（森林保护学专业论文）欧美杨108再生体系的优化及转天花粉蛋白基因的研究.pdf

摘要 欧美杨系列是中国林科院引进的杨讨新品种。因其品质优良，已通过圜家级技术鉴 定，被国家林业局列为我国西部及华北地区重点推广树种。但是，随着欧美杨的广泛栽 培，病虫害的发生越来越严重，因此其抗性育种显得尤为迫切。采用基因工程技术开展 转基因杨树的研究，是培育抗逆、抗虫和抗病杨树新品种的有效途径。 本研究以欧美杨1 0 8 无菌苗为材料，通过对基本培养基的筛选、激素种类和浓度的 调整，培养条件的选择等优化了欧美杨1 0 8 再生体系的培养基和培养条件。在此基础 上，采用根癌农杆菌介导法，进行抗病虫天花粉蛋白( n i c h o s a n f h i n ，t c s ) 基因的遗 传转化研究。探讨了影响转化效率的若干因子，首次建立了以潮霉素磷酸转移酶 ( h p t ) 为选择标记基因的欧美杨1 0 8 遗传转化系统，并获得了抗性愈伤和抗性芽，经 p c r 和p c r s o u t h e r n 检测证明目的基凶已经整合到欧美杨1 0 8 基因组中，为进一步 开展欧美杨1 0 8 遗传转化打下了理论基础。主要研兔结果如下： 通过筛选得到了优化的n 1 片分化再牛培养基、茎段愈伤组织诱导培养基、不定芽生 根培养基及培养条件。叶片分化时，采用m s 培养基附加o 6 m g | 16 一b a 和o 2 m gl ， n a a ，在光照条件下培养；茎段愈伤组织诱导时，采用w p m 培养基附加1 5m gl 。12 ， 4 一d 和0 7 5m g l 1k t ，在光照条件下培养：不定芽牛根和继代生根时，均采用w p m 培养基附加一定量的i b a ，在光照条件下培养。在这些培养基上外植体的分化率、诱导 愈伤率以及生根率均达到了1 0 0 ，而且生睦状况优良。 确定了筛选欧美杨1 0 8 转化体及选择牛根培养时的抗生素浓度。潮霉素抑制叶片分 化的浓度为2m gl ；生根培养时的选择浓度为o 2m g l 。比较了头孢唑啉钠和羧卞 青霉素抑菌效果及对叶片分化和苗水牛根的影响，结果表明头孢唑啉钠和羧卞青霉素浓 度分别为6 0 0m g l 。1 和4 0 0m g l 1 时，可完全抑制农杆菌l b a 4 4 0 4 的生长：在此浓度 下头孢唑啉钠对叶片的分化影响较羧卞青霉素大，而对苗术的生根影响较羧卞青霉素 小。因此，在叶片分化时，采用4 0 0m g l 1 的羧卞青霉素抑菌：在生根时，采用6 0 0 m g l 的头孢唑啉钠抑菌。 最后，探讨了影响遗传转化的主要因素，首次建立了以潮霉素磷酸转移酶( h p t ) 为选择标记基因的欧美杨1 0 8 的遗传转化系统。采用根癌农杆菌介导法转化欧美杨1 0 8 叶片外植体，芡得到1 8 个潮霉素抗性愈伤和抗性芽，转化效率为4 3 。抗性体经p c r 和p c r s o u i h e m 检测，证实t c s 基因已经整合到欧美杨1 0 8 的基因组中。 关键词欧美杨1 0 8 ；再生体系；t c s 基因；根癌农杆菌：遗传转化 a b s t r a c t p o p 】a r i so n eo fl h ei m p o n a n ls y l v i 吼1 1 t u r a la n dc o m m e r c i a li f e e ；i tj sv e r yp o p u l a r t h r o u 曲o u tt h ew o n d ，e s p e c i a l l yi nc h i n a f 坳础g f r 口m 口咖n 1 0 8i sak j n do f h y b n ds c r a i n f m m j 口9 p l f 嵋以i g ma n dp 叩d z 盯如f 加胁i ti st h em a i ns l r a i nw h i c hh a sb e e np o p u l a r j z e df o r i t s 1 1 i g hv a l u e s 吼1 c ha sg r o w i n gf a s t ，h i 曲r e s i s f a n c e ，l o n gf i b 陀e t c _ b y 【h es t a t ef o r e s i r y a d m i l l i s 【r a t i o n w i t ht h em o s tw i d e l yc u l t i v a t i o no fp i 印“缸se “r n 小e r i c l l1 0 8 ，t h ea r i s i n go f p i a n ld i s e a s e sa n dp e s t sw e r em o r ea n dm o r ef r e q u e n i t h er e s e a f c ho fg e n et r a n s f o r m a c i o no n p o p l a rb yg e n ee n g i n e e r i n gt e c h n i q u ei sae f f e c t i v ew a yf o rt h es e l e c “o no fn e