（植物学专业论文）桐花树耐盐相关基因的克隆与表达分析.pdf

中山人学硕 ：论文 桐花树耐盐相关基因的克隆与表达 桐花树耐盐相关基因的克隆与表达 硕士生：刘晋 导师：黄椰林副教授 专业：植物学 研究方向：植物分子系统学 摘要 盐胁迫对植物的生长和繁殖有着极大的影响，提高植物的耐盐性是降低盐胁 迫危害的有效方法，因此，研究植物耐盐机理，通过基因工程培养耐盐作物品种 已经成为了当前国际上关于植物耐盐的研究热点之一。红树植物所在的潮间带高 盐生境决定了其在长期的进化发展中必然会形成其特有的耐盐分子机制。 本研究通过r a c e 技术，利用本实验室已有的红树植物桐花树( a e g i c e r a s c o m i c “l a t u m ) 正向抑制性差减文库中的部分基因片段克隆得到三个桐花树耐盐相 关基因：a c n h x l ，a c n h x 2 ，a c n h d 。通过分析这些基因的e d n a 序列和编 码蛋白的氨基酸序列，发现它们在结构上都具有n a + i r 转运蛋白编码基因的特 点，其中a c n h x i ，a c n i - 1 x 2 属于n h x 基因家族，它们所编码的蛋白a e n h x l 、 a c n h x 2 可能定位于液泡膜上，主要起n a + 液泡区隔化的功能；而a c n h d 基因 和已知的极少数植物n h d 基因构成了n h x s o s i 两大公认类型之外的第三类 植物n a + ，h 十转运蛋白编码基因。 通过荧光定量p c r 技术分析桐花树叶中a c n h x i ，a c n h x 2 ，a c n h d 在 盐和渗透物质处理下的转录模式，我们发现a c n h x l 、a c n h x 2 ，a c n h d 的转 录水平变化不但与桐花树叶中的n a + 浓度相关，还与k + 浓度有关，其中植物n h d 基因的转录与植物体内k + 浓度有关为本研究首次发现；a c n i t x l 基因的转录变化 主要是由离子胁迫引起的，其功能很可能主要与降低离子胁迫对植物细胞的伤害 有关；而影响a c n h x 2 转录的主要次级胁迫与a c n h x i 不同，是高渗压胁迫， 这说明a c n h x 2 在植物耐盐机理中的作用很可能主要与减少高渗压胁迫对植物 桐花树耐盐相关摧川的克降j 表达 细胞的伤害有关。a c n h d 转录模式与a c n h x l 相似，推测其有可能与a c n h x l 受到类似调控。 a c n t t x 2 与拟南芥的a t n h x l ，a t n h x 2 在同样化学物质处理同样时问下的转录 卡楚式如出一辙，推测很可能受到类似于拟南芥a b a 依赖型信号转导途径的调控， j 在桐花树中起着与拟南芥a t n h x l ，a t n h x 2 同样的作用；而a c n h x l 与已知的 j 它植物n h x 基因在类似处理下的转录变化特点都不相同，说明桐花树的耐盐 分f 机理与其它植物既有共同点，又有其独到之处。 a c n h x l 、a c h d 转录水平在2 5 0 i i l m 和5 0 0 m mn a c i 处理下不同，a c n h x l 、 一( p 5 c s 转录水平、k + n a + 比值、脯氨酸含量都随着盐激时间的增长而先升后降， 蜕明桐花树在不同浓度、不同时间的盐胁迫下有着不同适应机制。( a c p 5 c s 基因 的克隆和a c n h x l 、a c n h d 基因在不同时间赫激下的转录表达实验已由本实验 室傅新晖完成) 关键词：耐盐，桐花树，钠氢转运蛋白，脯氨酸 i i 生盔兰堡! 笙塞 塑些塑塑竺塑茎苎堕塑壅堕! 鍪 c l o n i n ga n de x p r e s s i o na n a l y s i s o fs a l tt o l e r a n c e r e l a t e dg e n e si na e g i c e r a sc o r n i c u l a t u m n a m e ：l i uj i n s u p e r v i s o r ：p r o f s h is u h u a , a s s o c i a t ep r o f h u a n g y e l i n m a j o r ：b o t a n y r e s e a r c hd i r e c t i o n ：p l a n tm o l e c u l a rs y s t e m a t i c s a b s t r a c t s a l ts t r e s ss e v e r e l ya f f e c t st h eg r o w t ha n dp r o d u c t i v i t yo fp l a n t sa n di m p r o v i n g t h ec a p a b i l i t yo fs a l t - t o l e r a n c eo fp l a n t si sa ne f f e c t i v ew a yt or e d u c et h ei m p a c