毕业论文--灰霉菌糖异生限速酶PEPCK基因的敲除突变体的回补.doc

中文摘要灰霉菌(Botrytis cinerea)通常又称作灰葡萄孢菌，属于子囊菌门（Ascomycota)真菌，是植物灰霉病的病原菌，可侵染500多种植物。在果蔬生产中，灰霉病已成为主要病害，每年造成巨大的经济损失。PEPCK(Phosphoenolpyruvate carboxykinase)是磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶，催化草酰乙酸生成磷酸烯醇式丙酮酸，是糖异生途径的第二个限速酶。为了进一步阐释灰霉菌PEPCK基因（BcPCK）在灰霉病菌生长发育和致病过程的调控作用，本研究通过构建BcPCK基因缺失突变体的回补载体，利用农杆菌介导的同源重组方法，得到BcPCK基因缺失突变体的回补转化子（D BcPck-C），并在此基础上验证BcPCK基因对致病性的作用。通过表性分析发现，与敲除突变体相比，回补菌株DBcPck-C的致病力有所恢复，并且基本不影响菌丝生长。本研究结果验证，灰霉菌DBcPCK基因在灰霉菌致病过程中发挥重要的调控作用。关键词：灰霉菌；磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PEPCK）; 基因敲除；生长发育；致病性Abstract Plant gray mold fungus Botrytis cinerea, belongs to Ascomycota fungi, can infect over 500 plant species. In the production of fruits and vegetables, gray mold has become a main disease, and annually causes enormous economic losses. Phosphoenolpyruvate carboxykinase (PEPCK) is the second rate-limiting enzyme for gluconeogenesis, which catalyzes the formation of phosphoenolpyruvate by oxaloacetate. To further illustrate the regulation of PEPCK gene in the growth and pathogenesis of B. cinerea, we generated a complementary vector carrying a full length of BcPEPCK CDS and obtained the complemented strain (Bcpck-C) of the BcPEPCK gene knockout (KO) mutant (Bcpck) by using Agrobacterium tumefaciens-mediated homologous recombination method. The complemented strain was used to verify the role of BcPEPCK gene in the pathogen virulence. The phenotypic analysis result showed that the pathogenicity of the complemented strain Bcpck-C was recovered when compared to the BcPEPCK gene knockout mutant. Our results also demonstrated that mycelial growth of the BcPEPCK gene KO mutant was unaffected. Our findings indicate the BcPEPCK gene