绵羊DGAT1基因部分片段的遗传多态性分析方法的建立毕业论文.doc

绵羊DGAT1基因部分片段的遗传多态性分析方法的建立毕业论文1.前言二酰基甘油酰基转移酶(DGAT,包括DGAT1、DGAT2和DGAT3)是参与肠道中脂肪吸收、脂蛋白组装、血浆甘油三脂(TG)浓度调节、脂肪细胞中脂肪储存、肌肉能量代谢1及乳脂合成、禽蛋及卵母细胞形成等的一种非常重要的微粒体限速酶。据报道2-4,Dgat-deficient (Dgat-/-)小鼠尽管能存活,但比普通小鼠瘦弱,它可通过增加能量消耗对食物特别是高脂肪饮食诱导的肥胖症产生抗性,其组织TG水平降低,胰岛素和瘦素敏感性以及葡萄糖耐量提高,而且母鼠不能泌乳,因此DGAT基因可能是影响动物生长发育及胴体性状的重要候选基因。此外,过表达DGAT1(二酰基甘油酰基转移酶1)可减少信号脂质(二酰基甘油、磷脂酶等)而合成TG,调节膜脂质和信号脂质的合成,因而在调节细胞生长方面有重要作用5。有研究表明,牛DGAT1基因的一个K232A变异位点与产奶性状尤其是乳脂率密切相关,该突变可能就是该14号染色体上影响乳脂率的QTL(数量性状基因座)效应的分子机制6-9。目前大多研究者认为,DGAT1基因是影响牛奶乳脂率及脂肪沉积的重要候选基因,在生长发育和肉质性状等的形成中具有重要的生物学功能。在羊上，主要的研究集中于羊的脂肪沉积和DGAT1基因的活性表达和DGAT1基因的分离鉴定表达与调控的研究是热点。大多数都采用SSCP。RFLP,RAPD等方法分析该基因的多态性，再筛选优势基因进行研究，然后进行定向诱变，加大优势基因的突变频率，产量可大幅提高。2.实验材料与器材2.1实验材料本试验所用的样品为绵羊的全血，样本数量为4份，采取颈静脉采血，用肝素钠抗凝后，采样后立即编号，迅速做DNA的提取。2.2主要仪器和设备(1)凝胶数字成像系统：Bio-Pro型，西盟国际公司，00608124(2)电泳仪：北京六一仪器厂(DYY-1L),Biometra公司（xT5AH）(3)电泳槽：Biometra公司(4)PCR仪：Biometra公司（5）微型离心机：Thermo公司（6）电热恒温水浴锅：DK-S26型，上海精宏实验设备有限公司（7）多功能水域恒温振荡器：SHA-D型，江苏正基仪器有限公司（8）旋涡混合仪：XW-80A型，海门市其林具而仪器制造有限公司（9）立式电热压力蒸汽灭菌锅:LDZX-50KBS型，上海申安医疗器械厂（10）制冰机：SIM-F140型，SANYO公司（11）超纯水设备：Sartorius公司（12）可调式微量移液器：Thermo公司，编号和量程如下表：表1试验所用的微量移液器编号ZX01518ZX00732ZX03315ZX05185量程（L）0.5-105-5020-200100-10002.3分子生物学与制图软件（1）DNA STAR Lastergene（转换序列和查找序列）（2）Primer Premier5.0（引物设计）（3）Oligo（验证引物合理性）.主要试剂（1）提取试剂盒:H.Q.&.QDNA提取试剂盒，安徽优晶生物工程有限公司生产，组成Mu-PuDNA分离柱，2ml收集管，ZZ-I缓冲液，ZZ-II缓冲液，DNA洗涤缓冲液，DNA洗脱缓冲液，OB蛋白酶。（2）PCR试剂盒：Fermentas公司生产试剂盒的组成：25mmol/L10Taq Buffer,10mmol/LdNTP,5U/LTaq Polymerase ,25mmol/LMgCl2。（3）其他试剂：琼脂糖、鹏程生物 批号：Ameresco 0425600bp ladder Maker、上海生工生物工程有限公司 批号：HF4056loading buffer鹏程生物 批号：Ameresco 0463 、Tris碱 鹏程生物 批号：Ameresco 0497、过硫酸铵 莱阳市双双化工有限公司 批号：2007.01.0924、丙烯酰胺、西安化学试剂厂 批号：GBG75-52去离子甲酰胺 Bio.Basic.ing公司 批号：FDB 0212-500ml、硝酸银 西安化学试剂厂 批号：GBG70-77、无水碳酸钠 天津正太龙化工有限公司 批号：070410、无水乙醇 烟台双双化工有限公司 批号：2008.3.28、TE缓冲液 上海生工生物工程有限公司 批号：SD106、甲醛 上海中秦化学试剂有限公司 批号：2007.4.3硼酸 天津巴斯夫化工有限公司 批号：06.11.083.