ws p e c i e so f p o p l a rw i i ht o l e r a n c e ，i n s e c t r e s i s c a n 【a n dd i s e a s e - r e s i s n t ， i nf 1 1 i ss t u d y ， l e a fa n ds t e mo f 月n p “厶f sp r 口州盯j c 盯“1 0 8w e r eu s e da se x p e m e n t m a t e t i a l ，t h r o u g ht h es c r e e n i n gt ot h eb a s i cc u l 【u r em e d i u m ， c h ea d j u s c m e n lo fb o r m o n ek i n d a n dp r o p o r t i on ic h o i c eo fi h ec u l t u r ec o n d i t i o n ，t h em e d i u ma n dt h ec u i t u r ec o n d i t i o no f f 3 印“厶f ，已f ，p r i c 口甩1 0 8r e g e n e r a c i o ns y s t e mw e r eo p t i m i z e d o nt h eb a s i so ft h ee s t a b n s h m e n to fh i g hf r e q u e n c yr e g e n e r a t i o ns y s t e m ，a d a p “n gt o a g r o b a c t e r i u m m e ( i i a t e dt oc o d u c tl r a l l s f 0 唧a t i o no fi n s e c t r e s i s t a n c ea n dd i s e a s e r e s i s t a n c e g e n e so ft c sg e n e t h f o u g he x p l o r i n gt h ef a c t o r sa f f e c l i n g 【h 。g e n e t i ct r a n s f o r m a c i o n ，t h e t r a n s g e n i cs y s t e 巾，w h i c hs e l e c f sh p ta st h es e l e c t a b l em a r k e rg e n e s ，w a se s t a b l j s h e da n dt h e r e s i s t a n ls h o o tw e f ea l c a i n e df o rl h ef i r s tt i m e t h er e s i s t a n ts h o o i sw e r ei d e n l i f i e db yp c ra n d p c r s o u t h e ma n a l y s i s t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt c sg e n eh a db e e ni n t e g r a t e di n i op f 甲“z h s e “阳州e 广记n n n1 0 8g e n o m e t h em a i nc o n d u s i o no ft h i se x p e f i m e n tw a sa sf 0 i l o w i n g ： t h m u 曲t h es c r e e n i n g i o t h r o u 曲t h es c r e e n i n g t ot h eb a s i cc u l t u r em e d i u m ， t h e a d j u s l m e n to f h o f n l o n ek i n da n dp f o p o r t i o na n dc h o i c eo ft h ec u l t u r ec o n d i t i o n ， t h eo p t i m a l m e d i u ma n dt h ec u l t u r ec o n d i t i o nw e r ea t t a i n e d t h eo p t i m a lm e d i u mf o rd i f f e r e n t i a i i o nf r o ml e a fd e v e df r o mi nv “r 0c u l l u r e dw a sm s + 6 一 b ao 6m g l 一1 + n a a0 2 m g l i h eo p t i m a lm e d i u mf o rc a l l u si n d u c t i o nf m ms c e ma n d k a f s t a l kw a sw p m + 2 ，4 一d1 5m g l 1 + k to 7 5 m g l 一t h eo p t i m a lm e d i u mf o rr o 。