苦碟子注射液治疗贵州小型猪肝纤维化的实验研究.doc

苦碟子注射液治疗贵州小型猪肝纤维化的实验研究作者：赵菊花，吴曙光，巫全胜，郭科男，董小君，李术钗，魏剑林，钱宁【摘要】 目的观察苦碟子注射液对复合因素所致的贵州小型猪肝纤维化治疗作用。方法贵州小型猪15头，随机分为空白组、模型组、治疗组3组，分成造模和治疗两个阶段。除空白组外的其他2组前8周为造模阶段，用40Ìl4橄榄油(0.5 ml/kg)和兔血清(0.5 ml/kg)分别腹腔注射，空白组用橄榄油和生理盐水(NS)各0.5 ml/kg分别腹腔注射，1周两次，共8周;治疗阶段：实验的第9周开始，治疗组给予苦碟子注射液0.8 ml/kg(相当苦碟子生药16g)，其余2组给予NS 0.8 ml/kg，均为每天腹腔注射1次，共28 d。各组分别于实验末处死动物取血和肝组织块，测定血清谷丙转氨酶(ALT)、天门冬氨酸转氨酶(AST)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、白蛋白/球蛋白比值(A/G);行HE、Masson染色在光镜下及透射电镜观察肝脏组织病理学变化，以评价肝脏损伤程度和药物的治疗作用。结果苦碟子注射液能显著降低复合因素所致贵州小型猪肝纤维化动物模型的血清ALT、AST含量(P<0.01)，减轻肝损伤引起的ALB降低及A/G比例倒置(P<0.05或P<0.01);光镜切片示苦碟子注射液能减轻贵州小型猪肝纤维化模型的肝细胞变性、坏死，使增生的纤维成分减少，甚至消失。电镜照片显示：苦碟子注射液能减轻贵州小型猪肝纤维化模型的肝细胞损伤，稳定质膜，使细胞间质中胶原纤维沉积减少。结论苦碟子注射液对贵州小型猪肝纤维化模型具有显著的治疗作用，其可能的机制还有待进一步研究。 【关键词】 苦碟子注射液; 贵州小型猪; 肝纤维化; 治疗作用肝纤维化(HF)是多种慢性肝病的共同病理基础，是肝脏细胞外基质(ECM)合成与降解的不平衡，以致ECM在肝内大量沉积形成肝纤维化。HF是肝硬化的早期阶段和必经阶段，早期肝纤维化得到合理的治疗，其病理变化是可以逆转，但若病因持续存在则有25%40%最终可能发展成不可逆转的肝硬化乃至肝癌13，所以阻断和逆转肝纤维化已成为慢性肝病治疗中的一个关键问题。虽然近十余年来针对肝纤维化发生的各个环节进行抗肝纤维化治疗已取得一些进展，但是肝纤维化的治疗仍然是目前临床工作的难点，尚无理想的药物,中医药治疗本病有很好的前景。我们前期工作已从临床、动物实验两方面证实了苦碟子具有确切的活血化瘀功效4，5，并对啮齿类动物大鼠实验性肝纤维化有明显的改善作用6，7，而偶蹄目类动物贵州小型猪各个器官更接近人类器官，本课题组用苦碟子注射液治疗贵州小型猪肝纤维化模型，取得较好疗效。现报道如下。1 材料1.1 动物贵州小型猪15头(雌性7头,雄性8头)，体质量(2.71.1)kg,普通级，由贵阳中医学院动物实验研究所提供。实验前血清谷丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)白蛋白(ALB)及总蛋白(TP)、白蛋白/球蛋白比(A/G)均正常。饲料由贵州台农饲料有限公司提供。1.2 药物、试剂及仪器苦碟子注射液由沈阳双鼎制药有限公司提供，产品批号041013011，规格10 ml/支，相当200 g生药制成;CCl4(分析纯)由上海三浦化工有限公司生产，批号200303;橄榄油由上海化学试剂分装厂生产，批号200217。血清ALT、AST检测试剂由北京化工厂临床试剂分厂生产，批号041224;Masson染色液由珠海贝索生物技术有限公司生产;兔血清自备，常规紫外线照射消毒后低温保存备用。HITACHI(日立)7020全自动生化分析仪;ReichertJungE型超薄切片机;H600型透射电镜。2 方法2.1 实验分组与方法 将15头贵州小型猪适应性饲养1周，随机分为3组，即：空白组、模型组、治疗组，每组各5头。