实验设计与方法3.1实验设计本实验总体思路：采样进行DNA提取对提取的DNA进行PCR琼脂糖电泳检测扩增产物的特异性PAGE检测样品基因的多态性3.2试验方法3.2.1基因组DNA的提取本实验采用DNA提取试剂盒来提取基因组DNA，操作步骤按说明书进行。（1）取1ml抗凝血，移入1.5ml离心管中，加入200LZZ-I缓冲液。（2）加入25L20mg/ml的OB蛋白酶，漩涡混匀后，55温浴3h,每30min在旋涡混合仪上混匀一次。（3）温浴3h后，104g/min离心1分,将上清液转移到1.5ml离心管中。（4）在上清液中加入220LZZ-II缓冲液,旋涡混合仪上混合均匀,70水浴10min。（5）加入220L无水乙醇, 旋涡混合仪上混合均匀。（6）所的样品转移至Mu-Pu柱上,将柱放入2ml收集管中,8000g/min离心1min。弃去收集管中的液体。（7）把柱子装到新的收集管中,吸取720L用乙醇稀释过的DNA洗涤液于柱中，8000g/min离心1min,弃去收集管。（8）把柱子装到新的收集管中,吸取720L用乙醇稀释过的DNA洗涤液于柱中，8000g/min离心1min,弃去收集管。（9）急速离心(104g/min以上)2min,甩干DNA。（10）将柱子置于1.5ml离心管中,加入200L 70预热的DNA洗脱缓冲液,室温放置3min。（11）8000g/min离心1min以从柱子上洗脱出DNA,收集管中的液体即为DNA溶解液。（12）DNA的检测:吸取5L从柱子上洗脱出的DNA,与1L6 loading Buffer混合好后,点样于1.0%的琼脂糖凝胶上,100V恒压电泳0.5-1h,电泳结束后于凝胶成像系统上观察条带,并判断所提取的基因组DNA能否用于PCR扩增反应。3.2.2引物的设计与合成引物根据Gene Bank上发表的绵羊的DGAT1基因部分序列，利用DNASTAR软件转换成SEQ格式的文件，再用Primer Premier5.0软件设计合理的引物，并经oligo软件和blast工具进行验证后，提交上海捷瑞生物工程公司合成引物。(引物见附录)3.2.3PCR扩增反应1.PCR扩增反应体系本实验采用25LPCR反应体系,各组分体积、浓度如表2所示表2 25LPCR反应体系PCR反应各组分所用体积（L）终浓度25mmol/L10Taq Buffer2.52.5mmol/L0.5 U/LTaqDNA Polymerase0.20.04U/L2.5mmol/L MgCl22.00.2 mmol/LPCR反应各组分所用体积（L）终浓度2.5m/L dNTPs2.51mmol/LDNA模板1.50.05g/l10mol/L上游引物1.00.4mol/L10mol/L下游引物1.00.4mol/L超纯水14.3-2.PCR扩增程序本次采取普通PCR来扩增目的DNA，PCR扩增程序如下：表3 PCR扩增过程表温度（）时间（s）过程备注955预变性-9445变性循环35次6160退火7260延伸72600延伸充分合成产物47200保存如需立即实验，则不用此步3.PCR扩增产物的检测从每个反应管中分别取3L扩增产物，与1.0L6 Loading Buffer混匀，加样于1%的琼脂糖凝胶上，另加5L 600bp DNA Marker 做参照。100V电泳0.5h。结束后，于凝胶成像系统上观察条带，特异性很好的PCR产物方可用于PCR-SSCP检测，无条带或是非特异性条带产物出现的产物都不能用于PCR-SSCP。3.2.5 PCR-SSCP检测（聚丙烯酰胺凝胶电泳）电泳装置的准备在方盒中装上水,并加入一定量的洗涤剂,再将所用的玻璃板放入,浸泡0.5-1h,之后用软毛刷将其表面的污渍去除干净,再用自来水冲至无泡沫,用蒸馏水冲洗3-5次,再用75%的酒精擦拭使用面(也可全擦),待干燥后将垫条夹在玻璃板中间,外面用透明的胶布粘贴(每个面上卷回0.8cm即可),再用夹子固定于胶版架上,防止倒胶时外漏。聚丙烯酰胺的制备1凝胶贮存液的制备（1）超纯水:用超纯水设备制备电阻率超过10Mcm-3超纯水100ml，存放于4，备用。（2）30%丙烯酰胺贮存液：称取29g丙烯酰胺和1g甲叉双丙烯酰胺溶于60ml上述的水中（必要时加热至37），再定容至100ml，存放于4，备用。