t i n d u c t i o nw a sw p m + 0 4m 2 li b at h e yw e r ec u l t u r e du n d e rt h e c o n l r 0 1 l e dc o n d i t i o no f 2 5 1 w i t h2 0 0 01 xo fs u c c e s s i v el i 曲t d i f f e f e n l i a t i o nr a t e ，c a l l u si n d u c t i o nr a t ea n da n d r o o ti n d u c t i o nr a t ci n d i v i d u a lw a su pt o1 0 0 t h e a p p r o p f i a t e c o c e n t r a t i o no f h y gf o r s e l e c t i o nc u l t u r ew a sd e t e r m i n e d t h e d i f f e r e n t j a l i o o fl e a fe x p l a n l sw a si n h a b i t e do nd i f f e r e n l i a i i o nm e d i u mc o n t a j n i n g2 m lh y g ； a l ls h o o t st h a tw e r ci r a n s f e r f e dt or o o t i n gm e d j u mc o n i a i n i n g0 2 m g lh y gw e r ei n h i b i t e d c o m p l e t e l yt om 0 i ， t h ee f f e c to fc e f o l a x i m ea n d ( 、a f b e n i c i ni nd i f | k r e n ic o n c e 口t r a “o nw a se v a l u a t e do n i n h i b i l i n ga g r o b a c t e r i u ml b a 4 4 0 4g f o w t h ，t h ei e a fd i f 艳r e n i i a t i o na n df o o t i ts h o w e dt h a t a g r o b a c t e r i u m l b a 4 4 0 4c u l t u r e do ns o l i dd i f f b r e n t i a t i o nm e d i u m c o n i a i n i n g6 0 0 m l c e f o t a x i m eo r4 0 0 m g l 1 c a r b e n i c i l l i nw a sk i l l e d ；i n 【h ec o n c e n t r a t i o nt h ee f f e c to fc e f o t a x i m e t ol e a fe x p l a n t sw a so b s e r v e dt h a nh i 曲e ft h a to fc a r b e n i c i l l i na n dl h ee f f e c io fc e f o t a x i m et o s h o o tm o t i n gw a so b s e e dc h a i l1 e s st h a to fc a r b e n i c i l l i n s ot h ep r o p e ri n h i b “a g r o b a c t e r i u m l b a 4 4 0 4c o n c e n t r a t i o nw a s4 0 0 m lc a r b e n i c i l l i ni nl e a fd i f 托r c n t i a t i o na n d6 0 0 m l c e f o t a x i m ej ns h o o tr o o t i n g a tl a s t ，t h m u g he x p l o r i n gt h ef a c t o r sa f f e c t i n gt h eg e n e l i ct r a n s f o 呻a t i o n ，t h et r a n s g e n i c s y s t e m ，w h i c hs e l e c l sh p ta st h es e l e c t a b l em a r k e rg e n e s ，w a se s t a b l i s h e d a d a p t i n gt o a g r o b a c t e r i u m - m e d i a t e dt ot r a n s f o r l l lt h e1 e a fe x p l a n l s ，1 8r e s i s t a n