plays an important role in the pathogenesis of B. cinerea.Key words：Botrytis cinerea，PEPCK，gene knockout, gene complementation, pathogenicity目录前言.1第1节 灰霉病及其危害.1第2节 灰霉菌.1第3节 糖异生与糖异生限速酶PEPCK.2第4节 本研究的目的与意义.3第一章 材料与方法.4第1节 实验材料.4第2节 实验方法.6第二章 结果与分析.11第1节 构建Bcpck-C载体.11第2节 获得Bcpck-C菌株.17第3节 Bcpck-C菌株致病性检测.18第三章 结论与讨论.21致谢.22参考文献.23前言第1节 灰霉病及其危害由灰霉菌侵染引起的植物灰霉病是一种真菌性病害，是果蔬花卉生产中常见且较难防治的全球性病害。灰霉菌的寄主广泛，可侵染黄瓜、番茄、菜豆、葡萄、茄子、杨桃、草莓等200多种不同的寄主植物1。其危害时间长，从寄主植物的苗期到果实成熟的生长过程中均有可能被灰霉菌侵染，叶、茎、花、果均可发病2-3。叶片从叶尖开始发病，呈“V”形病斑沿叶脉向内扩展，病斑内呈灰褐色，与健康组织交界分明。染病苗株整株色浅，叶片组织软化，呈水渍状，幼茎于叶柄交界处变软缢缩，最后病苗干枯死亡。果实染病，多青果发病，由花瓣或残留柱头先被侵染，后扩展至果实。果皮表面出现灰白色霉层，腐烂变软4。环境温暖湿润是灰霉病发生和流行的主要条件。在温度为2023，相对湿度达到95%以上的环境中，灰霉病最易发生，其中湿度影响更大，湿度越大，发病越严重5。早春温室中，生长环境温暖湿润，是灰霉病的高发区。连续阴雨或灌溉后，湿度增大也易发病。过度密植，光照不足等不当管理也会增加发病几率。控制温室内的温度、湿度，加强田间管理，发病果实、叶片和花需及时剪除清理，适时进行药剂防治等方法可一定程度防治灰霉病的发病和蔓延。目前生产上主要以化学防治为主，不仅污染环境，大量重复的使用化学农药，还易造成病菌抗药性的产生6，农产品农药残留超标7。因此采取优先预防，综合治理的防治措施，才能发挥良好作用8。第2节 灰霉菌1.1 灰霉菌生物学分类灰霉菌(Botrytis cinerea)又称灰葡萄孢，是葡萄孢属真菌的一个复合种，也是葡萄孢属中最大的类群。其无性阶段属于半知菌亚门类（Deuteromycotina），丝孢纲(Hyphomyeetes)、丝孢目(Myphomycetales)、淡色孢科(Moniliaceae)。有性型(Teleomorph)的种类,属于子囊菌亚门(Ascomycotina)、盘菌纲(Discomycetes)、柔膜菌目(Heletiales)、核盘菌科(Selerotiniaeeae)、葡萄孢盘菌属(Botryotinia) 9-10。1.2灰霉菌的侵染循环灰霉菌是一种典型的死体营养型的植物病原真菌，自然条件下，灰霉菌多以分生孢子作为侵染寄主的初侵染和再侵染来源11。为了抵御不良环境，如严冬、炎夏，灰霉菌通常会以菌丝体、分生孢子或菌核的形式，附着于植物病残体或在土壤覆盖下，等环境适宜或到下一生长季，菌核萌发、孢子萌发，侵染植物，形成初侵染。当条件适宜，菌核即萌发产生菌丝体和分生孢子梗，和大量分生孢子12。成熟的分生孢子借助风、雨水、灌概水和农事操作等途径进行传播。在高湿低温条件下，分生孢子萌发形成芽管，大多从衰败的花器、伤口以及坏死组织侵染植物宿主。受害的植株病部将产生大量的分生孢子，再侵染时成为主要来源，引发更严重的病情和大量流行，造成更大的危害13。花期是灰霉病菌侵染的高峰期。部分情况下，侵入寄主的菌体潜伏在发育的果实或被侵染的花朵中，无症状表现，遇到条件适当则发病，造成危害14。第3节 糖异生与糖异生限速酶PEPCK糖异生又称为葡糖异生。是指由简单的非糖前体（乳酸、甘油、生糖氨基酸等）转变为糖（葡萄糖或糖原）的过程15。糖异生并非是糖酵解过程的简单逆转。糖异生途径由丙酮酸转化为草酰乙酸开始，形成葡萄糖为止。在糖酵解过程中有三个不可逆反应，糖异生途径利用不同于糖酵解过程的四步反应绕过这三个不可逆反应。