ed e s i g n e da c c o r d i n gt op o s i t i v eb a cc l o n e sa n d s c r e e nf u r t h e rt h eg i a n tp a n d ag e n o m i cb a c l i b r a r yt oc o v e rt h eg a p so f p h y s i c a lm a p a c c o r d i n gt ot h er e s t r i c t i o nf i n g e r p r i n ta n a l y s i sa n dt e s t t h e w h o l e p h y s i c a lm a p o fm h cc l a s si ir e g i o nw a s s p a n n i n ga b o u t6 5 0 k b k e y w o r d g i a n tp a n d a g e n o m i cb a cl i b r a r y f l u o r e s c e n c ei ns i t uh y b r i d i z a t i o n c h r o m o s o m em a p p i n go fm h c p h y s i c a lm a po fm h cc l a s si i r e s t r i c t i o n f i n g e r p r i n ta n a l y s i s 4 浙江大学博士学位论文 大熊猫基因组b a c 文库及 类m h c 基因组物理图谱构建 第一章文献综述弟一早义陬琢硷 第一节 基因组学研究的主要内容和方法 基因组 g e n o m e 是w i n k l e r 予1 9 2 0 年首次提出的 w i n k l e r 1 9 2 0 它表 示的是一个物种全部的遗传物质的总和 包括了所有的基因和基因与基因之间的 间隔区域 基因组学的定义及其内容 一个物种的基因组蕴藏着它的生命和 或 繁殖所需的全部生物学信息 而 基因组学 g e n o m i c s 则是现代分子生物学中解析基因组结构 功能及其相关信 息分析的 f q 前沿分支学科 p a s s a r g e 2 0 0 1 h i e t e r b o g u s k i 1 9 9 7 1 9 8 7 年 g e n o m i c s 专业学术期刊的创刊 标志着这一新兴前沿学科的诞生 基因组学与遗传学 g e n e t i c s 的区别在于 前者包含了与分子和细胞生物 学有关的诸多方面 如基因组图谱 核酸测序 组装 储存 数据管理 基因识 别 功能预测 基因组进化和众多生物基因组之间的比较等等 p a s s a r g e 2 0 0 1 而后者则主要研究遗传 h e r e d i t y 及其相关的机制和结果等 因此 基因组研 究的主要内容 就包括了以全基因组测序为目标的结构基因组学 s t r u c t u r a l g e n o m i c s 和以功能鉴定为目标的功能基因组学 f u n c t i o n a lg e n o m i c s 两大方面 其中 结构基因组学是基因组研究的早期阶段 主要以建立物种高分辨率的遗传 物理和转录图谱 以及蛋白质或生物大分子的三维结构为主 t e i c h m a n ne t a 1 1 9 9 9 b l u n d e l l m i z u g u c h i 2 0 0 0 而功能基因组学则是利用结构基因组 学提供的信息 系统地研究基因的功能 它以高通量 大规模实验以及计算机辅 助分析等为其主要特征 h i e t e r h i e t e r 1 9 9 7 赵剑华等 2 0 0 0 5 浙江大学博士学位论文 大熊猫基因组b a c 文库及i l 类m h c 基冈组物理图谱构建 2 结构基因组学研究的主要内容和方法 2 1 遗传图谱 遗传图谱 g e n e t i cm a p 又称为连锁图谱或遗传连锁图谱 是以具有遗传多 态性的遗传标记为 路标 以基因座之间的重组率 1 的重组率为l c m 为 图 距 的基因组图 方福德等 1 9 9 8 遗传图谱的绘制是基因组学研究的第一步 它以染色体上某一位点为遗传标记 并辅以与之相对应的遗传性状 经过连锁分 析 将编码该性状的基因定位于特定的染色体上 自b o t s t c i n 