ts h o o t sw e r co b t a i n e da n d t r a n s f o r m a t i o nf r e q u e n c yw a s4 t 3 1 1 】er e s i s t a n ts h o o t sw e r ei d e n t i f i e db yp c ra n dp c r s o u m e r na n a l y s i s t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt c sg e n eh a db e e n i n t e g r a t e di n t o 脚“a 5 d 盯m 甜f c n h n1 0 8g e n o m e k e y w o r d s 尸印“觑s 出f 阳卅p r l c 口以n1 0 8 ；r e g e n e r a t i o ns y s t e m ；t ( 1 sg e n e ；a 矽_ d 6 口c 盯m 小 t u m e f a c i e n s ；g e n e t i ct m n s f o r m a t i o n i i i 中英文对照表 吾二_ 石i 面丽面i 忑一 乙酰丁香酮 6 b a6 一b e n z v l a d e n i n e 6 一二常基嘌呤 c a r b e a r b e n i c i i i i n羧卞青霉索 c e f c e f o l a x i m e头孢毒素 i b ai n d o l 曲u t v r i ca c i d 吲哚一3 一丁酸 k a nk a n a m v c i n 卡那毒素 m s m u r a s h i 譬ea n ds k o o gm e d i u m m s 培养基 n a a d n a d h t h a l e n a c e l i ca c i d奈乙酸 o d o p t i c a ld e n s i t y 光密度 p c rp o l v m e r a s ec h a i nr e a c c j o n 聚合酶链式反应 r m p r o u n dp e rm i n u t e转每分 2 ，4 d2 ，4 d i c h l o r o p h e n o x y a c e “ca c i d 2 ，4 一二氯苯氧乙酸 k t k i n e t i n激动素 z tz e a t i n 玉米素 t d zt h i d i a z u r a 噻苯隆 g ag i b b e r e l i i n s 赤毒素 h y g ( h p t ) h y g r o m y c i n 潮礴素 e d t ae c l l l e n e d i a m i n ed i s o d i u mt e t r aa c e t a l o 乙二胺四乙酸 s d s s o d i u md o d e c y ls u l f a t e 十二烷基黄酸钠 s f r e ps t r e p t o m y c i n 链霉素 r i fr i f a m d i c i n 利碣平 e b e 山i d i u mb r o m i d e溴化乙锭 c r a b c e t v l t r i m e c h y la m m o n i u mb r o m i d e 溴化十j 六烷基三甲翠胺 g u s 0 一g l u c u r o n i d a s e 葡萄糖醛酸糖苷酶 t c st r i c h o s a n t h i n 天花粉蛋白 r i p r i p b o s o m ej n a c t i v a l i n gp m t e i n 核糖体失活蛋白 ! 坐竺堡! 塑! ! ! ：竺! 生! ! ! 竺! ! ! 竺竺! ! ! ! 三鳖茎氢墨! 壁 - v i l 绪论 1 绪论 杨树隶属于杨柳科( s a l i c a c e a e ) 杨属( 肿舢 ) ，是多年牛水本植物，是世界上三 大速生树种之一，泛分布在北半球。它不仅是重要的经济物种，可用于生产木材、纤 维及能源，还在水土保持和维护生态平衡方面发挥重要作用。根据形态学、地理位置 及杂交模式，杨属可分为五大派系：白杨派、黑杨派、青杨派、胡杨派及大叶杨派。 据 止界粮农组织( f a o ) 统计，欧洲不少人工林部是由杨树组成，杨树已成为这些 国家弥补森林资源缺乏，解决水材急需的丰要树种和商业速生林的标准材料。我国大部 分地区处于温带地区，杨、柳、榆、槐、椿等被誉称为“黄河流域5 大造林树种”，其 中以杨树资源最为丰富，现已成为世界上杨树人工林面积最大的国家i z j 。 目前中国杨树人工林占全国人工林面积的1 ，5 ，是世界其它各国杨树人工林总面积 ( 1 4 0 万h m 2 ) 的四倍( 6 6 7 万h m 2 ) 。但是，随着杨树的广泛栽培，病虫害的发生越来 越严重，杨树抗：眭育种显得更加迫切，欧美杨也面l 临着同样的问题。到目前为止，我国 有记载的杨树害虫有3 2 0 余种，主要：扁害约5 0 余种。