tf r o m s a l ts t r e s s d i s s e c t i n gt h em e c h a n i s m so fs a l t - t o l e r a n c ei np l a n t sa n dd e v e l o p i n g s a l t - t o l e r a n tc r o p sb yg e n ee n g i n e e r i n gh a sb e c o m eac e n t r a li s s u ei ns t u d i e so fp l a n t s a l tt o l e r a n c e i n h a b i t i n gi n t e r t i d a lz o n e sw i t hh i g hs a l i n i t y , m a n g r o v e sh a v e d e v e l o p e du n i q u es a l t - t o l e r a n c em e c h a n i s md u r i n gl o n g t e r me v o l u t i o n a r yh i s t o r y i nt h ep r e s e n ts t u d y , t h r e es a l t t o l e r a n c er e l a t e dg e n e sa c n h x l ，a c n h x 2a n d a c n h dw e r ei s o l a t e df r o mas s hl i b r a r yo f a e g i c e r a sc o r n i c u l a t u mt h r o u g hr a c e b a s e do nt h ea n a l y s i so ft h e i rc d n as e q u e n c e sa n da m i n oa c i ds e q u e n c e s ，w ef o u n d t h a tt h e ya l lh a dc h a r a c t e r i s t i c so f g e n e se n c o d i n gn a + h + t r a n s p o r t e r a m o n gt h e s e g e n e s ，a c n h x ia n da c n h x 2c o m i n gf r o mt h en h xg e n ef a m i l y , a n da c n h x i a c n h x 2m a yl o c a l i z et ot o n o p l a s t ，w i t ham a j o r f u n c t i o ni nv a c u o l a r c e m p a r t m e n t a l i z a t i o no fn 矿：w h i l ea c n h dt o g e t h e rw i t ha f e wk n o w np l a n tn h d g e n e sf o r m e dt h e t h i r dp l a n tn a + wt r a n s p o r t e r - e n c o d i n gg e n eg r o u p ，w h i c hi s d i s t i n c tf r o mt h ea c k n o w l e d g e dp l a n tn h x a n ds o s lg r o u p s r e a l t i m ep c rw a su s e dt od e t e c tt r a n s c r i p tp a t t e r n so f a c n h x l ，a c n h x 2a n d a c n h di nt h el e a fo fa e g i c e r a sc o r n i c u l a m mu n d e rs a l ta n do s m o t i cm a t e r i a l s w e f o u n dt h a tt h et r a n s c r i p t i o nl e v e l so fa c n h x i ，a c n h x 2a n da c n h dn o to n l yh a v e i i i 桐花树耐盐相关皋吲的克降4 ，表返 r e l a t i o nt on a + c o n t e n tb u ta l s oa l er e l e v a n tt ok + c o n t e n ti nt h el e a fo fa e g i c e r a s c o r n i c u l a t u m t h a tt r a n s c r i p t i o nl e v e lo fp l a n tn h d g e n eh a sr e l a t i o nt ok + c o n c e n ti s f i r s td i s c o v e