（3）10%过硫酸铵 称取3g过硫酸铵（A.R.）溶于30ml水中，存放于4，备用。（4）TEMED(四甲基乙二胺)新买来的TEMED，需分装成小包装使用，一般分成2ml/份。（5）5TBE 称取54gTris,3.72gNa2EDTA2H2O,27.5g硼酸(H3BO3),混合加入1L的烧杯内,并加入800ml的去离子水,充分搅拌至完全溶解,再加水定容至1L,室温存放。2.PAG凝胶的制作本实验采用8%的凝胶电泳,具体配方见下表10:表4 8%的PAGE配方表-15202530405080作用超纯水7.910.513.215.821.126.442.2稀释30%丙烯酰胺贮存液1.010.613.321.3凝胶的成分5TBE3.04.05.06.08.010.016.0加大离子强度10%过硫酸铵80.210.280.350.56引发剂TEMED0.0100.0130.0160.0200.0260.0330.052加速剂3.聚丙烯酰胺凝胶的灌制（1）将夹住的玻璃板于桌面呈70放置，将混匀的凝胶液缓慢倒入两块玻璃板中间，直至灌满，注意此操作不可产生气泡。（2）灌好后立即插入梳子，梳子底端不要产生气泡，须仔细观察（3）在室温下聚合约30-40min，梳子底端的凝胶出现折射率不同的线，表明凝胶聚合完成，拔去梳子。（4）立即用电泳缓冲液冲洗加样孔，冲走多余的未聚合的凝胶。（5）拆除胶带和垫条将加样孔朝向电泳缓冲液的槽放置，并用夹子固定。（6）在上下两槽中倒入1TBE缓冲液，并检查上槽是否漏液。（7）将电泳槽的盖子盖上，并查到电泳仪上，开始预电泳，电压150V，时间：半小时。PCR产物的处理在PCR管内加入4L去离子甲酰胺和1.5L6 loading Buffer，再加入2LPCR产物，3000r/min离心30s后,在PCR仪上95变性5min,冰浴12-15min,以维持DNA的单链状态。 聚丙烯酰胺电泳每个加样孔加样5L,并于4下200V电泳5-7小时。电泳后处理1.相关溶液的配制（1）10%乙醇溶液 量取200ml无水乙醇,用蒸馏水定容至2000ml。（2）1%HNO3溶液 领取29ml 70% HNO3,用蒸馏水定容至2000ml。（3）0.2% AgNO3溶液 取0.4g AgNO3 用蒸馏水定容至200ml。（此溶液需现配现用）。（4）3% Na2CO3溶液 称取60g Na2CO3 粉末,用蒸馏水定容至2000ml,再加入2ml 40%的甲醛(HCHO),然后混合均匀。（5）10%乙酸溶液 量取200ml乙酸(99.8%),用蒸馏水稀释至2000ml。2.处理过程电泳结束后取下玻璃板,小心的将上面的玻璃板取下然后浸入蒸馏水中2分弃去蒸馏水10%乙醇固定10分浸入蒸馏水中2分弃去蒸馏水1% HNO3 氧化15分浸入蒸馏水中2分弃去蒸馏水0.2% AgNO3溶液浸入蒸馏水中2分弃去蒸馏水3% Na2CO3溶液显色纸条带清晰为止浸入蒸馏水中2分弃去蒸馏水10%乙酸终止染色保存于10%乙酸中并拍照,做结果分析4.结果与分析4.1DNA提取结果用试剂盒法提取的羊基因组DNA,在1%琼脂糖凝胶上电泳检测,结果如图1.图中的亮带即为羊基因组DNA,条带清晰,DNA可以用于PCR扩增反应。图1 DNA提取结果从上图可以看出，羊的基因组DNA很大，电泳的速度并不快，条带清晰没有明显的拖尾和前伸，表明DNA分子相对完整，因此，可以用作PCR反应的模板。4.2 PCR扩增结果PCR产物通过1%琼脂糖凝胶电泳检测,表明扩增产物的长度于预期片段大小相同,且没有非特异性扩增,条带没有明显的拖尾,可以用于SSCP检测,其检测结果如图2。600500400300200100图2PCR结果的琼脂糖电泳分析1，2，3，4分别是PCR扩增产物从图中我们可以看到，扩增产物的条带清晰，没有拖尾和欠伸，表明特异性好，可以用于SSCP分析，产物大小近似于380bp，与理论值相符性较好，因此实验结果比较理想4.3 SSCP分析结果PCR产物进行SSCP分析,发现结果发现,位点有1对等位基因A和B，大部分样品出现三条带，两条DNA单链，一条是没有完全变性的双链DNA。在第四个和第十二个样品孔出现了一条突变的单链，表明基因存在多态性。结果如图3。图3 PCR-SSCP PAGE结果5.分析讨论5.1DNA提取综述 本实验采用试剂盒法提取DNA，在日常试验中我们经常用酚-氯仿法提取真核细胞的基因组DNA，而用CTAB法提取原核生物的基因组DNA。