等人根据r f l p 限制性酶切片段长度多态性 的特点提出用r f l p 等d n a 标记来构建遗传图谱 b o t s t e i ne ta 1 1 9 8 0 以来 遗传图便逐渐成为了基 因克隆与定位等相关研究的重要工具 并在研究基因的功能 定位及分离克隆新 基因 舫i j d n a 片段和研究染色体上基因的顺序等方面发挥着重要作用 l a n d e r b o t s t e i n 1 9 8 5 g e b h a r d te ta 1 1 9 9 5 如s a i t o 等利用r f l p 构建了人6 号染色体 长臂的遗传连锁图 对于分离克隆潜在的肿瘤抑制基因以及其它遗传疾病的研究 具有重要的意义 s a i t o n a k a m u r a 1 9 9 3 但是 由于r f l p 在染色体组中的 分布极不均匀 且提供的多态信息十分有限 因此 要绘制高密度的遗传图是非 常困难的 b o t s t e i ne ta 1 1 9 8 0 于是 在r f l p 的基础上 结合女i i a f l p r a p d 生化标记 性状标记位点及以简单序列长度多态 生 s s l p 标记如微卫星 小卫星 等为基础的第二代遗传图谱 d o b u v s k ye ta 1 1 9 9 5 y u a ne ta 1 1 9 9 7 绘制出 了更加精细的遗传图 m e n ze ta 1 2 0 0 2 o u e d r a o g oe ta 1 2 0 0 2 f e r r e i r ae ta 1 2 0 0 0 w h i s s o ne ta 1 1 9 9 5 k i s se ta 1 1 9 9 3 如o u 6 d r a o g o 等就利用a f l p r f l p r a p d 生化标记以及一些生物性状位点构建了豇豆的遗传连锁图 对于豇豆育种中的标 记辅助选择 图位克隆等研究具有重要的指导价值 o u e d r a o g oe ta 1 2 0 0 2 由 此使遗传图谱显示出了更高的应用价值 随着基因组研究的进一步深入 该领域又相继出现了以s n p s 单核苷酸多 态性 为标记的第三代遗传图谱 g a r g e ta 1 1 9 9 9 s n p 是指在染色体基因组 水平上由于单个核苷酸的变异而引起的d n a 序列多态性 包括单碱基的转换 颠换 插入以及缺失等 v i g n a lc ta 1 2 0 0 2 由于s n p s 可以在基因组的编码区 和非编码区广泛存在 且其标记数目多 覆盖密度大 因而在基因定位等方面的 6 浙江大学博士学位论文 大熊猫基因组b a c 文库及i l 类m h c 基因组物理图谱构建 研究中 第三代遗传图谱就有着其他标记系统无可比拟的优越性和发展潜力 d a v i s h a m m a r l u n d 2 0 0 6 2 2 物理图谱 物理图谱 p h y s i c a lm a p 是以特定的d n a 序列为标记所构建的染色体图 其中 最粗略的物理图谱是染色体的组型图 如t i a n 等通过对小熊猫 r e dp a n d a 核型分析 表明小熊猫具有2 n 3 6 条染色体 t i 锄e ta 1 2 0 0 2 而最精确的物理 图谱便是核苷酸的序列图 人类基因组全序列等 限制性内切酶的发现 促进了 第一个物理图谱s v 4 0 的完成 d a n n a n a t h a n s 1 9 7 1 继后 随着y a c b a c 肌 c 等新克隆技术的建立 以及克隆片段长度s t s 序列标签位点 成为有 力的物理图标 使得相关物理图谱的制作水平得到了很大的提高 从而保证了物 理图谱的连贯性 o l s o ne ta 1 1 9 8 9 于军 1 9 9 8 目前 常见的物理图谱有s t s 图谱 y a c 酵母人工染色体 图谱 p a c 噬菌体人工染色体 图谱 以及 b a c 细菌人工染色体 图谱等 迄今 构建物理图谱的方法主要有以下几种 a 限制性内切酶作图 该方法是最经典的物理图谱制作法之一 当一个克 隆或d n a 片段被限制性内切酶酶切成不同长度的片段时 便形成了通常所称的 d n a 指纹 d n a f i n g e r p r i n t 但这种指纹图谱是没有顺序的 这类比较有代表 性的图谱题c o l i c e l e g a n s 和酵母的物理图谱 k o h a r ae ta 