r e di nt h ep r e s e n ts t u d y t r a n s c r i p t i o nc h a n g eo f a c n h x lr e s u l t sm a i n l y f r o mi o ns t r e s s ，s oi t sf u n c t i o ni sp r o b a b l yr e d u c i n gt h ed a m a g eo fi o ns t r e s st op l a n t c e l l w h i l et r a n s c r i p t i o no fa c n h x 2m a yb ei n d u c e db yo s m o t i cs t r e s s ，a n dh a sa p r o b a b l ef u n c t i o ni nr e d u c i n gt h ed a m a g eo fo s m o t i cs t r e s s t o p l a n tc e l l t h e t r a n s c r i p t i o np a t t e mo fa c n h d w a ss i m i l a rt oa c n h x i ，w h i c hs u g g e s t si tm a yb e r e g u l a t e dl i k ea c n h x l t h et r a n s c r i p t i o n a l p a t t e r n o fa c n h x 2u n d e rt r e a t m e n t sw i t hd i f f e r e n t b i o c h e m i c a l si ss i m i l a rt ot h a to fa t n h x ia n da t n h x 2i na r a b i d o p s i s t h u s ， a c n h x 2m a yb er e g u l a t e db yt h es a m es i g n a lp a s s w a ya sa b ad e p e n d e ds i g n a l p a s s w a yi na r a b i d o p s i sa n dm a yh a v et h es a n l ef u n c t i o na sa t n h x la n da t n h x 2i n a r a b i d o p s i s h o w e v e lt h et r a n s c r i p t i o nc h a r a c t e r i s t i c so fa c n h x lu n d e rt r e a t m e n t s w i t hd i f f e r e n tb i o c h e m i c a l sa r ed i f f e r e n tf r o ma n yo t h e rk n o w np l a n tn h x g e n e s o u r r e s u l t si n d i c a t et h a tt h em o l e c u l a rs a l t - t o l e r a n tm e c h a n i s m so fa e g i c e r a s c o r n i c u l a t u mn o to n l yh a v es o m ec o m m o n sw i t ho t h e rp l a n t s ，b u ta l s oh a v ei t su n i q u e c h a r a c t e r i s t i c s ， t h et r a n s c r i p t i o n a ll e v e l so f a c n i i x la n da c n h da r ed i f f e r e n tu n d e rt r e a t m e n t s w i t h2 5 0 m mn a c ia n d5 0 0 m mn a c l ，r e s p e c t i v e l y t h et r a n s c r i p t i o n a ll e v e l so f a c n h x la n da c p 5 c s ，k + n dr a t i o ，p r o l i n ec o n t e n ta r ei n c r e a s e da tt h ee a r l ys t a g eo f t h es a l t s t r e s sp r o c e s s ，a n dt h e na l ed e c r e a s e da f t e rt h ep e a kv a l u e s b o t ho fw h i c h i n d i c a t e st h a ta e g i c e r a sc o r n i c u l a t u mh a sd i f f e r e n ta d