细菌分解葡萄糖-乳糖产酸产气使斜面与底层均呈黄色(酚红.doc

课程名称：微生物学检验技术授课专业：医学检验学时：2学时实验十二 大肠埃希菌、产气杆菌检验 一、实验目的1.掌握E.coli、产气杆菌的分离培养与鉴定方法；2.掌握E.coli、产气杆菌的形态、染色特性、培养特性、生化反应及鉴定依据。二、实验器材与试剂 1.菌种： 普通E.coli、产气杆菌 2.培养基：SS,中国兰,KIA,MIU,蛋白胨,葡萄糖蛋白胨水,枸橼酸盐琼脂斜面, 硝酸盐 culture media3.试剂： 20%尿素， 0.4%酚红水溶液， 1%中国兰水溶液，20%乳糖水溶液 1%玫瑰红酸酒精液，1%溴麝香草酚兰酒精溶液 靛基质试剂 甲基红试剂 VP试剂（40%KOH肌酸溶液），氧化酶试剂与纸片，3%过氧化氢，4.革兰染液，擦镜纸，电吹风，显微镜，恒温箱三、实验内容 标本的采集： 肠道细菌感染可采集粪便，肠道外感染可根据临床感染情况采集中断尿液，血液，脓汁，胆汁，脑脊液，痰，分泌物，水等。 检验程序 E.coli、产气杆菌 接种 SS，中国兰，KIA，MIU，蛋白胨水，葡萄糖蛋白胨水，枸橼酸盐琼脂斜面，硝酸盐 culture media 37 ，24h 观察分析结果 吲哚试验 VP试验 甲基红试验 GS 报告结果培养基的制备（Producting culture media）: 1.SS culture media(Samonella-Shigella培养基) （重点 ） 成分：营养物：示胨，蛋白质，牛肉膏抑制物：煌绿，胆盐，硫代硫酸钠，枸橼酸钠（抑制非病原菌生长）促进剂：胆（碱）盐 （促进病原菌生长）鉴别用糖：乳糖指示剂：中性红（酸红碱黄） 原理： 能利用乳糖的细菌产酸使指示剂变红色；枸橼酸铁能使产H2s的菌落中心呈黑色；硫代硫酸钠有缓和胆盐对痢疾杆菌，沙门菌的有害作用，并能中和煌绿和中性红的毒性 用途： 是一种强选择culture media ，用来分离肠道致病菌 用（附：现在Ssagar一般使用成品，只要按一定的量加入蒸馏水即可，无需调PH值，无需灭菌） 中国兰 culture media ：弱选择culture media 成分： 普通ager 100ml 乳糖（20%水溶液） 1g（5ml）1%中国兰水溶液 2ml1%玫瑰红酸乙醇液 1ml配好后culture media呈淡红色原理： 玫瑰红酸能抑制G+菌的生长。因其是酒精配制无需灭菌，但加时应避免开火焰。 能分解乳糖的细菌产糖，菌落呈蓝色，不分解乳糖细菌呈淡紫红色。 中国兰与玫瑰红酸的变色范围如下： 指示剂 酸性 碱性 中国红 蓝色 微蓝至无 玫瑰红酸 黄色 红色 用途：分离肠道致病菌用KIA culture media（双糖铁培养基）（重点、难点） 成分： 蛋白胨 FeSO4 NaCl 硫代硫酸钠 葡萄糖（1g） agar 乳糖（10g） 0.4%酚红 牛肉膏，水 （附：现一般使用成品，0.7kg 15min 高压灭菌。制成斜面培养基）原理： 葡萄糖，乳糖的分解： 细菌分解葡萄糖，乳糖产酸产气使斜面与底层钧成黄色（酚红指示剂变色范围：酸黄碱红），具有气泡。若细菌分解葡萄糖而不分解乳糖，分解乳糖产酸使culture media的PH下降，因此斜面和底面均成黄色，但葡萄糖含量较少，（葡萄糖：乳糖=1：10）所产生的酸可因接触空气而氧化，并因细菌生长繁殖利用含氧物质生成碱性化合物使斜面部分又变成红色，底层由于处于缺氧状态，细菌分解葡萄糖所生成的酸一时不被氧化而保持黄色。细菌产H2S可与culture media内的FeSO4作用形成黑色的沉淀。硫代硫酸钠是防止FeSO4被氧化。(3)用途: 鉴别肠道杆菌用MIU culture media (动力-靛基质-尿素酶培养基)(1)成分(实验指导160页)蛋白胨 10g agar 2g 水 1000mlNacl 5g KH2PO4 2g 葡萄糖 1g20%尿素 100ml 0.4%酚红水溶液 2ml调PH为7.068.95kpa高压灭菌15分钟,尿素与酚红高压灭菌后加入(2)原理 此培养基制成半固体,可观察细菌的动力,蛋白胨中有色氨酸,可做靛基质试验(原理后述),产生尿素酶的细菌将培养基中的尿素分解产氨,使酚红指示剂显红色。 