糖异生途径中共有有四个限速酶，一丙酮酸羧化酶，二磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶，三果糖-1，6-二磷酸酶，四葡萄糖-6-磷酸酶。PEPCK(phosphoenolpyruvate carboxykinase)是该过程中的第二个限速酶，催化草酰乙酸生成磷酸烯醇式丙酮酸。通常情况下，PEPCK有存在于动物体内和存在于植物、微生物中两种形式。动物体内的PEPCK,此种形式的PEPCK将GTP作为反应底物,相对分子质量大小为70000，如昆虫、哺乳动物和鸟类体内16-17;另一种形式的PEPCK，蛋白质分子序列与动物中的不同。并且将ATP作为反应底物，如存在于植物、细菌、酵母和藻类中的PEPCK 18。目前已有大量文献报道了该基因在植物、动物、发酵微生物以及人的功能和作用，目前该基因在病原菌中没有任何报道。灰霉菌PEPCK基因DNA序列由2644个核苷酸组成，其中包含4个外显子，分别位于SEQ ID No:1的5端第1位至277位核苷酸之间，第327位至844位核苷酸之间，第895位至1446位核苷酸之间，第1891位至2226位核苷酸之间，组成的编码区长度合计为1683个核苷酸。所编码的蛋白质由序列由560个氨基酸组成。第4节 本研究的目的与意义目前已有大量文献报道了PEPCK基因在植物、动物、发酵微生物以及人的功能和作用，但在病原菌中尚没有任何报道，等待着进一步的探索和研究。2005年在微生物学著名杂志JOURNAL OF BACTERIOLOGY报道了通过敲除磷酸烯醇式丙酮酸合成酶基因（ppsA）验证在植物致病细菌野油菜黄单胞菌糖异生的作用，并且证明其对致病性是非常重要的。最近在微生物权威杂志Molecular Microbiolog上报道的致病细菌中有关于糖异生的限速酶的研究值得我们学习和参考，但是植物病原菌中尚未有任何报道，同时植物病原菌与细菌又有诸多不同之处，需要去探索。本研究通过构建回补载体，并获得灰霉菌PEPCK基因的缺失突变体的互补菌株，深入研究PEPCK基因在灰霉病菌生长发育和侵染植物过程中的作用。研究结果表明，该基因参与调控了灰霉病菌孢子萌发、孢子产量及致病过程。新致病基因的发掘与鉴定具有重要的科学及实践意义，研究结果不仅有助于增进我们对灰霉病菌侵染机制的认识，加深我们对植物与病原物互作基本理论的认识，同时还可为新型、高效农药的开发提供候选分子靶标，有利于鉴定潜在的防治靶标，用于筛选新型杀真菌药剂。因此，本研究具有重要的科学意义和实践意义。第一章材料与方法第一节 实验材料1.1.1 供试菌株和载体 灰霉菌野生型菌株：B05.10，灰霉菌PEPCK基因敲除突变体：Bcpck，农杆菌菌株：AGL-1，大肠杆菌菌株：DH5，PXE：用于构建BcPCK互补载体PXEB：双酶切获得BA片段，用于构建BcPCK互补载体。1.1.2 接种材料 无染病的成熟离体番茄叶片。1.1.3仪器与设备Finnpipette移液器、AIRTHEC超净工作台、AIRTECH生物安全柜、-80超低温冰箱、Thermo离心机、BIOER PCR扩增仪、凝胶成像仪、电泳仪、水浴锅、CRYSTAL恒温振荡培养箱、电热恒温培养箱、压力蒸汽灭菌锅等。1.1.4药品与试剂PCR相关试剂、限制性内切酶及DNA聚合酶、重组酶、草铵膦、头孢氨苄、胶回收试剂盒、常用培养基成分等。1.1.5主要培养基配制1.1.5.1 PDA培养基：用于培养和保存灰霉菌表1-1制备时，马铃薯削皮切片，1cm左右厚度，于适量水中熬煮，达到熟而不烂的程度为好。用至少四层纱布过滤马铃薯汤水于烧杯中，过滤后马铃薯固体丢弃。烧杯放置于磁力搅拌器上搅拌，再加入葡萄糖，琼脂，充分混匀后，倒入合适烧瓶中，封盖，高压蒸汽灭菌锅灭菌，121，20min。灭菌后，自然降温至不烫手，于无菌操作台中进行倒平板。平板凝固后封装保存待用。1.1.5.2 LB培养基：用于培养和保存大肠杆菌DH5和农杆菌AGL-1表1-2琼脂粉最后加入，于磁力搅拌器上充分混匀后，装入合适烧瓶中，封盖，高压蒸汽灭菌锅121灭菌20min。