a p t a t i o nm e c h a n i s m su n d e r s a l t s t r e s sw i t hd i 舵r e n tc o n c e n t r a t i o na n dt i m e k e y w o r d s ：s a l tt o l e r a n c e ，a e g i c e r a sc o r n i c u l a t u m ，n a + wt r a n s p o r t e r s ，p r o l i n e 中山大学硕：l 论文桐花树耐赫相关基因的克隧与表达 1 1 文献综述 第1 章引言 1 1 1 植物耐盐分子机理研究进展 植物要在高盐环境中生存，就必然有其相应的抗盐机理。总的来说，植物抗 盐机理可以分为三类：一是避盐机理，指植物不让外界盐分进入体内从而避免盐 胁迫，主要依靠细胞对盐的不透性来适应盐渍化环境：二是缓解机理，主要指通 过固定、稀释、化学去活和泌盐等方法消除盐胁迫伤害；三是耐盐机理，指通过 代谢或生理过程来适应细胞内高盐环境的现象( 李晓燕等，2 0 0 4 ) 。对于高等植 物而言，其细胞体内的酶通常都是不耐盐的，而在高盐环境下，植物细胞内的盐 浓度又往往会不可避免地提高，因此通过耐盐机理束维持植物细胞质内微环境的 稳定对于植物适应高盐环境有着至关重要地作用。 从分子生物学水平而吉，盐胁迫对植物造成的不利影响主要有以下四方面： 一方面由于植物生长环境中的溶质浓度过高对植物细胞产生渗透压胁迫，以及由 此引发的植物缺水；另一方面因为高盐环境中植物与外界的离子交换失常而使植 物体内离子平衡发生改变，从而产生的离子胁迫，其主要表现为：n a + 和c l _ 在植 物体内的富集和k + 的流失以及由此引起的n a + o 一比例改变而( e d u a r d o ，2 0 0 0 ； a p s ee ta 1 。2 0 0 2 ) 。第三方面是盐胁迫还破坏植物体内性氧代谢系统( a p s e e ta 1 ， 2 0 0 2 ；李晓燕等。2 0 0 4 ) ；最后，盐胁迫还对植物的生长相关调节造成严重影响 ( z h u , 2 0 0 l b ) 。在以上的四方面中，离子胁迫和渗透压胁迫被认为是盐胁迫对 植物造成的主要次级胁迫，已得到了较为全面深入研究。相应的，植物的耐盐分 子机理亦可分为四个方面：1 、植物细胞内离子平衡的维持；2 、细胞渗透压的调 节；3 、生成抗氧化剂减少活性氧伤害；4 、生长相关调节。 1 1 1 1 植物细胞内离子动态平衡的维持 细胞内的离子动态平衡是植物存活与生长的基础条件之一，要有效维持细胞 中山人学硕i ，论义 桐花树耐盐相关是闪的克降j 表达 内有害离子低浓度水平和聚集细胞所需离子就必需适当地调节细胞内的离子流 动( z h u ，2 0 0 3 ) 。目前，针对植物在能胁迫下如何维持细胞内离子动念平衡的研 口 究主要集中在降低细胞液中n a + 和c 1 浓度，提高k + 浓度的分子机理上( z h u 。 2 0 0 1 a ；b l u m w a l d ，2 0 0 0 ；a p s ee ta 1 ，2 0 0 2 ：m a n s o u r ，2 0 0 3 ；z h u ，2 0 0 3 ) 。 n 植物细胞内n a + 的浓度维持 植物细胞内n a + 浓度维持主要通过调控n a + 进入细胞、n a + 排出细胞和n a + 的区室化区隔化( c o m p a r t m e n t a l i z a t i o n ) 来实现，在这些过程中又必然会涉及到 n a + 流动的能量束源以及信号调节途径的问题，下面就这些方面逐一进行论述。 ( 1 ) n a + 进入细胞 已知的n a + 进入植物细胞方式有三种：通过高亲合力的k + 转运蛋白；通过 非选择性的离子通道和通过蒸腾流。 在拟南芥中，n a + 通过高亲合力的k + 转运蛋白a t h k t l 转运进入细胞已经得 到了实验的证实( r u s ae ta 1 ，2 0 0 1 ；m a 7s e fe ta 1 ，2 0 0 2 ) 。小麦中也有类似发现 ( l a u r i ee ta 1 ，2 0 0 2 ) 。a m t m a n na n ds a n d e r s ( 1 9 9 9 ) 发现n a + 可以通过非选择性 离子通道进入细胞。此外，y e 等( 1 9 9 9 ) 的实验表明，在水稻中，n 矿可以利用 蒸腾流进入植物体内，而这种过程受到硅的抑制。 ( 2 ) n a + 排出细胞 与n a + 排出细胞相关的基因中，研究最为深入的是模式植物拟南芥中的s o s i 基因。大量研究表明，a t s o s l 是一种定位于细胞质膜上的n a + w 转运蛋白的编码 基因，其编码的蛋白能够将n a + 通过细胞质膜排出体外( s h ie ta 1 ，2 0 0 0 ；q u i n t e r o e ta 1 ，2 0 0 2 ；q i ue ta 1 ，2 0 0 2 ；s h ie la 1 ，2 0 0 2 a ) ，提高彳t s o s l 表达量能使拟南芥耐 盐能力得到增强( s h ie ta 1 ，2 0 0 3 ) 。