造模阶段(实验前8周)：除了空白组以外其他两组贵州小型猪前8周用40Ìl4橄榄油(0.5 ml/kg)和兔血清(0.5 ml/kg)分别腹腔注射，空白组用橄榄油(0.5 ml/kg)和生理盐水(NS 0.5 ml/kg)分别腹腔注射，1周两次，共8周。治疗阶段：实验的第9周开始，治疗组给于苦碟子注射液0.8 ml/kg(相当苦碟子生药16 g)，其余两组给于NS 0.8 ml/kg，每天腹腔注射1次，共28 d。所有的动物自由饮水和摄食。各组动物分别于第12周末次注药后禁食24 h行前腔静脉采血，收集血清，供血清生化学检测;并处死动物，立即在相同部位取肝组织分别固定于10%甲醛液和4%戊二醛锇酸液，供组织学和电镜观察。2.2 观察指标一般情况观察;应用HITACHI(日立)7020全自动生化分析仪测定血清ALT，AST，ALB，TP，A/G;取肝组织块用10%甲醛液固定，常规石蜡连续切片，邻片作HE、Masson染色作光镜观察;取肝组织块用4%戊二醛锇酸液固定，超薄切片，作电镜观察。2.3 统计学处理所得数据用SPSS11.0统计软件进行统计分析，结果以s表示,用单因素方差分析及组间两两比较用Tukey HSD法比较组间差异的显著性。3 结果3.1 一般情况整个实验过程中各组动物均无死亡。空白组：精神佳，活动自如，毛色光滑，饮食量无改变。模型组：精神较差，在注射药物当天喜卧不活动，毛色不光滑，时有厌食呕吐现象。治疗组：在造模阶段基本情况同模型组，在进入治疗阶段后精神尚可，活动量、每餐饮食量较前明显增多。3.2 体质量增长结果见表1。表1 体质量增长情况与空白组比较，* P<0.05，* P<0.01;与模型组比较，P<0.05从表1可见在整个实验中，空白组体质量呈随龄递增的上升曲线，模型组从5周开始与空白组有显著差异(P<0.05)，治疗组从第6周开始和空白组有差异(P<0.05)。模型组和治疗组在实验的前8周，体质量几乎在原位增长，上升很少，二组无差异(P>0.05);在实验的第9周开始，两组动物体质量都呈明显的上升趋势，但治疗组的动物体质量增长较模型组快，两组之间有统计学差异(P<0.05)。3.3 肝功能情况见表2。表2 各组血清ALT，AST，ALB，TP，A/G的比较与空白组比较，P<0.01;与模型组比较，*P<0.05，*P<0.01;n=5模型组、治疗组ALT，AST含量均高于空白组，而以模型组最高，显著高于其他各组(P<0.01);治疗组ALT，AST含量高于空白组，但无统计学差异(P>0.05);模型组、治疗组ALB含量、A/G均低于空白组，而以模型组最低，显著低于其他各组(P<0.05，P<0.01);治疗组ALB含量、A/G低于空白组，但无统计学差异(P>0.05);3组TP含量无差异(P>0.05)。3.4 各组动物肝组织病理学改变3.4.1 肉眼观察空白组：肝脏颜色鲜红，被膜无增厚和黏连，大小正常，分叶清楚，表面光滑，质软。模型组：腹腔有异味，部分有腹水，肝脏色灰白，被膜增厚，局部有黏连，表面凹凸不平，质硬。治疗组：肝脏颜色暗红，被膜无增厚，局部地方有黏连，但黏连轻，大小正常，分叶较清楚，表面较光滑，质中等。3.4.2 光镜观察光镜下观察HE、Masson染色邻片。空白组：肝小叶结构清晰，在肝小叶周边区及汇管区有少量的结缔组织形成的间隔，使肝小叶之间分界清楚，肝细胞形态、大小正常，肝血窦无扩张(见图1);模型组：肝小叶结构不完整，中央静脉偏位或缺如，肝小叶之间分界线不明显，可见大量增生的结缔组织(Masson染色呈蓝染的胶原纤维)破坏了肝小叶的正常结构，在肝小叶中央区和汇管区增生的纤维组织成束状或形成很厚的间隔，甚至形成大小不等、形态不规则的假小叶，但以肝小叶中央区结缔组织沉积最多，肝细胞排列紊乱，肝血窦变窄，在高倍镜下可见大量的、弥漫的肝细胞空泡样变性，甚至气球样变性、细胞坏死(见图2);治疗组:正常肝小叶的之间分界线较明显，中央静脉及汇管区的各种结构存在，在肝小叶中央区和汇管区仍可见少量的结缔组织沉积，以肝小叶周边区沉积较多，但与模型组相比较，其纤维组织间隔很细，呈线状，数量也明显减少，呈散在分布，肝细胞呈索状放射状排列，高倍镜下肝细胞形态、大小基本正常，在局部地方仍可见少量的肝细胞呈轻度变性，细胞坏死不明显(见图3)。