随着农药的滥用，一些病虫的抗 药性增强，致使杨树病虫害更加严重p “，桔叶病、溃疡病、杨扇舟蛾、杨小舟蛾、天 牛等病虫害已严重威胁着包括欧美杨在内的许多杨树的生长与术材质量。单纯依靠常规 育种和喷洒农药的方法不仅不能从根本上解决问题，而| = i 会给环境带来更严重的污染。 随着分子牛物学的发展和杨树组织培养技术的口趋成熟，人们纷纷把目光转向基因 工程，希望在短期内达到改良品种的目的。况且随着世界人口迅速增长，牛态环境破坏 的 1 益加刷，以及地理和气候条件的限制，杨树抗性育种显得更加迫切，已引起国内外 林水研究者的普遍关注。因此查明杨树抗性的生理生化机制及其遗传因素，寻找提高抗 性措施，尤其是利用基因工程技术进行杨树抗肚育种( 包括抗病虫、抗寒冻、抗旱、抗 盐碱等) ，是当代林木分子生物学研究的重要课题之一。它不仅在基础理论上具有重要 意义，在解决生产实际问题上也具有广泛的应用价值【6 j 。 1 1 杨树组织培养。 早期杨树的组织培养主要是进行愈伤组织的培养，这是由于愈伤组织易获得且易保 存【7 1 。但从愈伤的诱导到获得完整植株所需时间长，培养程序复杂，易发生变异，影响 杨树组织培养研究的有关因子不利于保持亲本性状也不利于扩大繁殖。为了大量繁殖优 良树种，愈伤培养逐渐被器官培养所替代。通过器官培养不仅对幼嫩植株还对成熟林水 实现了扩繁，其中芽的组织培养比较稳定，变异率低，在杨 对的组织培养中较为常用。 至今杨树已成为林术组织培养中研究最为广泛的树种之一。 1 1 。1 影响杨树组织培养的因素 影响饧树组织培养的因素有很多，最为主要的有外植体材料、培养基种类、外源激 求北林业大学硕士学位沧文 素以及培养条件等。 1 1 1 1 外植体材料 理论上每一个植物细胞都具有再生成完整植株的能力，即细胞全能性。但在实际应 用中，组织的再生受植株遗传因素、基因型和外植体本身的生理生化状态等多种因素的 影响l 。 ( 1 ) 外植体种类及其基因型：外植体的遗传因素即外植体来源的植株种类及其基 因型是影响芽、苗再生及其植抹再牛的重要因素。c o l e m a n 等将1 6 种不同基因型的美 洲黑扬僻如加胁s ) 茎段接种在附加o 5m g i 。“z t 的培养基中，有6 种难诱导，4 种 诱导率达5 n 以上，其条6 种则介于3 至2 3 之间【j j 。 ( 2 ) 外植体c 体植株和外植体本身的生理生化状态：这两者的差异主要是由供体 植物的年龄、发育阶段、生氏环境和外植体取材的部位等引起的。 植物个体发育经历幼态期、成熟期和衰老期，植物的营养繁殖能力于幼态因素有 关，一般材料愈年幼营养繁殖就愈容易。但林木不同于草本植物，生长周期长，幼苗成 年后的性状不易预测，有时不得不从成年的优良大树上直接选取幼嫩部分或先复幼再取 外植体i l 。 外植体供体植株生长环境影响它的牛理状态。因此即使使用相同类型的外植体，其 苗水再生能力也会有差异。1 9 9 5 午郑均宝等用乍根和未生根试篱植株的叶片进行芽的诱 导，发现字长条件一一致时1 ：限试管植诈的叶片分化情况较好，产牛的不定芽数量多且 粗划1 “。 同一植株上不同器官的再生能力有所不同。如白杨及白杨杂交系的实生苗，其下胚 轴和茎尖分化芽的能力高于子时和叶片旧。即使同一器官的不同部位。再生能力也有差 异。1 9 8 0 年陈维伦等对山新杨( 尸如删册p 6 d 胎l d u c n e ) 叶外植体分化的研究 表明，带有叶柄的下段( 极易在叶柄的切口上形成芽) 分化成芽的频率最高，达7 0 左 右，而中、上段( 芽从叶脉上产生) 的分化频率极低l l “。 ( 3 ) 外植体的大小及其性别也会影响苗木的再生能力：如缘毛杨( 尸c f ，i 口船) 的雌 株再牛能力比雄株高。不过这种差异不是绝对的，白杨及其杂交系的雄株和雌株( 1 6 3 0 ：i i ) 上的芽的再牛能力就没有显著差别【l 。 ( 4 ) 外植体的极性：植物的极性现象有着j 泛的作用和影响，造成极性原因之一 是植物组织中某些化学物质表现出梯度的存在。这种极性效应当然也会反映到外植体 上。芽、苗形成的位置有时取决于外植体接触培养基的位置。当外植体以它形态学的基 部放在培养基上，从远离基部的表面诱导出芽、苗数目较多。 有些植物的极性表现并不如上述例子那么明显，尤其是使用了植物激素之后，极性 效应将会受到影响【8 j 。 1 1 1 2 培养基种类及外源激素 培养基和外源激素是影响杨树组织培养的重要因素，适宜的培养基和浓度是杨树组 培成功的关键， 1 绪论 ( 1 ) 培养基：杨树组织培养中，m s 和w p m 培养基较为常用。它们富含植物所 需的盐类，其中m s 又可按盐浓度分为1 4 m s 、l 2 m s 和m s 。1 4 m s 和1 2 m s 在 诱导杨树试管苗生根时常用。这是由于高盐浓度对某些杨树的生根不利。此外还有一种 大量元素减半的1 2 m s 培养基，丰要用于芽的诱导。虽然m s 和w p m 在杨擗的组 织培养中常用，但都含较高浓度的铵离子。在有些杨树如杂交杨( p n f b p f 陀川f l f n j 和杂 交杨僻打i 拍。c 印“p c 据加i b j 的组织培养过程中，铵离子会富集在叶或茎段内，不利 予愈伤组织的诱导【1 ”。因此应根据材料来源、实验目的来选择培养基。 ( 2 ) 碳水化合物：碳水化合物既是重要的能源物质，还在组织培养中起着渗透势 调声的作用。一般植物细胞内的渗透势是通过无机离子和有机分子调节的，其中包括有 机酸、糖和糖醇。由于细胞质的无机离子浓度保持相对稳定，因此，细胞质的渗透适应 性主要靠无毒的有机分子的积累来完成，杨树组培中通常使用蔗糖便是其中之一，用量 一般为2 0 4 0 9 l 1 。为了促进毛白杨休眠芽牛长，也有使用粜糖作碳源的。 ( 3 ) 植物生长涠节物质：在组织培养中较常用的植物生长凋节物质有植物生长素 和细胞分裂素。植物生长索是启动细胞分裂素的重要激素，换句话说，生长素在植物细 胞脱分化、形成愈伤组织或胚性细胞团的过程中是不可缺少的物质。植物牛长素作为细 胞分裂素的启动剂最先对其产牛影响，它与含精氨酸高的组蛋白结合，使部分受阻遏 的基因解除抑制：状态而活化，从而恢复转录和转译，最终形成酶和蛋白质。细胞分裂素 能使已经脱分化的细胞保持持续的有丝分裂，从而使细胞团能够进行继代培养。进一步 标记化合物研究细胞分裂素的作用时，发现在细胞周期中细胞分裂素的调节作用发牛在 有丝分裂的准备期。 在杨树上常用的植物生长生长素有：奈乙酸( n a p h t h a l e n ea c e t i ca c i d ，n a a ) 、吲哚 一3 一丁酸( i n d o l e b u t v r i ca c i d ，i b a ) 和2 ，4 一二氯苯氧乙酸( 2 ，4 一 d i c h l o r o p h e n o x y a c e t i ca c i d ，2 ，4 一d ) 。n a a 和l b a 广泛用于杨树的生根，并能与细胞 分裂素q ：作促进芽的增殖。2 ，4 一d 对杨树愈伤组织的诱导有效，但对器官的分化不 利。杨树上常用的细胞分裂素有激动素( k i n e t i n ，k t ) 、6 苄基嘌呤( 6 一 b e n z v l a d e n i n e ，6 一b a ) 和玉米素( z e a t i n ，z t ) 等。6 一b a 在杨树芽的诱导方面应用 很广，己诱导十余种杨树成苗，但电有报道认为它不利于某些杨再生芽的形成i l ”。此 外类细胞分裂素t d z 也正被用于杨树的组织培养，它促进腋芽增殖和不定芽分化， 阻碍芽的伸长【l ，在杨树组织培养中应用潜力很大，极低浓度时就可诱导毛白杨叶外植 体产生大量的芽。与6 一b a ( 0 2 5 m 2 l _ 1 ) 混合使用诱导芽分化时，用低浓度的噻苯隆 f r h i d j a z u m ，t d z ) ( 0 0 0 5m g - l 。) 代替价格昂贵的玉米索( o 2 5m g l 1 ) ，可达到或超 过玉米素的效果i l 。除生长素与细胞分裂素外，其它生长调节物质对植物的生长也有一 定影响：如赤霉素( g j b b e r e l l i n s g a ) ，尽管它不促进杨树芽的分化，但可促进芽的仲 长生长。 1 1 1 3 培养条件及其它因素 影响杨树组织培养的条件有两方面：一是光照和温度。光照和温度对植物的形态建 东北辆也丈学硕士j 主位论文 成有着重要的调控作用，而且光、温度二因素往往是连在一起相互作用。植物组织培养 一般是在日光灯( 光强1 0 0 0 一5 0 0 0 l x ) 1 6 h 光照下进行。光强影响某些杨树的形态发 生。有时弱光或全黑，会促进愈伤组织分化和根的再生l z 。还有研究报道，光质对茁的 再生也有影响，其最有利的光谱成分是蓝光区，而对根的发生则是红光区较有利。大部 分组织培养的温度为2 5 。过高的温度会导致分化芽出现玻璃化苗，低则使苗乍长缓 慢。 二是季节性变化。外界环境对植物中命有着广泛而深刻的影响，植物体通过适虚环 境发展出一套接受环境信号( 包括季节变化) ，并可通过传递和放大变成各种代谢“语 言”，是植物体作出静种反应机制，季节性变化对组织培养中器官发生的影响是明显 的，大多数植物应在其生长开始的季节采样较好，在生长末期或己进入休眠期，则采样 的外植体在培养中反应迟钝或不能培养成功心j 。 1 1 2 杨树组织培养的意义 目前，组织培养在杨树上的应用主要表现在以下几个方面：第，难生根树种的扩 大繁殖，如白杨系，因根蘖繁殖率低、扦插生根困难而难以运用传统方法大量繁殖。若 用组织培养的方法，通过改变外植体的牛长条件则可在短期内获得大量组培茁。第 二，种质保存。运用组织培养的方法，控制植株的生长速度，不仅能避免种质资源受病 虫害的侵袭，迈能节省人力和空间。此外，杨纣组织培养系统司作为一种模式体系，来 分析基圈转移，体细胞变异等方面存在的问题，研究林，l 二生长、分化及幼嫩、成熟和复 幼的分子机制等。j 。 1 2 杨树抗病虫基因工程研究进展 自从1 9 8 6 年p a r s o n 等人证实了杨树可以进行遗传转化和外源基因在高等植物细胞 中的表达以来，林木基因工程得到了迅速的发展，尤其是以杨树的基因工程进展最为迅 速【2 0 】。 1 9 8 7 年，f i l l a t t i 从沙门氏杆菌中提取了抗除草剂的d n a ，用根癌农杆菌转移到杨 树杂种无性系( 尸印“n u 口f 6 日xp 咖h 胁m ) 中，获得一批能抗除草剂草甘膦的杨树植 株【2 “。