1 1 9 8 7 c o u l s o ne ta 1 1 9 8 6 o l s o ne ta 1 1 9 8 6 继后 在单酶切法的基础上发展起来的多酶完全酶切 法 m u l t i p l e c o m p l e t e d i g e s t m c d 则比上述的d n a 指纹图更具有准确 可 自动化和规模化的特点 已被广泛地应用于酵母 人等的大规模测序和精细物理 图谱的研究工作中 g i l l e t te ta 1 1 9 9 6 y u w o n g 1 9 9 7 w o n ge ta 1 1 9 9 7 b 序列标签位点 s t s 作图 o l s o n 等人根据物理图谱的制作需要 提 出并建立了序列标签位点 s t s 的作图技术 o l s o ne ta 1 1 9 8 9 s t s 的来源 包括e s t 已知遗传标记 随机测序序列和末端测序等 从而使得低分辨率物理 图谱的制作水平发生了新的飞跃 1 9 9 7 年人类第7 号染色体和x 染色体物理图谱 的制作 就是基于该技术完成的 其分辨率达到了1 0 0 k b b o u f f a r de ta 1 1 9 9 7 n a g a r a j ae ta 1 1 9 9 7 其后 愈来愈多的基于s t s 的高密度和高分辨率的物理图 谱得以顺利完成 b a y s a le ta 1 1 9 9 7 m u m me ta 1 1 9 9 8 b l a n c oe ta 1 1 9 9 8 7 浙江大学博士学位论文 大熊猫基因组b a c 文库及i l 类m h c 基因组物理图谱构建 s r i v a s t a v ae ta 1 1 9 9 9 从而使s t s 作图技术成为了物种遗传物理图谱制作研究 的首选技术 c 其它物理图谱作图法 除了以上2 种作图法以外 以原位杂交 k 1 0 c k a r se t a 1 1 9 9 6 为标记的光学作图或染色体显微切割及辐射杂交作医 r a d i a t i o n h y b r i d m a p p i n g r h 也是制作物理图的常用方法 r o b i c e ta 1 2 0 0 1 m a r t i n s w e s se ta 1 2 0 0 3 其中 r h 作图法由于可以产生高分辨率的物理图 因而可以用于多个 物种之间共线性区域保守 s y n t e n yc o n s e r v a t i o n 程度的研究 g o l d a m m e re ta 1 2 0 0 2 2 3 基因组测序 随着遗传图谱和物理图谱的完成 以及荧光自动分析仪的发明 h u n k a p i l l e r e ta 1 1 9 9 1 使得物种大规模基因组测序的工作成为了可能 1 9 7 7 年在英国 s a n g e r 实验室首先完成了第一个生命基因组 p h ix 1 7 4 序列的测定 s a n g e re ta 1 1 9 7 7 基因组测序的最终目标 是获得目的生物体基因组的全部d 晰列 对于较小的基因组如噬菌体 b a c c o s m i d f o s m i d 细菌和质粒 通常采用 的方法是随机鸟枪法测序 它通过序列的拼接和组装 完成基因组的完整序列 a n d e r s o ne ta 1 1 9 8 1 b a e re ta 1 1 9 8 4 a k a n u m a 2 0 0 2 对于较大的基因组而 言 则可以采用全基因组鸟枪法测序 w h o l eg e n o m es e q u e n c i n g w g s f l e i s c h m a n ne ta 1 1 9 9 5 m o x o n 1 9 9 5 w e b b e r m y e r s 1 9 9 7 克隆重叠群 c l o n eb yd o n e 基础上的鸟枪法测序 c a ie ta 1 2 0 0 1 c h e ne ta 1 2 0 0 4 k h o r a s a n ie ta 1 2 0 0 4 以及随机定向测序 d i r e c t e ds e q u e n c i n g 战略 定向测序 技术是充分利用鸟枪法快速测序和物理图谱的有序排列优点 并在克服了上述两 种测序方法的不足后发展起来的 目前 改方法已得到了广泛的应用 m a l y k he t a 1 2 0 0 4 3 功能基因组学研究的主要内容和方法 