另外，盐胁迫能使爿t s o s l 的表达上调，却不 能增= c j i m t s o s l 启动子的活性，但是当a t s o s l 与花椰菜花叶病毒( c a u l i f l o w e r m o s a i cv i r u s ) 3 5 s 启动子相连时，其表达却能受到盐胁迫诱导上调，因此，盐 胁迫对表达的调节可能时发生在转录自u 水平。( s h ie t a l ，2 0 0 0 ： s h i e t a l ，2 0 0 3 ； w a r de ta l ，2 0 0 3 ) 。 中山大学硕上论文 桐花树耐盐相关肇w 的克隆与表达 除了对a t s o s i 的研究外，g a x i o l a 等( 2 0 0 1 ) 发现在拟南芥中过表达a v p i 能够提高植物耐盐能力。n i u 等( 1 9 9 3 ) 发现盐土植物滨藜细胞质膜上的一些 r c - a t p a s e g e n e 基因在盐胁迫下表达上调。j u l i a n a 等( 2 0 0 7 ) 在水稻中克隆得到 a t s o s l 的功能同系物o ss o s i ，研究表明o ss o s l 能够替代a t s o s l 的功能。 ( 3 ) n a + 的区隔化 为了减少对细胞的伤害，植物细胞除了将n a + 外排外，还能通过将n a + 聚集 于一些细胞器中达到维持细胞液中低n a + 浓度的目的。n a + 的区隔化主要发生在 液泡中，质体和线粒体也能聚集一些n a + ( b l u m w a l d ，2 0 0 0 ；y o k o ie ta 1 ，2 0 0 2 ；a p s e e ta 1 ，2 0 0 2 ；z h u ，2 0 0 3 ) ，将n a + 隔离在液泡中，不但可以降低细胞液中n a + 的浓 度，还能调节细胞内渗透压，使细胞能在高赫环境中吸收水分( z h u , 2 0 0 3 ) 。 n h x 基因在n a 十的液泡区隔化中起着关键作用。在本论文的第一章1 2 部分 将做详细介绍。 ( 4 ) n a + 流动的能量来源 细胞内n a + 流动的能量主要来源于a t p a s e s 通过水解a t p 推动质子跨过细胞 内的膜结构，从而产生的膜两侧电化学梯度( d u p o n t , 1 9 9 2 ；s z e ，1 9 8 5 ；s e r r a n o 。e t a 1 ，1 9 8 9 ；p a l m g r e ne ta 1 ，1 9 9 9 ；g a r b a r i n oe ta 1 ，1 9 8 8 ；s t a a le ta 1 ，1 9 9 1 ) 。m a n s o u r 等( 2 0 0 3 ) 认为，在细胞质膜上，质膜a t p 酶( p - a t p a s e s ) 水解a t p 所产生的 质子梯度为质膜上的n a + h + 转运蛋白将n a + 运出细胞提供了能量；类似的，在液 泡膜上，液泡膜a t p 酶( v - a t p a s e s ) 和液泡膜焦磷酸酶( v - p p a s e ) 所产生的质 子梯度为质膜上的n a + h + 转运蛋白将n a + 运入液泡提供能量。主要关系图1 - 1 所 示： 中山人学埘。论文 荆化树耐豁相关基洲的克降j 表_ i 占 m 馘fm a m c 榭r 斟d | p l = ms d t n 撑| 甜，2 0 0 3 ；a 纠一9 0 0 图1 - 1 植物细胞内n a + f i 蔬动的能量来源示意图( 引自m a n s o u r e t a l 。2 0 0 3 ) f i g 1 - 1r e s o u r c eo f e n e r g yf o rt h ef l u xo f n a + i np l a n tc e l l 有研究表明，在舱胁迫下，甜土植物倾向于将n a + 通过质膜外排( l a u c h l ie t a 1 ，1 9 9 0 ) ，而盐土植物则倾向于将n a + 和c l 留在液泡膜中( g r e e n w a ye ta 1 ，1 9 8 0 ) 。 ( 5 ) 信号调节途径 目耵所知的与离子平衡相关信号调节途径主要来自于对甜土模式植物拟南 芥的研究。y o k o i 等( 2 0 0 2 ) 在总结i i 人研究植物逆境胁迫相关信号途径的基础 上( i s h i t a n ie ta 1 ，1 9 9 8 ；z h u ，2 0 0 1 a ；s h i n o z a k ie ta 1 ，2 0 0 0 ；) ，结合实验分析得出 拟南芥的n a + h + 转运蛋白编码基因参与的耐盐相关信号途径至少有三条：渗 透压通过a b a 、m y c m y b 作用元件活化a t n h x l ；离子胁迫通过s o s 3 、s o s 2 活化s o s l ，再由s o s l 将n a + 外排；离子胁迫通过类似但不同于s o s l 的途径 活化4 小h 耵。( 如图1 2 所示) 中山人学硕1 ：论文桐花树耐盐相关基闪的克隧咛表达 图1 2 高渗透压、离子胁迫调节彳t n h x i 。