灭菌后，自然降温至不烫手，于无菌操作台中进行倒平板。平板凝固后封装保存待用。1.1.5.3 MM培养基：用于共培养前培养农杆菌AGL-1表1-3除葡萄糖外，其他成分，溶于ddH2O，充分混匀，调PH至7.0，高压蒸汽灭菌锅113灭菌40min。灭菌后，取出自然降温至不烫手。于无菌操作台中，加入过滤除菌的葡萄糖溶液，混匀后到平板。凝固后封装保存待用。1.1.5.4 IM培养基：用于农杆菌AGL-1和灰霉病菌分生孢子的共培养 除葡萄糖外，剩余成分溶解于ddH2O中，充分混匀，装入烧瓶，高压蒸汽灭菌锅113灭菌40min，取出自然降温至不烫手，在无菌操作台中加入葡萄糖溶液。葡萄糖溶于水，过滤除菌，长时间高温灭菌会造成变质。（表1-4）1.1.5.5 DCM培养基：用于筛选和培养回补突变体配制时，先加适量ddH2O于烧杯中，不宜过多。烧杯置于磁力搅拌器上边搅拌，边加入YNB（无氨基酸酵母氮源）、天冬酰胺、硝酸铵、葡萄糖，充分溶解，最后加入琼脂。于酸度计上用Na2HPO4调溶液pH至6.0，装入适宜烧瓶中，封盖，高压蒸汽灭菌锅121灭菌15min。（表1-5）表1-4表1-5第二节 实验方法1.2.1质粒提取流程1） 用移液器取适量菌液（不超过3 ml）于1.5ml EP管中，离心30s，转速12000rpm，弃上清液。2） 加250ul裂解液I于菌体沉淀中，用涡旋仪悬浮菌体。3） 再加250ul裂解液II（0.2N NaOH：1%SDS=1：1混合，现配现用），缓慢上下颠倒5次，室温静置。4） 片刻后，菌液清亮，加入溶液III 350ul，翻转混匀15次，离心10min，转速12500rpm。5） 取上清液1.5 ul左右，加入氯仿:异戊醇（24:1）1.5 ul，翻转混匀30次，离心6min，转速11000rpm。6） 取上清液，加入两倍体积预冷无水乙醇，混匀后室温放置2min，离心10min，转速12500rpm。7） 倾倒EP管，弃上清，向沉淀中加入1ml 预冷的70%乙醇，离心5min，转速12500rpm。8） 倾倒EP管，弃上清液，室温下干燥后（不要太干），溶解于50ul ddH2O（含2050ug/mlRNAase）中， 放置于37恒温箱，30min后取出，于-20冰箱中保存备用。1.2.2PCR流程反应程序：step1： 94，2minstep2： 94，30s 退火温度，30s 30个循环 72（根据产物大小决定），1minstep3： 72，8minstep4： 4，10min反应结束后将PCR产物放到4冰箱待用。1.2.3酶切流程按照酶切体系，混合各种试剂，将体系置于酶的最适温度（若为双酶切，则根据两种限制性内切酶确定）下（一般是37，查看说明书）酶切23h。酶切产物若需要乙醇沉淀回收，需放至65水浴锅中水浴15-20min，使体系中限制性内切酶完全失活；酶切产物若需要电泳回收，需向其中加入2ul 10loading buffer终止酶切反应。1.2.4乙醇沉淀回收DNA片段流程1）酶切体系65水浴15-20min，终止酶切反应，加入ddH2O，使体系体积至100ul。2）加10ul 3M NaAc（pH=5.2）。3）加250l无水乙醇，翻转10次，充分混匀。4）冰浴15min。5）12500rpm，离心10min，弃上清液。6） 顺管壁小心加入800L 70%乙醇，12500rpm，离心5min，弃上清液。7）空甩（离心机转数达到4000 rpm即可停止），用移液器吸出残余液体，风干（注意湿度，不宜太干）。回收产物溶于适量 ddH2O中。1.2.5凝胶电泳回收DNA片段流程1） 取电泳后的琼脂糖凝胶，切取含目的片段的胶块，称重。2） 加入胶块重量4倍体积的buffer,置于50水浴中，水浴5min，完全溶解胶块。3） 将溶胶液缓慢移入吸附柱中，8000g离心1min，倒掉收集管中液体。4） 加入500ul Wash Solution,9000g离心1min，倒掉收集管中液体。5） 重复步骤4。6） 空吸附柱9000g离心1min；7） 将吸附柱放入新1.5ml EP管中，向吸附膜中央加入20ul ddH2O（注意不要碰到吸附膜）。