近年来 随着人类和一些动物 植物及微生物基因组计划的完成 基因组学 的研究便步入了后基因组时代 功能基因组学 f u n c t i o n a lg e n o m i c s 8 浙江大学博士学位论文 大熊猫基因组b a c 文库及i i 类m h c 基因组物理图谱构建 w o y c h i ke ta 1 1 9 9 8 功能基因组学的主要研究内容 就是在结构基因组学丰富 信息资源的基础上 利用大通量的试验方法并结合统计与计算机分析 研究生物 在其生长 发育和繁殖等生命过程中相关基因的功能 表达调控 基因与蛋白质 之间的相互作用等 h i e t e r b o g u s k i 1 9 9 7 3 1 基因的功能 表达及调控研究 在不同的组织和发育阶段 基因的表达模式是不同的 由于常规的r t p c r 技术 r n a 印迹杂交技术等方法一次只能研究一个或几个基因的功能和表达情 况 因此 高通量的基因表达分析技术 微阵列 d n am i c r o a r r a y 及基因表 达系列分析 s e r i a la n a l y s i so fg e n ee x p r e s s i o n s a g e 便应运而生 d n 础敖阵列技 术始 t 1 9 9 5 年s c h e n a 等用于拟南芥4 5 个基因表达模式的定量分析研究 s c h e n ae t a 1 1 9 9 5 并多用于基因表达研究及点突变 s n p 分析 h e l l e r 2 0 0 2 尽管所有 的d n a 微阵列都是基于核酸序列间的杂交互补 但是 其技术选择在不同的微 阵列平台间却存在着广泛的差异 h a r d i m a n 2 0 0 4 这些平台之间最主要的差别 在于探针的长度 d r a g h i c ie ta 1 2 0 0 6 微阵列可分为两种 其一是c d n a 微阵列 它的探针通常来自于p c r 扩增的产物 长度可达数千个b p 其二是寡核苷酸微阵 列 分为短寡核苷酸微阵y u 2 5 3 0 m e r 署1 长寡核苷酸微阵歹u 6 0 7 0 m e r 或更长序 列 此外 d n a 微阵列技术除了在分子生物学和基因组学中的应用外 还在 药物基因组学 蛋白质组学 传染病 遗传疾病和癌症的诊断 法医学和遗传识 别等方面具有重要的作用 为了大规模测定基因的表达 1 9 9 2 年o k u b o 等人提出了基因表达的物理图谱 的概念 o k u b oe ta 1 1 9 9 2 其主要的策略就是测定c d n a3 端的部分序列 比较 不同组织类型的细胞中c d n a 的种类和数量 1 9 9 5 年v e l c u l e s c u 等人提出了s a g e 能够定量和同时分析大量的基因表达 转录本 的方法 v e l c u l e s c ue ta 1 1 9 9 5 它提供了广泛的定量分类和比较不同发育阶段基因表达情况的分析手段 s a g e 技术区别于差异显示 消减杂交等方法的主要特点在于 它可寻找低丰度 低表达水平的转录本 最大限度地收集基因组的表达信息 c a r o n 等人运用s a g e 技术构建了人类全基因组水平上的m r n a 表达谱 该表达谱包含了人类1 2 种类型 的组织的2 4 5 万个转录标签 发现了高表达丰度的基因成簇分布于染色体的特定 9 浙江大学博十学位论文 大熊猫基因组b a c 文库及i l 类m h c 基因组物理图谱构建 区域 e a t o ne ta 1 2 0 0 1 同时也为在癌症研究中那些过量表达或沉默表达基因的 研究提供了有效的分析工具 此外 通过这些基因表达谱的研究 也为寻找新基 因提供了有效的手段 例如x u 等人便是利用s a g e 技术分析了雄性激素调控基因 的不同组织的表达谱后 发现了p e m a e l 新基因 x ue ta 1 2 0 0 0 此外 通过基因敲除和转基因技术建立模式生物的方法 是研究基因功能的 主要手段之一 而r n a i r n ai n t e r f e r e n c e 技术则是通过在r n a 水平上的表达抑 制来直接研究基因的具体功能 f i r ee ta 1 1 9 9 8 进一步的研究表明 在多种动物 体内均存在d s r n a 介导的r n a i 现象 这表明r n a i 是生物界普遍存在的r n a 水平 上的基因调节方式 因此r n a i 