下面简要简绍下它们的相关内容5.1.1真核生物提取DNA真核生物提取DNA包括细胞的破碎，去除与DNA结合的蛋白质，沉淀核酸，去除残留的杂质，DNAa的贮存等一个步骤。可分为从培养细胞中提取DNA,从特定组织的人体细胞中提取DNA,和血液样品的DNA提取等几个类型。12如：从动物血液中提取DNA,可按下面的步骤进行：750l冻存血样加入等量PBS，混匀12000rpm离心10min，弃上清加入450lDNA抽提液，重悬沉淀加入Rnase至终浓度为20g/ml,37温育1h加入蛋白酶K（20mg/ml），至终浓度为100g/ml，50-55消化过夜将溶液冷却至室温，加入等体积的Tris饱和酚，温和摇动10min，成乳浊液12000rpm离心10min，取上清等体积苯酚：氯仿（1：1）抽提12000rpm离心10min，取上清等体积氯仿抽提12000rpm离心10min，取上清2倍无水乙醇沉淀DNA12000rpm离心10min，弃上清70%乙醇沉淀两次真空抽干，用适量的TE（pH8.0）溶解DNA1.2%琼脂糖电泳初步检测DNA浓度和纯度。5. 1.2原核生物提取DNA（1）菌株：纯化的各种革兰氏阳性、阴性菌株。（2）具体步骤： 超净台内将菌种接种于含1%葡萄糖的LB液体培养基(用无菌牙签蘸取)，5ml/tube2，于37220rpm离心过夜。 超净台内将10ml菌液转移至50ml圆底离心管。45000rpm离心20min。 弃上清，加入1.2ml 10mM Tris-Cl (PH8.0)/25% Sucrose，vortex悬浮，分装到2只1.5ml EP管(0.6ml/EP)。 加入10mg/ml溶菌酶(新鲜配制)，使终浓度为1mg/ml，混匀，37水浴10min。、 加入20%SDS，使其终浓度为0.5%；加入蛋白酶K，使终浓度为100ug/ml，轻柔混匀。50水浴3h，期间不时颠倒混匀。 冷至室温，加入等体积酚/氯仿，充分颠倒混匀10min。 室温5000rpm离心15min，取上清。 重复步骤6，7。 加入等体积氯仿，充分颠倒混匀10min。室温5000rpm离心15min，取上清。 两EP合并，分至3只EP管(约0.4ml/EP)。 每EP管加入2体积预冷的无水乙醇和1/10体积的3M NaOAC(使其终浓度为3M)，-20沉淀2h或过夜。 0离心，最大转速(或5000g)，弃上清。 加入半管(约700ul) 70%乙醇洗涤，4离心，最大转速(或5000g)，弃上清。 室温干燥。 溶于适量TE(PH7.4)(2050ul)，加入10mg/ml RNase，使终浓度为20ug/ml，37水浴2h。 重复酚/氯仿抽提，无水乙醇/3M NaOAC沉淀，70%乙醇洗涤。(步骤及方法同上) 用适量ddH2O溶解。 -20保存5.2引物设计5.2.1引物设计原则（1）引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74，不适于Taq DNA聚合酶进行反应。（2）引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物3端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，也会使错误引发机率增加。（3）引物3端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3端使用碱基A。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。5端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。（4）引物序列的GC含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。（5）引物所对应模板位置序列的Tm值在72左右可使复性条件最佳。Tm值的计算有多种方法，如按公式Tm4(G+C)2(A+T)，在Oligo软件中使用的是最邻近法(The Nearest Neighbor Method)。（6）G值是指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3端G值较低（绝对值不超过9），而5端和中间G值相对较高的引物。