基因工程的基本操作程序的步骤.ppt

用切目的基因相同的限制性内切酶切割质粒 目的基因 1 2基因工程的基本操作程序 专题1基因工程 目的基因的检测与鉴定 基因工程的基本操作程序的步骤 目的基因的获取 基因表达载体的构建 将目的基因导入受体细胞 阅读与思考 1 什么是目的基因 2 获取目的基因的方法有哪些 其操作过程分别是怎样的 一 目的基因的获取 1 目的基因概念 主要是指编码蛋白质的基因 人类所需要的基因 如 抗虫基因 胰岛素基因 也可以是一些具有调控作用的因子 2 目的基因获取的方法 从基因文库中获取目的基因利用PCR技术扩增目的基因化学方法直接人工合成目的基因 一 从基因文库中获取目的基因 基因文库定义 见课本P9 种类 基因组文库 部分基因文库 如cDNA文库 基因组文库的构建过程 基因组文库 cDNA文库的构建过程 mRNA 单链DNA 双链DNA cDNA文库 如何从基因文库中找到所需要的基因 依据目的基因的有关信息 如 根据基因的核苷酸序列基因的功能基因在染色体上的位置基因的转录产物mRNA基因翻译产物蛋白质等特性 二 利用PCR技术扩增目的基因 PCR的全称 聚合酶链式反应PCR的原理 DNA复制 体外 PCR技术扩增目的基因的前提条件 要有一段已知的目的基因的核苷酸序列 模板原料引物Taq酶控制温度 目的基因DNA 四种脱氧核苷酸 如单链DNA分子片段 热稳定的DNA聚合酶 PCR仪自动调控 PCR的条件 高温变性 低温复性 中温延伸 PCR的过程 目的基因DNA受热变性而解链 90 95 引物与DNA单链互补结合 55 60 DNA聚合酶催化延伸合成新链 70 75 高温变性 低温复性 中温延伸 PCR技术与DNA复制的比较 三 用化学方法直接人工合成 条件 仪器 基因较小 核苷酸序列已知 DNA合成仪 二 基因表达载体的构建 复制原点 目的基因 标记基因 启动子 终止子 各元件具有怎样的功能 1 元件 启动子 终止子 位于基因尾端 转录停止的信号 位于基因首端 RNA聚合酶识别和结合的部位 驱动基因转录出mRNA 2 基因表达载体的构建目的 a 使目的基因在受体细胞中稳定存在 并且可以遗传给下一代 b 使目的基因能够表达和发挥作用 载体与基因表达载体的区别 同 二者均有标记基因和复制原点异 表达载体在载体的基础上增加了目的基因 启动子 终止子三部分结构 其中启动子 终止子对于目的基因的表达 转录步骤 必不可少 载体的组成 复制原点 目的基因插入位点 标记基因 基因表达载体的组成 复制原点 目的基因 标记基因 启动子 终止子 三 目的基因导入受体细胞 1 什么是转化 2 目的基因导入植物细胞常用的方法是什么 具体过程是怎样的 3 目的基因导入动物细胞常用的方法是什么 基本操作程序是怎样的 4 目的基因导入大肠杆菌的方法是怎样的 钙离子有什么作用 转化 目的基因进入受体细胞内 并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程 1 目的基因导入植物细胞 常用的方法 农杆菌转化法 基因枪法 花粉管通道法 农杆菌的特点 a 易感染双子叶植物和祼子植物 b 具有趋化性 c Ti质粒上的T DNA可转移到受体细胞 并整合到受体细胞染色体的DNA上 1 目的基因导入植物细胞 农杆菌转化法的导入过程 构建基因表达载体 转入 农杆菌 植物细胞 导入 稳定维持和表达 目的基因导入动物细胞 常用的方法 显微注射技术操作程序 a 先提纯含目的基因的表达载体b 从动物体内取出卵 受精卵 c 显微注射仪进行显微注射d 将含目的基因的受精卵移植到输卵管或子宫中发育成新个体 3 目的基因导入微生物细胞 原核生物的特点 繁殖快 多为单细胞 遗传物质相对较少 大肠杆菌的转化过程 用Ca2 处理细胞 增加细胞壁的透性 与细胞膜无关 感受态细胞 重组表达载体DNA分子与感受态细胞混合 感受态细胞吸收DNA分子 四 目的基因的检测与鉴定 1 导入目的基因后需要检测哪些方面 各采取什么方法 2 什么是DNA分子探针 检测时的DNA探针通过什么原理来检测目的基因和相应的mRNA 3 利用抗体 抗原杂交检测的原理是什么 目的基因是否插入受体细胞染色体的DNA上 检测1 检测方法 DNA探针 用放射性同位素等作标记的含有目的基因的DNA片段 DNA分子杂交技术 用DNA探针与基因组DNA杂交 目的基因是否转录出mRNA 检测2 检测方法 分子杂交技术 用DNA探针与mRNA杂交 检测3 检测方法 抗原 抗体杂交 目的基因是否翻译出蛋白质 4 个体生物学水平的鉴定 珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分 当它的成分异常时 动物可能患某种疾病 如镰刀型细胞贫血症 假如让你用基因工程的方法使大肠杆菌生产出鼠的 珠蛋白 想一想 应该如何设计 思考与探究 1 从小鼠中克隆出 珠蛋白基因的编码序列 CDNA 2 将cDNA前接上在大肠杆菌中可以适用的启动子 另外加上抗四环素的基因 构建成一个表达载体 3 将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中 然后在含有四环素的