2 和5 的信号途径( 引n y o k o ie t a 1 ，2 0 0 2 ) f i g 1 2h y p e r o s m o t i ca n di o n i cs t r e s ss i g n a l l i n gp a t h w a y st h a tr e g u l a t ea t n h x l 2 a n dj e x p r e s s i o n 不久之后，z h uj k 于2 0 0 3 年提出了著名的s o s 信号转导途径。其主要观点 为：细胞中过量的n a + 和高渗透压能够分别被尚未研究清楚的传感器感受到； n a + 浓度增高所引发的信号能通过c a + 传给s o s 3 s o s 2 蛋白激酶复合物，该复 合物可以活化s o s i ，从而将n a + 排出细胞外；另一方面，高渗透压所引发的 信号能导致a b a 的合成，而a b a 将使a t n h x l 和其他一些基因的转录水平上 调，进而通过a t n h x l 的转录上调加快将细胞液中n a + 的运入液泡产生区隔化效 应；n a + 的积累有可能通过抑制a k t ! 进而阻碍的k + 摄入。( 如图1 3 所示) 进一步的研究表明，液泡膜上的n a + w 转运蛋白也受到s o s 途径调控，而s o s 途径本身也有分支( q i ue t a l , 2 0 0 4 ) 。可见有关n a + h + 转运蛋白编码基因的信号 调节是极为复杂的，仍有待进一步深入研究。 5 中山人学颂l ：论文 桐托树耐盐相关基吲的克降表达 图1 3 在赫胁迫下维持细胞液中低n a + 浓度的离子转运蛋白的表达、活性调节信 号途径( 引自z h u 2 0 0 3 ) f i g 1 3s i g n a l i n gp a t h w a y st h a tr e g u l a t et h ee x p r e s s i o na n da c t i v i t i e so f i o n t r a n s p o r t e r st om a i n t a i nal o wc y t o p l a s m i cc o n c e n t r a t i o no f n a + u n d e rs a l ts t r e s s o 植物细胞内心的浓度维持 关于植物细胞内维持k + 浓度的分子机理研究并不深入，但也有一些实验证明 部分与k + 转运相关的基因调控受到赫胁迫影响，如：豁胁迫会导致拟南芥根中的 k 5 转运蛋白编码基因a t k c l 转录水平上调( p i l o t e t a l 。2 0 0 3 ) ，而在另一些植物 ( c o m m o ni c ep l a n t ) 中盐胁迫能提高k m t l k t k a t 基因家族成员) 和一些 h a k k u p ( 高亲和性k + 转运蛋白k + 摄入转运蛋白) 的转录水平，同时降低删丌 似k t k a t 基因家族的另一成员) 的转录水平( s u e ta 1 ，2 0 0 1 ；s ue ta 1 ，2 0 0 2 ) 。 这些受到赫胁迫调节的基因可能与植物耐盐相关，但需要进步的实验证明。 1 1 1 2 细胞渗透调节 盐分的次生胁迫主要是渗透胁迫，其对植物引起的主要胁变是细胞脱水。植 物主要通过避脱水来适应这种次生胁迫，而最有效的避脱水措施就是植物细胞的 渗透调节。所谓渗透调节，是指植物生长在渗透胁迫条件下，其细胞在渗透上 有活性和无毒害的溶质( 渗透保护物质) 主动净增长的过程，这种增长的结果是 6 中山人学硕士论文桐花树耐盐相关基阂的克隆与表达 细胞浓度增加，渗透势降低，使其在低渗透势生境种能够吸收水分( 林栖 风, 2 0 0 4 ) 。y a n e e y 等( 1 9 8 2 ) 认为，渗透保护物质是一类无毒的小分子复合物， 除了增加渗透压外，还有在细胞内起稳定蛋白质和细胞的膜结构的作用。a p s e 等( 2 0 0 2 ) 认为，通过在细胞液中聚集渗透保护物质，能够增加细胞液的渗透势， 从而使植物细胞在细胞外界高渗压和液泡内聚集高浓度n a + 、c l 的情况下仍然有 可能保持质膜和液泡膜内外的渗透压平衡。从短期来看，这种平衡可以避免细胞 失水；就植物在盐胁迫环境下长期生存而言，这种平衡能够维持细胞的正常形态， 吸水和生长。 目前研究比较多的渗透保护物质，主要有脯氨酸( k i s h o r e t a l 1 9 9 5 ；r o o s e n s e t a l ，1 9 9 9 ；h o n g e t a l ，2 0 0 0 ；h u a e t a l ，2 0 0 1 ；n a n j oe ta 1 ，1 9 9 9 ) 、甜菜碱( r o n t e i n e ta 1 ，2 0 0 2 ；r a t h i n a s a b a p a t h i ，2 0 0 0 ；s a k a m o t oe la 1 ，2 0 0 0 ；h a y a s h ie ta 1 ，1 9 9 7 ； p r a s a de ta 1 ，2 0 0 0 ；h u a n ge ta 1 ，2 0 0 0 ) 、四氢嘧啶( o n oe ta 1 ，1 9 9 9 ) 、海藻糖 ( g o o d i j ne ta 1 ，1 9 9 9 ) 等。