引物的3端的G值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。（7）引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过4。5kcal/mol）易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。（8）对引物的修饰一般是在5端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入PCR产物的载体的相应序列而确定。（9）引物的一个重要参数是熔解温度（Tm）。这是当50的引物和互补序列表现为双链DNA 分子时的温度。两引物的Tm 值相差不应大于5。计算Tm 有几种公式。:Tm =（g + C）%4 +（a + T）%2 （10）当在引物5端添加酶切位点时要考虑：该目的序列内部不得含有相同的酶切位点， 如果PCR 后直接酶切，不要忘了在酶切位点的外侧再加上保护碱基，不同的酶对于保护碱基的要求是不同的，如果不设计保护碱基，则多半要用TA克隆的方式连接到质粒上，这时要注意Taq 酶的选择 若想在目的序列上附加上并不存在的序列，如限制位点和启动子序列，可以加入到引物5端而不影响特异性。当计算引物Tm 值时并不包括这些序列，但是应该对其进行互补性和内部二级结构的检测。5.3电泳相关问题的讨论5.3.1PCR及琼脂糖凝胶电泳（1）TAE和TBE都是常用的缓冲液，TBE相对于TAE而言有较高的缓冲量。（2）电泳中，溴酚蓝和0.5Kb大小的DNA一起移动，这可给泳动最快的DNA片段提供一个指征。（3）DNA的迁移依赖如下因素：1) DNA分子越小，迁移越快。琼脂糖其浓度越低，迁移越快。DNA的构象，环状切口DNA比线状DNA迁移快。两电极间每厘米的电压。电压越高，迁移越快。2)引物：1个OD260值相当于33g,2个OD260值相当于66g3)引物的贮存液浓度为100mol.L-1 ；工作液浓度为20mol.L-14)故2个OD260值的引物稀释为100mol.L-1的工作液时所需的加水量：（66g/分子量）104所需加水的L数。一般PCR反应中的引物终浓度为0.21.0mol.L-1.Xmol.L-1=OD260/A(16000)+C(70000)+G(12000)+T(9600) A、G、G、T（引物中的个数）RNA定量:根据OD260值算出 OD2601的溶液其RNA含量约为40g/ml。5)dNTP一般反应中每种dNTP的终浓度为20200mol.L-1。理论上4种dNTP各20mol。L-1足以在100L反应中合成2.6g的DNA，dNTP可配成510mmol.L-1并分装，20贮存。5.3.2SSCP分析(1)重复性.影响SSCP重复性的主要因素为电泳的电压和温度。这两个条件保持不变，SSCP图谱可保持良好的重复性。一般SSCP图谱是二条单链DNA带，但有时有的DNA片段可能只呈现一条SSDNA带，或者三条以上，这主要是由于两条单链DNA之间存在相似的立体构象。有时三条以上的SSCP图谱是由于野型DNA片段和突变型DNA片段共同存在的结果。(2)靶DNA序列长度的影响在实验中发现SSCP对短链DNA或RNA的点突变检出率要比长链的高，这可能是由于长链DNA和RNA分子中单个碱基的改变在维持立体构象中起的作用较小的缘故。而有人认为在DNA链较短的(400bp以下)情况下，DNA的长度不会影响SSCP 的效果。他们仔细选择了实验条件，发现354bp的DNA中点突变的检出率仍可达到90%以上。(3)电泳电压和温度的影响:为了使单链DNA保持一定的稳定立体构象，SSCP应在较低温 度下进行(一般4-15之间)。在电泳过程中除环境温度外，电压过高也是引起温度升高的主要原因，因此，在没有冷却装置的电泳槽上进行SSCP时，开始的5min应用较高的电压(250V)，以后用100V左右电压进行电泳。这主要是由于开始的高电压可以使不同立体构象的单链DNA初步分离，而凝胶的温度不会升高。随后的低电压电泳可以使之进一步分离。在实验中应根据具体实验条件确定电泳电压。(4)DNA片段中点突变的位置对SSCP的影响点突变在DNA和RNA中的位置对SSCP检测率的影响，取决于该位置对维持立体构象作用的大小，而不是仅仅取决于点突变在DNA链上的位置(有人认为点突变在DNA链中部要比在近端部容易被SSCP检测出来)。