j 9 8 7 年，美国首次报道成功地将抗除草剂基因导入银白杨大齿杨的杂种无性 系中并进入田问试验，随后又成功地：i 哿抗除草剂的基因转入美洲黑杨。目前，转基因的 美洲黑杨已在密西西比河流域的一些地区栽培1 2 2 1 。1 9 8 8 1 9 8 9 年，美国依阿华大学成 功地将b t 基阕和蛋白酶抑制剂基因转到杨树杂种中，获得了杨树抗虫转基因植株1 2 “= 其作用机理是b t 基因在芽孢形成过程中，产生伴胞晶体，其中含有高度特异杀虫活性 的结晶蛋白，能使昆虫幼虫的肠道内蛋白酶水解，转化为毒性多肽分子。 杨树基因工程研究进展较快一方面是因为杨树在全世界栽培面积广；另一方面是 因为杨树组织培养l 作较为系统成熟，一旦获得转化植株即可迅速推广，供进一步研究 乃至生产应用。杨树甚至可被看作是林水转基因研究的模式植物。到目前为止，人们利 用各种转化方法已获得了抗除草剂、抗虫、抗病等一系列转基因植株。 绪沧 1 2 1 杨树抗病基因工程 杨树的抗病基因工程研究是从8 0 年代开展的，目前克隆的抗病基因主要分两类： 即抗病毒基因和抗菌基因。抗病毒基因的研究主要是克隆病毒外壳蛋白基因，通过外壳 蛋白基因的导入，并借助交叉保护作用机理，达到降低病毒侵染的目的。1 9 9 3 年英国牛 津大学c o o p e r 研究小组克隆了杨树花叶病毒( p m v ) 的外壳蛋白( c p ) 基因，目的是 ：烙编码p m v c p 基因导入杨树，在杨树体内产生c p 蛋白，对杨树p m v 的侵染起到 一种类似于免疫学的交叉保护作用【“】。奥地利农林大学的科研人员把欧洲和整个地中海 地区核果类树易感染的洋李痘病毒( p p v ) 的c p 基因导八了杏树。 几丁质酶基因和角质酶基因是目前克隆的林小抗真菌病的二种主要基因，几丁质酶 具有降解几r 质的作用，许多病原真菌的细胞壁主要成分之就是几丁质，而植物中尚 未发现几丁质酶的底物。1 9 8 6 年s c h l l l m b a u m 首次报道提纯的菜豆几丁质酶具有抗真菌 活性。 1 9 8 7 年h an t e v 研究小组对刨伤反应基因在毛果杨美洲黑杨无性系中的表达进行了 研究，发现杨树受到机械损伤后，在杨树的上部产生了许多新的m r n a ，克隆这些 m r n a 的c d n a 并进行序列分析，其中两个转录物w i n 6 和w i n 8 编码几丁质酶，可降 解侵染杨树的细菌和真菌的细胞壁，w i n 3 转录子所编码的多耿与豆科种子的蛋白酶抑 相挤u 相似，具有抑制昆虫的功能。他们将w i n 6 基因与g u s 报告基因融合构建表达 载体转化杨树，进行抗病基吲的遗f 专转化研究。现已证明，从烟草、马铃薯、黄瓜、菜 豆、豌豆、鹰嘴豆、甜菜、水稻、小麦、大麦、玉米等中提纯的几丁质酶，刺立枯丝核 菌( 尺 如d c f d n 面印胁 j ) 等2 0 多种真菌的菌丝牛长或孢子萌发有抑制作用【2 ”。 有些几丁质酶可分解细菌细胞壁的肽聚糖，从而对细菌产生影响。从芥菜中克隆到 的一个几丁质酶基因( b i c h i i ) ，该基因编码的酶具有两个几丁质结构域，已证实对大 肠杆菌有毒害作用【。1 9 9 9 年赵世民等将兔防御素n p 一1 基因导入毛白杨，结果发现 转基因植株组织提取液对枯草杆菌、农杆菌和立枯病原菌等多种微生物的生氏均有不同 程度的抑制作用 2 9 j 。2 0 0 4 年孟亮等将几丁质酶基因和0 1 ，3 一葡聚糖酶基因依次转 入黑杨中，转基因黑杨的细胞粗提液在体外可以有效的抑制杨树病原真菌的生长1 3 。同 年，邹维华：| 哿反义磷脂酶d t ( a n t i p l 脚) 基因和几丁质酶( c h 5 b ) 基因转入美洲黑 杨g 2 中，获得了耐盐及抗病 生均显著提高的转基因植株口“。 1 2 2 杨树抗虫基因工程 2 0 世纪8 0 年代以来，植物牛物技术的迅速发展和各种杀虫蛋白基因的发现和克 隆，激发了人们开始用基因工程手段进行抗虫育种的研究，通过这一方法获得的抗虫转 箍因植物，可以一定方式( 组成型、诱导型、发育调控型或组织特异型等) 表达抗虫基 因，这类抗虫植物的应用可避免反复喷洒农药，及植物某些部位不易喷药和有的生物杀 虫剂在自然界不稳定等缺点【3 2 】。 抗植物害虫的基因有几十种，目前在植物基因工程研究中常用的外源抗虫基因有从 东北林业、学顾l 学位沧文 微生物苏云金芽孢杆菌中分离出的苏云金杆菌杀虫结晶蛋白基因，简称b t 基因；从植 物中分离出的昆虫蛋白酶抑制剂基因，其中应用最广泛的是豇豆胰蛋白酶抑制剂基因 ( c p t i ) ；植物凝集素基因( 1 e c t i ng e n e ) ；淀粉酶抑制剂基因：核糖体失活蛋白基因等 。杨树抗虫基因工程研究工作的热点主要集中在苏云金芽孢杆菌( 肋c i 池sf 砌r m p h s 括) 晶体毒蛋白基因( b t ) 和豇豆胰蛋白酶抑制剂基因( c p t i ) 的应用。 ( 1 ) 苏云金芽孢杆菌晶体毒蛋白基因( b t ) 苏云金杆菌毒蛋白( 或内毒素b t t o x i n ) 基因是世界范围内广泛使用的抗虫基因， 它是苏云金杆菌在芽孢形成过程中产牛伴抱晶体最主要的蛋白。