但这些物质的具体作用方式、调节机理在目前仍不是 完全清楚。其中，脯氨酸的分子机理已有较为深入的研究。 早在1 9 9 5 年，k i s h o r 等就发现在烟草中过量表达脯氨酸合成途径前两步的关 键基因a 1 一p y r r o l i n e - 5 - - e a r b o x y l a t es y n t h a s e ( p 5 c s ) 和a l - p y r r o l i n e - 5 - c a r b o x y l a t e r e d u c t a s e ( p 5 c r ) 能够有效提高转基因植物中的游历脯氨酸含量，然而，植物体内 的脯氨酸代谢却远远不止于此。更为深入的研究表明，植物体内的游离脯氨酸能 够抑制脯氨酸降解的关键酶脯氨酸脱氢酶，并得到了实验证据的支持( r o o s e n s e ta 1 ，1 9 9 9 ) 。同时，p 5 c r 基因启动子分析表明p 5 c r m r n a 的翻译水平在脯氨酸 浓度增高的情况下下降，而5 非转录区的一段9 2 b p 的序列在盐胁迫条件下使 p 5 c r m r n a 更为稳定，并抑制其翻译( h u ae ta 1 ，2 0 0 1 ) 。此外，n a n j o 等人( 2 0 0 0 ) 还通过反义c d n a 转化降低脯氨酸脱氢酶表达，从而使转基因拟南芥的脯氨酸水 平在无盐胁迫条件下和盐胁迫条件下分别为未转基因拟南芥中脯氨酸水平的两 倍( 1 0 0 u g g 鲜重) 、三倍( 6 0 0 u g g 鲜重) 。 1 1 1 3 生成抗氧化剂减少活性氧伤害 盐胁迫给植物带来伤害的另一个主要方面是由活性氧自由基r e a c t i v eo x y g e n s p e c i e s ( r o s ) j 粼( z h u 2 0 0 1 b ) 。活性氧自由基是植物的叶绿体和线粒体代谢 7 中山人学坝| 论文 0 花树耐盐相关皋川的克降j 表达 在逆境胁迫下发生改变而生成的类有害物质，包括超氧阴离子s u p e r o x i d e r a d i c a l s ( 0 2 一) 、过氧化氢、h y d r o g e np e r o x i d e ( h 2 0 2 ) 、羟基自由基h y d r o x y lr a d i c a l s ( o h ) 等( a p s e e la 1 ，2 0 0 2 ) 。它们对于细胞内的蛋白质、核酸、膜脂质等成分造 成严重伤害( h a l i w e l le ta 1 ，1 9 8 6 ) 。 为了避免活性氧自由基的伤害，植物细胞内一些与氧化还原相关的酶发挥了 重要的作用。r o x a s 等( 1 9 9 7 ) 研究表明，过表达谷胱甘肽过氧化物酶( g x p ) 和谷胱甘肽s 转移酶( g s t ) 的烟草在盐胁迫条件下能够比未转基因的烟草对照 株更好地萌发和生长。k o v t u n 等人( 2 0 0 0 ) 的研究表明，一种能够介导氧化胁迫 反应的有丝分裂原活化蛋白激酶n p k i 与耐盐相关。另外，在拟南芥的一种突变 体p s t l 中， 由于与氰化胁迫相关的一个负调控子发生了突变，从而使筇r ，突变 体拥有了比诈常拟南芥更加耐盐的能力( t s u g a n ee ta 1 1 9 9 9 ) 。 此外，z h u ( 2 0 0 0 ) 认为一些渗调剂如：甘露醇、果聚糖、海藻糖、芒丙醇、 脯氨酸、氨基乙酸等和一些非酶的蛋白质如：大麦h v a l 、c b f d r e b s 能够增强 植物耐盐能力很可能也与减少植物细胞内活性氧有关。其中具有代表性的推测 是：s h e n 等( 1 9 9 7 ) 通过将甘露醇引入植物叶绿体的方法提高植物抗性，由于 叶绿体是植物细胞中产生活性氧自由基的主要细胞器之一，所以这种抗性被认为 很可能是由于进入叶绿体的甘露醇清除了其中的活性氧自由基而产生的。 1 1 1 4 生长相关调节 盐胁迫对植物的危害最终表现为抑制植物的讵常生长，而植物的生长是由其 细胞的生长和分裂构成的。因此，通过影响细胞生长、分化相关基因的表达调控 而造成抑制植物的正常生长也是盐胁迫对植物危害的主要方面之一。有关这一方 面的分子机理研究并不深入，但仍有部分受盐胁迫影响的植物生长相关基因得到 了实验证明。 w a n g 等( 1 9 9 8 ) 研究表明，在拟南芥中，脱落酸能够诱导一种细胞周期依赖 性蛋白激酶抑制子i c k l ，其产物i c k i 蛋白能够通过降低细胞周期依赖性蛋白的 活性来抑制细胞分裂。而赫胁迫会导致植物体内脱落酸的合成增加，从而通过使 i c k l 表达上调、细胞分裂减少最终实现抑制植物的生长。 此外，转基因实验表明胁迫相关基因c b 刀。