室温静置5min，离心2min，弃吸附柱。目的片段溶液置于-20保存备用。1.2.6大肠杆菌DH5转化（热击法）1） 准备冰盒，感受态保存于-80冰箱中，取出冰上融化。2） 放置35min，加入重组产物10 ul，移液枪轻轻吹打混匀，冰浴30min。3） 冰浴结束立刻取出放入42水浴锅中，计时90s后取出。4） 再次冰浴2min，用移液枪缓慢加入LB液体培养基700 ul，轻轻吹打混匀，置于震荡培养箱中，37培养45min，复苏菌体。5） 10000rpm，离心1min。紫外灭菌后的生物安全柜中操作，弃上清液（正常倾倒1次即可，EP管中会有少量残留液体），重悬，轻柔涂板（含有相应抗生素），37培养箱中，倒置培养。1.2.7 农杆菌AGL-1转化（电击法） 准备工作：冰盒，1mm电击杯用无水乙醇冲洗并吹干、放置于-20预冷10min，无菌工作台中备LB培养基（1ml液体培养基预冷，含草甘膦LB固体培养基平板），感受态细胞冰上融化5min。1） 向感受态细胞中加入2ul待转化的质粒DNA，用移液枪轻轻吹打混匀。2） 体系移至电击杯中，电击仪电压设置为1.8kv，进行电击。3） 电击后，立即向电击杯中加入1ml LB液体培养基，轻轻吹打几次混匀，转移体系至新EP管中，28震荡培养2h。4） 复苏后，菌体离心1min，转速10000rpm。5） （生物安全柜中操作），快速倾倒EP管1次，倒掉适量上清，管中剩余少量上清液，重悬菌体，涂布至含质粒对应抗生素的LB平板上，置于28恒温培养箱中，倒置培养。1.2.8农杆菌与灰霉菌分生孢子的共培养1.2.8.1农杆菌摇菌诱导载体转入农杆菌，验证正确的农杆菌菌株，经摇菌活化，准备诱导。装有农杆菌菌液的50ml离心管，4000rpm离心5min，弃上清收集菌体，用5ml IM吸打重悬。后加入2ul AS（100ug/ml）进行诱导，混合均匀，28震荡培养6h。1.2.8.2获得灰霉菌分生孢子1）保存的灰霉菌菌株（本实验中为敲除突变体Bcpck）于PDA固体培养基上活化，培养三天，挑取菌落外缘菌丝，接种至含潮霉素的PDA平板上，置于黑暗下，25培养，至灰霉菌菌丝生长到培养皿边缘处，将平板转移至20培养箱中，黑暗培养3-5天，至产生分生孢子。2）产孢后，用适量IM液体培养基清洗平板，视产孢情况刮取平板面积，手机灰霉菌分生孢子。视孢子溶液浓度1次或多次过滤，除去菌液中的菌丝。3）吸取10 ul孢子溶液，点在血球计数板上，在显微镜下记数定量，视溶液中孢子浓度情况稀释或浓缩溶液，使孢子溶液终浓度达到106个/ml。1.2.8.3共培养 1）诱导后农杆菌菌液和分生孢子液以1:1体积比混合均匀。2）取混合液200ul，轻柔地涂布于贴有微孔玻璃膜的IM平板表面，28培养2d。3）培养后平板取出，生物安全柜中，镊子喷酒精后在酒精灯外焰灼烧，灭菌后冷却片刻，从平板边缘夹取微孔玻璃膜，翻转，生长混合菌体的一面向下贴于含抗性（头孢、链霉素、草甘膦）PDA平板上二筛。28，黑暗培养48h。1.2.8.4转化子筛选生物安全柜中操作，小心揭膜，尽量不要使玻璃膜在平板上滑动。封口，平板放回28培养箱黑暗培养，直至有菌落长出。1.2.9定量PCR(试剂盒购自TaKaRa)1.2.9.1 除基因组DNA 冰上操作。表1-6试剂用量5gDNA Eraser Buffer2.0LgDNA Eraser1.0LTotal RNA1.0LRNase Free dH2OUp to 10L1.2.9.2反转录(SYBR Green qPCR 法) 冰上操作。表1-7试剂用量1.2.10.1中反应液10.0LPrimeScript RT Enzyme Mix 11.0LRT Primer Mix1.0L5PrimeScript Buffer 24.0LRNase Free dH2O4.0LTotal20L1.2.9.1RT PCR1）冰上操作，各试剂混合均匀后，再分装到PCR小管中，为了使分装后试剂量准确，可先按照多于体系1或2管的量配置。