White曾设计了一组样品DNA片段，并将其中的点突变设在DNA链的中部，而且该点又正处在发夹结构顶端的环上，结果发现SSCP只能检测出9个样品中的2个(检出率为22%)，说明DNA链中任何部位的突变，只要对其单链立体构象没有影响，都有可能被漏检。 (5)SSCP的结果断定:由于在SSCP分析中非变性PAG电泳不是根据单链DNA分子和带电量的大小来分离的，而是以单链DNA片段空间构象的立体位阻大小来实现分离的，因此，这种分离不能反映出分子量的大小。有时正常链与突变链的迁移率很接近，很难看出两者之间的差别。因此一般要求电泳长度在16-18cm以上，以检测限为指标来判定结果。检测限是指突变DNA片段与正常DNA片段可分辨的电泳距离差的最小值。大于检测限则判定链的迁移率有改变，说明该DNA序列有变化，小于检测限则说明链之间无变化。例如，一般检测限定为3mm，那么当两带间距离在3mm以上，则说明两链之间有改变。另外检测限不能定的太低，否则主观因素太大，易造成假阳性结果。另外，SSCP分析中其它条件，如PCR产物的上样量，PAG的交联度、以及胶的浓度等，都应根据具体实验进行选择确定。总之，SSCP分析法是一种快速、简便、灵敏的突变检测方法，适合临床实验室的要求。它可以检测各种点突变，短核苷酸序列的缺失或插入。随着 SSCP分析不断完善，它将成为基因诊断研究的一个有力工具。6.结论本试验对DGAT1基因外显子14的多态性进行分析发现:周岁绵羊群体在DGAT1基因外显子14的第8位座位上存在1对等位基因A和B,其中A等位基因为优势等位基因;该群体在该位点处于Hardy-Weinberg非平衡状态,即该群体在人工选择、迁徙和遗传漂变等因素作用下,该基因座处于非平衡状态中;该群体该位点的遗传多态性处于低度多态水平。造成上述情况的原因,可能主要与该群体该位点在长期的选育或进化过程中出现新突变有关。对该突变位点与部分生长、胴体性状的相关性分析表明,该基因位点与绒山羊育种指标具有一定的相关性,其中BB基因型为有利基因型,这说明若加强对BB基因型的选择,提高B等位基因的比例,可望改善绒山羊的生长发育及胴体性状,并且其选择潜力较大,可为今后兰州大尾羊育种提供重要的基础。11参考文献1 Swanton E M,Saggerson E D.Glycerolipid metabolizing enzymes in rat ventricle and in cardiac myocytes J.Biochimicaet biophysica acta,1997,1346(1):93-102.2Smith S J,Cases S,Jensen D R,et al.Obesity resistance and multiple mechanisms of triglyceride synthesis in mice lacking Dgat J.Nature Genetics,2000,25(1):87-90.3Chen H C,Smith S J,Ladha Z,et al.Increased insulin and leptin sensitivity in mice lacking acyl CoA: diacylglycerol acyltransferase1 J.The Journal of Clinical Investigation,2002,109(8):1049-1055.4Steven J Y,Claire C,Jacqueline ODowd,et al.Improved glucose tolerance in acyl CoA: diacylglycerol acyltransferase 1 null mice is dependent on diet J.Lipids in Health and Disease,2007,6(1):2.5Bagnata C,Igal R A.Overexpression of diacylglycerol acyltransferase 1 reduces phospholipid synthesis,proliferation,and invasiveness in simian virus 