3.4.3 电镜观察空白组：肝细胞体积较大，各种膜的双层结构清晰，相邻肝细胞之间的细胞连接清楚可见;肝细胞核大而圆，核周间隙清楚可见，无扩张，核内常染色质丰富，核仁清楚位于中央;胞质中线粒体丰富，由双层单位膜围成的，数量较多分布均匀，线粒体嵴明显;粗面内质网极为丰富，常呈多层平行排列，其上的核糖体清楚可见，滑面内质网较少;胞质中还有高尔基复合体和糖原颗粒。相邻肝细胞围成的胆小管腔无扩张，在胆小管腔内可见肝细胞膜形成丰富的微绒毛;在肝血窦的内皮细胞上有孔，无基膜;内皮细胞与肝细胞血窦面之间的Disse间隙及其内的微绒毛清楚可见，在Disse间隙可见肝星状细胞(HSC)，核较大呈椭圆形，胞质内含有大小不等的脂滴。模型组：肝细胞质中出现大小不一的脂滴和密度极低的空泡状膜包结构，粗面内质网较少、扩张、脱颗粒并可见内质网融合成空泡状膜包结构;线粒体形态不规则，部分嵴减少、排列不齐或消失，嵴间腔扩张;肝细胞核膜明显肿胀，核内外膜之间出现密度不一的间隙，核周间隙明显扩张，核内也可见均质状的低密度空泡状膜包颗粒，有的肝细胞出现完全分离的大小核，也可见无核膜的核内物质分散于质中的现象;在成纤维细胞周围，有数量不等、排列紊乱、具有周期性横纹的胶原原纤维存在，甚至集合成束(见图4，5)。治疗组：肝细胞膜、核无明显改变，肝细胞质中仍有空泡状结构，但接近正常，线粒体、粗面内质网丰富，部分线粒体嵴不清楚，内质网仍有肿胀，糖原颗粒增多，核膜清晰，变性肝细胞少见，胆小管腔与紧密连接结构清晰无异常，在肝实质细胞周围仍有少量胶原纤维(见图6，7)。4 讨 论肝纤维化当属于中医“血瘀”“胁痛”“癥瘕”范畴。中医认为其临床证候错综复杂，但其基本病机是正衰邪盛，湿热未尽兼血瘀，肝郁脾肾气血虚，本虚标实，虚实夹杂，关键在于血瘀，血瘀表现在慢性肝炎、肝硬化的病理上就是肝纤维化的形成8，9。中医药从整体观入手，对其进行辨证论治，显示特有的优越性。综观中医治疗肝纤维化的治则，虽各有所长，但采用活血化瘀法治疗已为医家达成共识，经实验研究及临床观察已证实活血化瘀法对抑制肝纤维化有明确的疗效 1012。肝细胞核分为两个 成纤维细胞及周围大量部分，细胞器消失 被纵切的胶原纤维可见明暗相间的有周期性横纹的胶原原纤维图4 模型组(20000) 图5 模型组(50000)肝细胞部分核，小微泡状的内质网， 肝实质细胞周围仍有少接近正常，未见大融合状的内质网 量胶原纤维图6 治疗组(15000) 图7 治疗组(25000)苦碟子异名满天星，味苦、辛，性寒。苦碟子注射液是以菊科植物苦碟子(抱茎苦荬菜Ixeris sonchifolia Hance)全草为原料，提取精制而成的纯中药静脉注射液，其主要成分为黄酮和腺苷，有研究证实苦碟子注射液的活血化瘀作用13，14，在临床上主要用于用于瘀血闭阻的胸痹。我们课题组前期证实苦碟子注射液对大鼠肝纤维化有一定的防治作用6，7，而贵州小型猪其器官发生、生长发育、食性、营养代谢、组织结构、生理生化正常值、疾病发生发展和转归等方面均更接近于人类15，16;本实验所用复合因素造贵州小型猪肝纤维化模型稳定、可靠，与人的慢性肝病所致的肝纤维化更接近，是研究肝纤维化较理想的动物模型17。从本研究结果可见模型组和治疗组在实验前8周体质量上升很少，两组无差异(P0.05)，因该时段两组动物均为造模阶段，对动物的各项处理因素一致;在实验的第9周(即治疗开始)，两组动物体质量都呈明显的上升趋势，但治疗组的动物体质量增长较模型组快，两组之间(第9周末)出现统计学差异(P0.05)。实验结果表明苦碟子注射液可能有增加肝纤维化模型动物体质量的作用。ALT，AST，ALB，A/G是反映肝脏功能的客观指标。本实验研究显示，苦碟子注射液治疗组ALT、AST含量均较模型组明显降低，可减轻肝损伤引起的血浆白蛋白降低及白/球蛋白比例倒置，具有较好的保护肝细胞的作用。从光镜观察结果显示，苦碟子注射液治疗组结缔组织数量、纤维间隔的厚度均较模型组明显减少，可减轻肝细胞的变性、坏死程度