表1-8试剂用量终浓度SYBR Premix Ex Taq（Tli RNaseH Plus）（2）12.5L1PCR Forward Primer （10M）1.0L0.4MPCR Reverse Primer （10M）1.0L0.4MRT 反应液（cDNA溶液）2.0LdH2O(灭菌蒸馏水)8.5LTotal25L2)反应程序：step1：预变性 95，30s ，repeat：1step2：PCR反应 95，5s 60，3060s，repeat：40 step3：Dissociation第二章 结果与分析第一节构建Bcpck-C载体 2.1.1获得BcPCK基因：（目的片段：4672bp）2.1.1.1PCR扩增设计引物：正向引物:AAAGATCAAAGGATCgaattcCAATGTCCCGCTAAATGTCA（Tm：56.8；距基因 1351bp） 反向引物：CCGGGTACCGAGCTCgaattcCCGATTGCTAGACTGGTGG（Tm：56.1；距基因 677bp）DNA模版：野生型灰霉菌菌株B05.10DNA聚合酶：Q5超保真DNA聚合酶表1-9试剂用量ddH2O7.3L21.5L5Q5 Buffer4L10LdNTP1.6L4L正向引物1L2.5L反向引物1L2.5LDNA模板1L2L5Q5 High GC enhance4L10LQ5 enzyme0.1L0.5LTotal20L50L2.1.1.2PCR产物电泳验证采用琼脂糖凝胶电泳，注意制备凝胶时，三角瓶于微波炉中加热，需加热至琼脂糖完全溶解，加热过程中，时刻注意溶液沸腾状况，多次取出摇晃，使溶液均匀，避免溶液暴沸溢出。冷却至65左右倒胶，选取合适的梳子，待胶体凝固好，拔出梳子，放入水平电泳槽内，电泳缓冲液至少没过胶面1mm，准备点样。向PCR小管中按DNA样品与加样缓冲液4：1的比例，加入加样缓冲液，混合均匀，取适量加样于点样孔中，同时点1kbDNA Marker标准样品。打开电泳仪，设置时间、电压。结束后取出胶块放入EB溶液中染色15min后，注意不要裸手操作，EB具有一定致癌性。染色结束在紫外灯下观察。荧光条带即为DNA条带。（图1-1）图1-12.1.1.3胶回收目的片段所用凝胶回收试剂盒购自上海生工生物公司。操作前准备工作：检查试剂盒中Wash Solution中是否加入乙醇，Buffer B2中是否出现沉淀，设置水浴锅50。按照试剂盒说明书操作，回收后吸取1ul进行电泳，验证回收结果。（图1-2）图1-22.1.2PXEBA载体线性化2.1.2.1酶切载体 质粒：PXEBA载体；酶：EcoR I。酶切反应体系中，buffer要查阅说明书根据所用限制性酶切酶选择最适buffer。放置于37中，反应2h，充分酶切。表1-10试剂用量1H Buffer1LEcoR I0.6L质粒2LddH2O6.4L2.1.2.2乙醇回收酶切产物 水浴锅提前设置65，准备冰盒。 酶切反应结束后，产物于65水浴处理20min，使内切酶完全失活。回收的DNA产物溶于适量ddH2O中，电泳验证，保存待用。（图1-3）（图1-3）2.1.3DNA定量采用琼脂糖凝胶电泳比较法，通过比较待测样品与DNA标准品的荧光强度，确定待测DNA样品浓度。DNA标准品设置梯度为：（ng）30、60、90、120、150。DNA样品各取2l，用时点1kbDNA Marker标准样品对照。（图1-4）图1-42.1.4重组转化 重组前准备工作：水浴锅设置37，准备冰浴。 获得插入片段和线性化克隆载体后，根据DNA定量确定体系中的剂量，每个片段最适使用量X=0.02DNA片段碱基对数ng。表1-11试剂用量ddH2O8.5LPXEBA4LPEPCKB1.5L5CE Mutis Buffer4LExnase Mutis2LTotal20L配置好的体系，轻柔地混合均匀。立刻置于37水浴锅中。水浴30min后，立即取出，再放入冰水浴中，冰浴5min。重组产物保存于-20，或者直接进行转化。转化前准备工作：LB培养基（液体培养基700L，含草甘膦固体培养基平板1个），生物安全柜紫外灭菌，冰盒，水浴锅设置42，大肠杆菌热击感受态冰上融化3min。 