b t 毒蛋白被鳞翅目等昆 虫摄食之后，在昆虫幼虫的【 i 肠道内经蛋白酶水职，转变成为带有n 一末端的具有杀虫 活性的毒性多肽分子。活化了的毒素可以与敏感昆虫中肠道上皮的微绒毛上的特异受体 结台，随之插人到细胞膜上并形成穿孔，使细胞膜周质和中膜腔之间的离子平衡被破 坏，引起细胞肿胀甚至裂解，从而导致昆虫幼虫停止进食而最终死亡【3 4 】。 转苏云金芽他杆菌毒蛋白基因的棉花、烟草，通过对棉铃虫和烟青虫等室内生物毒 力测定和大田试验，已经获得了抗虫效果比较好的转基因植物并在大田推广应用。1 9 9 0 年c o o p e 等成功地将b t 基因和从马铃薯中提取的蛋白酶抑制基因( ，n ) 导入杨树杂种 中获得了抗鳞翅目和鞘翅目：a 虫的转基因植株1 3 ”。1 9 9 1 年m c c o w n 等利用电激法将b t 基因导入银白杨大齿杨和欧洲黑扬毛果杨杂种中，均获得抗舞毒蛾和天幕毛虫的转基 因值株，对舞毒蛾致死率达：4 天幕毛虫致死；季达6 0 ，这是首次获得抗虫效果明显 的转b l 基因树木自研究”“。 1 9 9 1 年伍宁丰等以欧洲黑畅( p n 堙) 为研究对象，将b t 杀虫蛋白基因导入叶片 获得再生植株，并经s o u f h e r n 杂交证明确有外源基因插入，在国内首次报导了b t 杀虫 蛋白基因导入杨树并获得再生的转基因植株【“。同年，中国林科院林研所同中科院微生 物所在我国首次成功地利用将n 一端缺失不同长度的c r v l 气c 基因转化欧洲黑杨 ( 尸n i ) ，获得了欧洲黑杨( p 月洄。) 转b t 毒蛋白基因植株，对舞毒蛾和杨尺蠖的抗虫 率达5 0 1 0 0 1 3 7 】。 2 0 0 0 年田颖川等又将含b t 基因和蛋白酶抑制剂( a p l ) 基因的表达载体转化白杨 杂种无性系7 4 l 成功，得到了3 株高抗杨树( 虫试死c 二率7 l 以上) 和一批对昆虫中等 抗性的植株。s o u l h e m 杂交分析结果表明两种犟困均已单拷贝整合入3 个植株。这是国 内外首次报道用双抗虫基因获得的抗虫7 4 l 毛白杨植株，目前已进入中试阶段1 3 8 ”】。 2 0 0 0 年李明亮等将含b t 基因和蛋自酶抑制剂纂因的双元表达载体导入黑杨，经p c r 检 测和s o u t h e m 杂交分析证明，最终获得既含b t 基因又含蛋白酶抑制剂基因的对舞毒蛾 有显著杀虫活性的转基因杨埘植株，杀虫效果明显高于仅含单一b c 基因的植株 4 。 2 0 0 1 年r a o 等将b t c r v i a 和c p t i 基因导入黑杨无性系n l 一8 0 1 0 6 中，结粜表明转双 价基因的株系比转单价基因的株系抗虫效果更为显著h “。 2 0 f ) 3 年王永芳等利用农杆菌介导法，对青杨进行含部分改造的b t c r y a c 基因( b t 基 因) 和慈姑蛋白酶抑制剂( a p i ) 基因a 的双价抗虫基因转化，确定了适于青杨的遗传转化 绪沦 系统。并获得了青饧转基因植株【4 2 】。2 0 0 4 年东北林业大学常玉广等将b t 基因c 末端肽 和蜘蛛神经毒肽组成的融合基因成功地导入了小黑杨花粉植株，抗虫试验表明，转基因 株系其有明显的抗虫效果【4 3 】。 ( 2 ) 豇豆胰蛋白酶抑制剂摹因( c p t i ) 蛋白酶抑制剂( p i ) 是自然界含量最为丰富的蛋白种类之一，存在于所有生命体 内，它能与昆虫消化道内的蛋白消化酶相瓦作用，形成酶抑制剂复合物( e i ) ，阻断 或减弱消化酶的蛋白水解作用，从而影口同外来蛋白的正常消化。同时它刺激消化酶的过 量分泌，通过神经系统反馈，使昆虫产：生厌食反应，最终致昆虫非正常发育或死亡 。 按其作用特异性，蛋白酶抑制剂可被划分为4 类：丝氨酸蛋白酶抑制剂、金属蛋白 酶抑制剂、半胱氨酸蛋白酶抑制剂和天冬氨酸蛋白酶抑制剂。目前，已有多种蛋自酶抑 制剂基因或c d n a 被克隆，并得到一批转基因植株【4 ”。用于转化杨树的蛋白酶抑制剂基 因丰要有丝氨酸蛋白酶抑制剂和半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因。 1 9 9 1 年k 1 0 p f e n s c e i n 等首先利用马铃薯的蛋白酶抑制剂与n p t i i 构成嵌合基因导入 杨树，获得了转基因植株，其中1 个转基因无性系t 6 6 5 的食i i f 量与对照存在显著的差 异一。1 9 9 6 年w a n g 等将从b t 毒素中分离出的i c p s 摹因分别导入山杨和黑杨中，均获 得寸分理想的抗虫效果。1 9 9 5 年，法国森林育种实验站g i l 】sp i l a t e 领导的研究小组将切 割蛋白( p r o l c i n c u t j n g ) 酶基因转化汤树，所得转化株可使食其叶片的害虫致死率达 4 0 。1 9 9 8 年c o n f a l o n i e r i 等及2 0 0 1 年d e l l e d o n n 等，将不同的蛋白酶抑制剂基因导 入杨树，均获得具有较强抗虫性的转基因植株【4 8 t4 ”。1 9 9 9 年郝贵霞等利用根癌土壤杆 菌介导法将广谱抗虫基因豇豆胰蛋白酶抑制剂( c p r r d 基因导入毛白杨( 只即