已成为大规模遗传筛选和基因功能鉴定等相关研 究的最有效手段 3 2 蛋白质功能及蛋白质的相互作用研究 由于大部分细胞的生命活动发生在蛋白质水平而z e r n a 水平 因此 即使 清楚了基因的表达情况 也难以阐明基因的实际功能 因为基因在生物体上的功 能最终由其编码的蛋白质来体现 赵剑华等 2 0 0 0 为此 以阐明生物体内的 蛋白质表达模式和功能模式为目标的蛋白质组学 p r o t e o m i c s 便是功能基因 组学研究的重要内容之一 蛋白质组 p r o t e o m e 最初是哇t w a s i n g e r 等人于1 9 9 5 年 提出来的 它表示基因编码的全部蛋白质 w a s i n g e re ta 1 1 9 9 5 蛋白质组是动 态的 具有时空性和动态性 能够反映基因的表达时问 表达水平以及蛋白质翻 译后的加工修饰和亚细胞分布等 蛋白质组的分析主要包括蛋白质的分离与鉴定 双向凝胶电泳技术 o f a r r e l l 1 9 7 5 g o r ge ta 1 2 0 0 0 和质谱技术 m a s ss p e c t r o m e t r y m s 是公认的蛋白质研究 的标准方法 g o r ge ta 1 2 0 0 4 总的说来 随着基因组计划的进一步深入 基因 组学研究的内容也在不断的拓展并衍生出新的交叉学科和新的技术 如生物信息 学 b i o i n f o r m a t i c s 贝j j 是以生物大分子为研究对象 以计算机为工具 运用数学和 信息学的相关理论和方法来研究生命现象及海量的序列数据 其主要研究内容包 括序列分析和比对 基因识别 蛋白质结构预测 分子进化和数据库技术等 而 比较基因组学 c o m p a r a t i v eg e n o m i c s 贝j j 是通过物种之间基因 基因家族及基因组 区域的比较分析 来揭示基因 基因家族的起源 功能及其在进化过程中的复杂 1 0 浙江大学博士学位论文 大熊猫基因组b a c 文库及u 类m h c 基因组物理图谱构建 机s t f r a z e re ta 1 2 0 0 3 n o b r e g a p e n n a c c h i o 2 0 0 4 等等 第二节 基因组细菌人工染色体 b a c 文库研究概述 构建高质量和大插入片段的基因组d n a 文库 是开展复杂真核生物大规模 物理图谱 重要功能基因的定位 分离和大规模基因组测序等研究工作的基础 也是濒危物种基因资源离体保护的主要研究内容 b a c 文库是在早期的粘粒 c o s m i d 文库 噬菌体 f o s m i d 文库和y a c 文库的基础上发展起来的 在 早期基因组文库的构建过程中 研究者大多使用k 噬菌体 c o l l i n s h o h n 1 9 7 8 和柯斯质粒 c o s m i d 作为克隆载体 d ej o n ge ta 1 1 9 8 9 由于这两种克隆载 体的插入片段较小 1 5 4 5 k b 所以 尽管其克隆效率很高 但插入片段过小和 不稳定等特点 y o k o b a t ae ta 1 1 9 9 1 k i me t a l 1 9 9 2 却致使其在大规模物理图 谱构建 染色体步移和基因组测序等的研究中的应用受到限制 继后发明的酵母 人工染色体 y a c 载体 b u r k ee ta 1 1 9 8 7 能够克隆达1 m b 的d n a 片段 对 于构建复杂基因组重叠群及物理图谱非常有用 然而 由于y a c 系统存在着克 隆效率低 嵌合体比率高 插入片段不稳定和提取纯化y a cd n a 极为困难等诸 多缺点 g r e e ne ta 1 1 9 9 1 k o u p r i n ae ta 1 1 9 9 4 l a f i n o ve ta 1 1 9 9 4 c a ie ta 1 1 9 9 8 w o oe ta 1 1 9 9 4 而使之不太适合于后续的染色体步移 物理图谱构建和基因组 的测序研究 继后 s h i z u y a 等人在质粒f 因子的基础上 构建了第一个细菌人 工染色体 b a c 载体 s h i z u y a e ta 1 1 9 9 2 以b a c 为载体进行基因组文库构建时虽然其克隆插入片段 1 0 0 3 5 0k b 较 y a c 要小得多 但其能够在宿主菌中稳定遗传 且无缺失 重组和嵌合等现象 同时其b a cd n a 