注意在冰上操作，配置转化体系，热击冷击控制时间。冷击后菌液震荡培养，充分复苏。于生物安全柜中涂板，玻璃棒喷酒精在酒精灯外焰灼烧灭菌，稍等片刻待玻璃棒冷却后在进行涂布，避免高温危害菌体，影响实验结果。平板37倒置培养。2.1.5菌落PCR验证转化平板隔夜培养后，进行菌落PCR验证。设计引物：目的基因选取插入基因内部1440-2249位，810bp 正向引物（POC-U3 )：CCGAGGGTATGACTTCAGGTA反向引物 (POC-D3 )：TTGTGGTGCTCAATCTTCTCA于无菌操作台内，用灭菌后牙签挑取长出的单菌落，在PCR小管中轻沾。并保存，标号记录。PCR后产物进行电泳，根据电泳结果，确定转化是否成功。若出现目标条带，则转化成功，若无目标条带，则转化不成功。（图1-5）表1-12试剂用量ddH2O15.4LBuffer2LdNTP0.8LDMSO0.8LPOC-U30.4LPOC-D30.4LTaq enzyme0.2LTotal20L图1-52.1.6摇菌扩增并酶切验证选取电泳条带正确的菌落，从上一步骤的菌株保存平板上挑取菌体进行摇菌，LB液体培养基（添加草甘膦），37，220rpm摇菌16h。注意在无菌操作台中操作，灭菌枪头沾取菌体，直接放入摇菌管中，摇菌管中培养基不超过其容量的1/3。16h后选取微浑浊半透明菌液提取质粒。所得质粒酶切验证，用EcoR酶切（图1-6），将得到9000bp、3800bp、662bp、170bp四种长度的片段，只有9000bp条带的质粒为空载体。（图1-7）图1-7图1-62.1.7 测序 酶切产物回收，取验证正确的8号送公司测序。（图1-8）图1-8第二节获得Bcpck-C菌株2.2.1 载体转入农杆菌通过电击转化法，将回补载体转入农杆菌AGL-1感受态细胞中，复苏后的菌液离心，在超净工作台中倒掉部分上清液，保留约200L，用手弹EP管，使沉淀菌体重新悬浮起来，均匀涂布于含草甘膦的LB培养基上。置于28培养箱中，倒置培养。注意涂布平板时，玻璃棒于酒精灯上着稍后，冷却一段时间，避免过烫杀死菌株。2.2.2 菌落PCR验证通过菌落PCR验证载体是否转入农杆菌，若电泳结果有条带，则转入，若无条带，则未转入。同时保存1份，标号注明。引物：810bp正向引物（POC-U3 )：CCGAGGGTATGACTTCAGGTA反向引物 (POC-D3 )：TTGTGGTGCTCAATCTTCTCA采用2.1.5菌落PCR体系即可。PCR产物进行电泳，于紫外灯下观察荧光条带。（图1-9）图1-92.2.3 共培养得转化子 准备工作：敲除突变体菌株Bcpck，MM液体培养基（含有利福平、卡那霉素和氨苄霉素），PDA培养基（含草甘膦），IM培养基（液体培养基、铺有玻璃纸的固体培养基平板），DCM培养基（含草甘膦）。 取验证正确的农杆菌进行诱导。获得敲除突变体菌株的分生孢子，定量至浓度为106个/ml。二者按照1：1比例混合，共培养。转膜后，挑取单菌落（切记挑取单菌落，混合菌落可能造成杂合）。获得转化子。2.2.3 半定量PCR验证 普通PCR中，基因组DNA的存在对实验结果造成影响。半定量PCR通过反转录，得到cDNA，只有cDNA作为反应模板，能够准确的进行基因表达量分析。准备：试剂盒保存于-20，水浴锅（37、42、85），EP管（0.2ml、1.5ml）2.2.3.1除基因组DNA 配置反应液时，先按照多于反应数量2的量配置，混匀再分装至小反应管中，以保证配置的准确性。最后加入RNA样品。体系置于42水浴锅，2min。反应后可直接进行下一步实验，或保存于4。2.2.3.2反转录同样先按反映数+2的量配置体系，混匀分装。取除基因组DNA的反应液后，先加入先加入 RNase Free dH2O和5PrimeScript Buffer 2混合均匀，以使 gDNA Eraser 的活性充分受到抑制，再添加 RT Primer Mix、PrimeScript RT Enzyme Mix I。