40-transformed human lung fibroblasts J. The Journal of Biological Chemistry, 2003, 278(52):52203-52211.6Grisart B,Coppieters W,Farnir F,et al.Positional candidatecloning of a QTL in dairy cattle:identification of a missense mutation in the bovineDGAT1 gene with major effect on milk yield and composition J.Genome Research,2002,12(2):222-231.7Thaller G,Kramer W,Winter A,et al.Effects of DGAT1 vari-ants on milk production traits in German cattle breedsJ.Journal of Animal cience,2003,81(8):1911-1918.8Grisart B,Farnir F,Karim L,et al.Genetic and functional confirmation of the causality of theDGAT1 K232A quantitativetrait nucleotide in affecting milk yield and compositionJ.Proceedings of the National Academy of Sciences of the UnitedStates of America,2004,101(8):2398-2403.9Madhu S T,Ramesh K V,Bishnu P M,et al.DGAT1 and ABCG2 polymorphism in Indian cattle (Bos indicus) and buffalo (Bubalus bubalis) breeds J. BMC Veterinary Research,2006,2(1):32.10 宝生物工程(大连)有限公司 商品目录 2007-2008 T-211余刚，罗军等 陕北白绒山羊 DGAT1基因外显子14多态性及其与部分生长河胴体性状的关系 西北农林科技大学学报（自然科学版） 2008年5月 第五期 P512张维铭 主编现代分子生物学实验手册 科学出版社 2004年2约P82-P98附 录A1.绵羊DGAT1基因部分片段序列gi|158749585|ref|NM_001110164.1| Ovis aries diacylglycerol O-acyltransferase homolog 1 (DGAT1), mRNAATGGGCGACCGCGGCGGCGCGGGCGGCTCCCGGCGCCGGAGGACAGGGTCGCGGCCTTCGATCCAGGGCGGCAGTAGGCCAGCGGCAGCGGAAGAGGAGGTGCGGGATGTGGGCGCCGGAGGGGACGCGCCGGTCCGGGACACAGACAAGGACGGAGACGTAGACGTGGGCAGCGGCCACTGGGACCTGAGGTGTCACCGCCTGCAGGACTCCCTGTTCAGTTCTGACAGTGGCTTCAGCAACTACCGCGGCATCCTGAATTGGTGTGTGGTGATGCTGATCTTAAGCAACGCACGGTTATTTCTAGAGAACCTCATCAAGTACGGCATCCTGGTGGACCCCATCCAGGTGGTGTCTCTGTTCCTGAAGGACCCCTACAGCTGGCCAGCTCTGTGCCTGGTCATTGTGGCCAATATTTTTGCTGTGGCTGCGTTCCAGGTGGAGAAGCGCCTGGCCGTGGGAGCCCTGACGGAGCAGGCGGGGCTGCTGCTGCACGGGGTCAACCTGGCCACCATTCTCTGCTTCCCAGCGGCCGTGGCCTTCCTCCTAGAGTCCATCACTCCAGTGGGTTCCGTGCTGGCCCTGATGGTCTACACCATCCTCTTCCTCAAGCTGTTT