的提取纯化操作简单 所以 自该载体被发明以来就一直得到 了广泛的应用 c a ie ta 1 1 9 9 5 s u z u k ie ta 1 2 0 0 0 t h o r s e ne la 1 2 0 0 5 1 b a c 文库及其载体的发展 b a c 文库构建的基础是e c o l i 中的f 因子 o c o n n o re ta 1 1 9 8 9 研究发 现f 因子在e c o l i 中的复制是受到严格控制的 通常只有1 2 个拷贝 此外 f 因子具有携带大插入片段的潜能 插入片段可达1 0 0 k b h o s o d a e la 1 1 9 9 0 这使 得构建大插入片段的基因组b a c 文库成为可能 浙江大学博士学位论文 大熊猫基因组b a c 文库及l i 类m h c 基因组物理图谱构建 0 c o n n o r 等人首次利用f 因子构建载体p m b 0 1 3 1 来克隆大片段的d n a 分子 o c o n n o re ta 1 1 9 8 9 而s h i z u y a 等人则在此基础上将s p 6 和1 7 启动子序列 九 和p 1 噬菌体的c o s n 和l o x p 位点弓1 k p m b 0 1 3 1 载体 构建了第一个b a c 载体 p b a c l 0 8 l 该载体的插入片段达3 0 0 k b 以上 且传代1 0 0 代后仍可稳定遗传 无 重组和嵌合现象 s h i z u y ae ta 1 1 9 9 2 但是 该载体没有重组子选择标记 必 须进行杂交验证 于是 s h i z u y a 又将p g e m 3 z 载体上的l a c z 基因插 k p b a c l 0 8 l 载体的多克隆位点上 构建了第二代b a c 载体 p b e l o b a c l l 该载体可通过 l a c z 的a 互补所形成的蓝白菌落来筛选重组子 使得重组子的筛选更趋于直观 简便 k i me ta 1 1 9 9 6 由于p b e l o b a c l l 载体所形成的非重组子的蓝色菌斑没有多拷贝载体那么明 显 新的改进型载体p i n d i g o b a c 在p b e l o b a c l l 载体基础上使得非重组子的蓝白 斑更加明显 b i l l r e ne ta 1 1 9 9 7 同时 在多克隆位点引入 极i 酶切位点 还能 够插入经 积i 酶切的d n a 片段 f r i j t e r 等人通过定点突变方式将p b e l o b a c l l 其 中的一个 o 尺i 酶切位点去掉 构建了具一个e c o r l 克隆位点的p e c b a c l 和 p e c s b a c 4 这既丰富了多克隆位点 又方便了a f l p 和r a c e 片段的克隆 f r i j t e r e ta 1 1 9 9 7 此外 在基因组的部分酶切中 由于e c o r i 署1 e c o r i 甲基化酶的配合 使用能够得到稳定和可重复的结果 这就大大提高了b a c 文库的构建效率和质 量 总之 这些d n a 克隆载体在构建和发展的过程中 其结构 功能和克隆效 率都逐渐得到了完善 并广泛应用于基因组文库和物理图谱构建 基因组大规模 测序 定位克隆以及重要功能基因等的研究中 2 基因组b a c 文库构建中的几个关键问题 尽管基因组b a c 文库的构建工作看起来比较简单 但要成功构建出高质量 大插入片段的基因组文库也并非易事 它需要特别就以下几个关键步骤予以高度 重视 2 1 高分子量d n a h m wd n a 的制备 高分子量d n a 的制备是构建大插入片段b a c 文库并进而开展复杂基因组 1 2 浙江人学博 学位论文 大熊猫基因组b a c 文库及l l 类m h c 基因组物理图谱构建 研究的关键之一 与传统的d n a 提取方法不同 要防止高分子量d n a 在制备 过程中免受剪切等物理损伤 通常需要将动物的组织或细胞等材料用低熔点琼脂 糖凝胶 l m p 包埋 形成凝胶块 p l u g s b l o c k s 或凝胶球 m i c r o b c a d s 以 利于后续的细胞裂解和酶切等操作 通常情况下 构建真核动物的基因组文库的材料 应来自单一的动物个体 这样就避免了由于序列的多态性而造成在b a cc o n f i g 构建和序列的组装过程中 出现较大的麻烦 o s o c g a w a d c