体系混合后立即进行反转录，体系置于37水浴15min，在置于855s。反应完成后可直接进行下一步实验，需长期保存可置于-20。2.2.3.2 RT PCR按照体系配置反应液，PCR产物进行电泳验证。（图1-10）图1-10第三节Bcpck-C菌株致病性检测2.3.1 分生孢子液接种检测 取番茄叶片，分生孢子液（105个/ml）5l接种。设置野生型对照、敲除突变体对照。接种盆内喷洒蒸馏水，塑料薄膜封闭，保持一定湿度，黑暗培养72h拍照观察。结果显示Bcpck-C突变体菌株接种点产生明显病斑，接近野生型菌株发病情况，成功侵染寄主植物，敲除突变体Bcpck的致病性几乎丧失侵染能力，接种点附近有小而不明显病斑，无扩展。（图1-11）图1-11 多次测量，取平均值，绘制病斑相对大小柱状分析图。（图1-12）图1-122.3.2菌块生长速率检测 取B05.10、DBcpck、DBcpck-C菌饼（0.5cm）接种于PDA平板，培养1d、2d、3d拍照记录，观察菌丝生长速率。（图1-13）图1-13多次测量菌丝生长半径，取平均值，绘制柱状分析图。（图1-14）图1-14第三章 结论与讨论本研究通过构建BcPCK基因缺失突变体的回补载体，利用农杆菌介导的同源重组方法，得到DBcpck-C菌株，进一步验证PEPCK基因灰霉菌致病过程中发挥作用。经过半定量PCR,证明回补菌株的PEPCK基因在一定程度上恢复表达。接种实验结果显示，相较于敲除突变体，回补突变体致病力恢复，接近野生型。说明PEPCK基因在灰霉菌致病过程中发挥重要作用。菌丝生长情况，敲除突变体与回补突变体相较于野生型，并无明显差别，说明该基因不影响灰霉菌菌丝的生长。推测该基因在灰霉菌致病过程中，通过影响菌丝生长以外的其他因素，来降低致病性。其具体致病机制有待更加深入的研究。致谢感谢我的导师秦庆明教授，本论文是在导师的精心指导下完成的。导师对治学的严谨态度，对工作的坚持和对理想的执着追求，对待问题独特的见解，都对我产生了巨大的影响,带给我巨大的启发，不论在未来的工作或生活中，都将给我无穷的力量。在论文完成之际，谨向导师表示无比的敬意和衷心的感谢。同时感谢李桂华老师的指导和帮助，李老师对科研的热情给我留下了深刻的印象。在实验过程中，对我和同学们的耐心教导，使我受益匪浅。感谢610实验室的师兄师姐们的帮助。特别感谢龙彬师兄在实验中、生活中对我的帮助和指导，谢谢师兄的耐心、细心，对我犯的错误的包容和鼓励。感谢丁雨涵、常浩武、刘建康等同学在实验过程中的密切合作。感谢父母让我拥有接受优质教育的机会，将我培养成坚强独立的人，使我能够尽量减少遗憾的度过学生生涯。感谢好友特列克，在我脆弱失落的时候陪伴我、沮丧消极的时候鼓励我、懒惰被动的时候督促我，让我顺利地完成这篇论文和将铭记一生的大学四年。感谢吉林大学植物科学学院提供良好的学习和科研环境，感谢各位老师和同学们的帮助和支持！感谢所有遇到的人！参 考 文 献1 Williamson B, Tudzynski B, Tudzynski P, et al. Botrytis cinerea: the cause of grey mould disease J. Molecular Plant Pathology, 2007, 8: 561580.2 Elad Y. Regulators of ethylene biosynthesis or activity as a tool for reducing susceptibility of host plant tissues to infection by B.cinerea. Netherlands Journal of Plant Pathology.1993,99:105113.3 Shtienberg D, Elad Y, Niv A, Nitzani Y, Kirshner B. Significance of leaf infection by B.cinerea in stem rotting of tomatoes grown in non-heated greenhouses. European