用途 同时可观察细菌动力, 靛基质的产生,细菌分解尿素的活性硝酸盐 culture media成分 蛋白胨:1克 硝酸钾:0.1克 水:100ml PH:7.4-7.6原理：有些细菌还原硝酸盐为亚硝酸盐，亚硝酸盐可与醋酸作用生成亚硝酸，再与试剂中的对氨基苯磺酸作用生成重氮苯磺酸，再与-萘胺结合，生成红色的N- 萘胺偶氮苯磺酸 用途:硝酸盐还原试验用蛋白胨水培养基成分蛋白胨(胰蛋白胨) 20克Nacl 5g蒸馏水 1000ml调PH至7.4原理细菌能分解蛋白胨中的色氨酸产生靛基质和对位二甲基氨基苯甲醛,后有玫瑰红化合物生成(3)用途：靛基质试验用(indole)枸橼酸盐culture media成分Nacl 5g agar 20g 蒸馏水 1000mlMgSO4 0.2g NH4H2PO4 1g KH2PO4 1g枸橼酸钠 5g1%溴麝香草酚兰酒精溶液:10ml调PH至6.8(此培养基不加agar为枸橼酸盐液体培养基)制成斜面culture media原理：枸橼酸盐培养基中枸橼酸钠为碳的唯一来源，而NH4H2PO4是唯一来源，。有的细菌能利用枸橼酸钠为碳源，因此能在其生长，并且分解枸橼酸盐产生碳酸盐使培养基变碱，指示剂有绿色变为深兰色，阴性不生长、不变色用途枸橼酸盐利用实验用（citrate）葡萄糖蛋白胨水培养基成分:蛋白胨 0.5g 葡萄糖 0.5g K2HPO4 0.5g 蒸馏水 100ml调PH至7.2原理甲基红试验：细菌分解葡萄糖产生丙酮酸，再被分解成甲酸、乙酸等，使培养基的PH降低到4.4以下，甲基红显红色阳性代表菌株:大肠杆菌VP实验：细菌分解葡萄糖产生丙酮酸，再将其脱羧形成乙酰甲基甲醇，在碱性条件下，被氧化为二乙酰，二乙酰与培养基蛋白胨中精AA等所含的胍基化合物结合，生成红色化合物，在培养基中加入胍基化合物如，肌酸、肌肝等，可加速此反应。阳性代表菌株:产气杆菌用途 甲基红试验,VP试验用四、实验安排制备培养基，贴上标签第一台：SS平板：16个， 葡萄糖蛋白胨水：32支第二台：中国兰平板:16个 蛋白胨水： 16支枸橼酸盐琼脂斜面：16支第三台：KIA ： 16支 MIU：16支硝酸盐：16支接种安排每两人领有SS平板，中国兰平板各1个，葡萄糖蛋白胨水2支， 蛋白胨水、枸橼酸盐琼脂斜面、KIA、 MIU 、硝酸盐各1支，共8种培养基。四人一大组，2人一小组分别接种大肠杆菌和产气杆菌。KIA与枸橼酸盐琼脂斜面用琼脂斜面接种法，具体方法如下：（示教）用接种针挑取单个菌落，插入斜面正中垂直插入底部，抽出后在斜面上做蛇形划线即可。五、实验结果菌落观察：SS平板：（大多不生长，少数生长者分解乳糖产酸，通过中性红指示剂菌落呈红色，同时与胆盐结合成胆酸而发生沉淀，故菌落中心混浊）大肠杆菌：中等大小，圆形，凸起，边缘整齐，光滑，湿润不透明的红色菌落产气杆菌：同大肠杆菌中国兰平板：大肠杆菌：圆形，凸起，边缘整齐，光滑，湿润不透明的蓝色大菌落产气杆菌：圆形，凸起，边缘整齐，光滑，湿润不透明的蓝色大菌落生化反应：KIA MIU斜面 底层 产气 硫化氢 M U大肠杆菌：A A +/- + 产气杆菌：A A +/- + - I M VP C 大肠杆菌： + + 产气杆菌： + + 形态观察GS：革兰阴性， 中等大小杆菌， 两端钝圆，多呈单个分散存在六、实验报告写出大肠杆菌、产气杆菌在SS，中国兰平板上的菌落特征，革兰染色结果及各种生化反应结果。七、实验准备：SS培养基： 15ml/2人普通培养基： 15ml/2人KIA： 3 ml/2人MIU： 2ml/2人蛋白胨： 2ml/2人葡萄糖蛋白胨： 2ml/人枸橼酸盐琼脂： 3ml/2人硝酸盐培养基： 2ml/2人1%中国兰水溶液： 2瓶 1%玫瑰红酸酒精液： 2瓶20%乳糖水溶液： 2瓶20%葡萄糖水溶液： 2瓶20%尿素： 2瓶0.4%酚红水溶液： 2瓶 1%溴麝香草酚兰酒精溶液： 2瓶中号平板： 1个/人中号试管： 1支/人小号试管： 5支/2/人5ml无菌吸管： 1筒/教室1ml无菌吸管： 1筒/教室斜面板: 2个/教室靛基质试剂： 3瓶/教室甲基红试剂： 3瓶/教室VP试剂（40%KOH肌酸溶液）3瓶/教室氧化酶试剂与纸片： 2瓶/教室3%过氧化氢： 3管/教室玻片： 2张/人硝酸盐还原试剂： 1套/教室镊子： 3把/教室八、实验总结：1.VP实验的培养物按每ml加0.1ml40%的KOH肌酸溶液放置50度水浴2小时，或37度孵育4小时，充分摇动，观察结果。40%的KOH肌酸溶液的量可以多一些，水浴的结果更好观察。2.进一部强调革兰染色的操作。3.详述各种生化试验的原理。附一甲基红试剂的配置甲基红 0.02g