（分析化学专业论文）新型微生物传感器的应用研究.pdf

新型微生物传感器的应用研究摘要微生物的检测、鉴定要求涉及到分析化学、生命科学等众多领域，本文充分利用电化学传感器和串联式压电传感器的响应特性，与微生物的新陈代谢特征及微观生命活性相结合，设计了三种微生物传感器，使信息的提取更加准确容易，测定更加快速方便，可用于实时或在位检测。鉴于此开展了以下研究工作：1 提出一种利用多通道串联式压电传感器( m s p q c ) 快速鉴定及计数绿脓杆菌的新方法。绿脓杆菌的鉴定是基于一种新的改良的乙酰胺培养基，这种改良的乙酰胺培养基可以选择性的培养绿脓杆菌，并在m s p q c 上有优良的信号。对绿脓杆菌的计数是基于m s p q c 获得的频率突变时间( f d t ) 与培养基中绿脓杆菌初始浓度的对数值在lo l0 8c f um l 。1 范围内成线性关系。( r 一0 9 8 4 ) 。检测下限为1 0e f um l - l 。2 提出在多通道串联式压电传感器上用间接法检出鉴定沙门氏菌。这基于新生霉素和孔雀绿共同抑制革兰氏阳性菌和除沙门氏菌以外的革兰氏阴性菌的生长，沙门氏菌在m s r v 培养基上生长并释放出c 0 2 ，被k o h 接收液吸收，导致电导变化。m s p q c 间接法能实时监测k o h 接收液电导的变化，电导变化伴随着频移的产生，从而能达到检测和鉴定沙门氏菌的目的。3 提出一种用磷脂酰丝氨酸( p s ) 修饰的叉指电极电化学传感器( p s i d e e c s )检测水泡性口炎病毒( v s v ) 的方法。在本工作中，修饰了p s 的叉指电极用作探头。探头直接与电化学工作站相连。p s 作为受体能吸附v s vg 蛋白，主导v s v 插入p s 膜内，并在膜表面形成孔洞，在恒定电压下，膜两侧产生跨膜电流，从而达到检测目的。关键词：m s p q c 传感器；乙酰胺；绿脓杆菌；沙门氏菌；m s r v 培养基；p s ；v s v ；g 蛋白；p s i d e e c s 传感器；跨膜电流。va b s t r a c tt h ed e t e c t i o na n di d e n t i f i c a t i o no fm i c r o b i o l o g ys h o u l di n v o l v e di nt h ea r e ao fa n a l y t i c a lc h e m i s t r y ，l i f es c i e n c ee n v i r o n m e n t a lm o n i t o r i n ge t e i nt h i st h e s i s ，t h r e ek i n d so fn e wm i c r o b i a ls e n s i n gm e t h o d sw e r ep r e s e n t e db a s eo nt h er e s p o n s eo fe l e c t r o c h e m i c a la n ds p q cs e n s o rt ot h ec h a n g e ，w h i c hr e l a t e dt os o m ec h a r a c t e r i s t i c so fm i c r o b i a lg r o w t ha n dm e t a b o l i s m ，m i c r ol i f ea c t i v i t y t h ed e t e c t i o ni sr a p i d ，s i m p l e ，a n da c c u r a t e t h em a i nw o r ko ft h i st h e s i sc o u l db es u m m a r i z e da sf o l l o w s ：1 an e wm e t h o df o rt h er a p i di d e n t i f i c a t i o na n dq u a n t i f i c a t i o no fp s e u d o m o n a sa e r u g i n o s au s i n gm u l t i c h a n n e ls e r i e sp i e z o e l e c t r i cq u a r t zc r y s t a l ( m s p q c ) w a sp r o p o s e d t h ei d e n t i f i c a t i o no fp a e r u g i n o s aw a sb a s e do nt h ed e v e l o p m e n to fa c e t a m i d eb r o t h ，w h i c hc a ns e l e c t i v ec u l t u r ep a e r u g i n o s aa n dp e r f o r m e dp e r f e c t l yi nm s p q c t h eq u a n t i t a t i v ed e t e c t i o no fp a e r u g i n o s aw a sb a s e do nt h ef a c tt h a tt h ef r e q u e n c yd e t e c t i o nt i m e ( f d t ) d e t e c t e db ym s p q ci nd e v e l o p e dm e d i u mh a dal i n e a rr e