d 兄融，爿4 乃培7 能够减缓被转入 中山大学硕士论文 桐花树耐盐相关基瞰的克隆与表达 这些基因的植物生长( l i ue t a l ，1 9 9 8 ；h j e l l s t r o me ta 1 ，2 0 0 0 ；h o l m s t r o me ta 1 ， 1 9 9 6 ) ，而这些基因都与植物细胞生长、分裂相关，能够抑制植物生长( l i u e ta 1 ， 1 9 9 8 ；s o d e n n a ne ta l 一19 9 6 ) 。 1 1 2 w x 基因研究进展 植物n h x 基因的主要功能是编码植物细胞液泡膜上的n a + h + 转运蛋白，将 细胞液中n a + 运入液泡，从而维持细胞液中的低n a + 浓度，保持细胞内的离子平 衡，这对于植物在盐胁迫条件下生存有着至关重要的作用。( n a s se ta 1 ，1 9 9 7 ； a p s ee ta 1 ，1 9 9 9 ；b l u m w a l dc ta 1 ，2 0 0 0 ；h a s e g a w ae ta 1 ，2 0 0 0 ；z h a n ge ta 1 ，2 0 0 1 ；) 因此，关于植物n h x 基因的研究长期是耐盐相关基因研究中的热点，其中又以 拟南芥n h x 基因家族最为清楚。 1 2 2 1a t n h x 基因家族研究进展 在a t n h x 基因功能方面，早在1 9 9 9 年，o a x i o l a 等的研究就表明拟南芥中 与酵母n h x 基因同源的基因a t n h x l 能够抑制酵母n h x l 突变体的一些表型，并 且用2 5 0 r a mn a c l 或2 5 0 m mk c i 处理6 小时会引起拟南芥中的a t n i - i x i m r n a 增加。q u i n t e r o 等( 2 0 0 0 ) 也通过类似的实验证明了a t n h x l 能够替代酵母n h x l 的功能，并且n a c i 和a b a 都能提高a t n h x i 的转录水平。d 训e y 等( 2 0 0 0 ) 进 一步证明了a t n h x l 能够使细胞液中的n a + 进入液泡。 在a t n h x 的编码蛋白定位、转录表达方面，a p s e 等( 1 9 9 9 ) 的研究证实了 a t n h x l 蛋白定位于液泡膜上。y o k o i 等( 2 0 0 2 ) 也通过实验证实了a t n h x 2 同 样定位于液泡膜上，并且通过n o r t h e r n 技术发现a t n h x l ，a t n i - 1 x 2 在拟南芥茎、 根中都有较强转录，a t n h x 3 在根中转录明显而在茎中仅有弱转录，a t n h x 5 在 茎、根中有转录，a t n h x 4 、a t n h x 6 在茎、根中转录不明显；s l l i 和z h u ( 2 0 0 2 b ) 通过实验发现a t n i - i x l 在拟南芥生长发育的各阶段都有表达，因而很可能具有抗 盐之外的普通生理功能，并且a t n h x l 在n a c ! 、a b a 、k c ! 诱导下转录水平上 调，而干旱和寒冷胁迫则不能，同时，通过对比不同拟南芥突变体( a b i l j ， a b i l 2 ，a b a 2 - 1 、a b a 3 ，s o s l ，s o s 2 、s o s 3 ) 在n a c ! 、a b a 处理下的转录 情况，得出a t n h x l 的表达依赖a b a 而非s o s 途径。另外其编码蛋白很可能与 9 山人学硕i ：论文枷1 饨树耐盐相关基斟的克降j 表达 k + 的转运有关。 后来的许多转基因实验都进步展现了a t n h x l 对植物耐盐的重要作用，其 。 巾具代表性的成果有：拟南芥中a t n h x l 的过表达能使其生长于2 0 0 m mn a c l 中，并伴随有a t n h x l 的活性、转录产物、编码蛋白都升高的现象( a p 睇e ta 1 。 1 9 9 9 ) ；被转入a t n h x l 的番茄能在2 0 0 m mn a c i 中生长、结果，并且其果实中 不富集n a c i ，因而不影响其食用( z h a n g e ta 1 ，2 0 0 1 ) ；被转入a t n h x l 的小麦能 诅极高盐碱条件下具有高于普通小麦的萌发率和产量，并能保持细胞内的低n a + 岛k + 水平( x u ee ta 1 ，2 0 0 4 ) 。 此外，众多的研究表明，a t n h x 基因是植物耐盐相关信号途径中的重要组 成成分。( 详见本文第一章的1 1 1 1 ( 5 ) 信号调节途径) 1 2 2 2 其它植物n h x 基因研究进展 随着拟南芥中a t n h x 基因家族的重要性为人们所逐渐认识，其他植物的n h x 丛因克隆和表达、功能研究也在不断地进行着。 关于单子叶植物中j 科基因的研究主要有：f u k u d a 等( 1 9 9 9 ) 克隆得到水稻 的n h x l ，并通过系统发育分析推测其定位于液泡膜上。之后，f u k u d a 等( 2 0 0 4 b ) 进一步通过试验证明其编码蛋白确实定位于液泡膜，而且其转录水平在n a c i 、 k c i 作用下上调，将o s n h x l 转入水稻后能有效提高转基因水稻耐盐能力。w u 等 ( 2 0 0 5 )