l a t i o n s h i pw i t ht h el o g a r i t h mo fi t si n i t i a lc o n c e n t r a t i o ni nt h er a n g e o f10 10 8c o l o n y f o r m i n gu n i t s ( c f u ) m l 一1 ( r - - 0 9 8 4 ) t h ed e t e c t i o nl i m i tw a s10c f um l _ 1 2 an e wm e t h o df o rt h er a p i di d e n t i f i c a t i o no fs a l m o n e l l as p p u s i n gm u l t i c h a n n e ls e r i e sp i e z o e l e c t r i cq u a r t zc r y s t a l ( m s p q c ) w a sp r o p o s e d t h ei d e n t i f i c a t i o no fs a l m o n e l l as p p w a sb a s e do nn o v o b i o c i na n dm a l a c h i t eg r e e nc a ni n h i b i tt h eg r o w t ho fo t h e rb a c t e r i a l ，b u ts a l m o n e l l as p pc a ng r o ww e l li nm s r vb r o t ha n dp r o d u c e dc 0 2 ，c 0 2w a sd i s s o l v e di nk o h d u r i n gt h ep r o c e s so fg r o w i n gs a l m o n e l l as p p ，t h ec o n d u c t i v i t yo ft h em e d i u mc h a n g e da n dw a sa u t o m a t i c a l l ym o n i t o r e db ym s p q c 3 an e wm e t h o df o rd e t e c t i o no fv e s i c u l a rs t o m a t i t i sv i r u s ( v s v ) u s i n ga ni n t e r d i g i t a le l e c t r o d em o d i f i e db yp h o s p h a t i d y l s e r i n ee l e c t r o c h e m i c a ls e n s o r( p s i d e e cs ) w a sp r o p o s e d i nt h i sw o r k ，i n t e r d i g i t a le l e c t r o d ec o a t e d w i t hp h o s p h a t i d y l s e r i n ew a su s e da sp r o b e t h ep r o b ew a sd i r e c t l yc o n n e c t e st oe l e c t r o c h e m i c a lw o r k s t a t i o n p h o s p h a t i d y l s e r i n ea sr e c e p t o rc a na d s o r p tv s vgp r o t e i n ，l e a dv s vi n f u s e di n t op h o s p h a t i d y i s e r i n em e m b r a n e ，a n dh o l e sf o r m e do nt h ep h o s p h a t i d y l s e r i n em e m b r a n es u r f a c e ，i nt h ec o n s t a n tv o l t a g e ，r e s u l t i n gi nt r a n s m e m b r a n ec u r r e n t ，s oa st oa c h i e v et h ep u r p o s eo fd e t e c t i o n v 1 硕_ 学位论文k e y w o r d s ：m s p q c ；a c e t a m i d e ；p s e u d o m o n a sa e r u g i n o s a ；s a l m o n e l l as p p ；m s r vm e d i u m ；p h o s p h a t i d y l s e r i n e ；v e s i c u l a rs t o m a t i t i sv i r u s ；gp r o t e i n ；p s - i d e - e c s ；t r a n s m e m b r a n ec u r r e n t v l l硕十学位论文第1 章绪论2 0 世纪8 0 年代以来，随着生命科学与环境科学的迅猛发展，对分析化学提出了许多亟待解决的新问题。为了适应新情况，解决新问题，需要在多学科交叉的基础上建立新的分析方法。由于生物体系和环境体系的表征和生物过程的监测的需要，促进了生物传感技术的发展和应用。以压电石英晶体为信号转换器的压电化学与生物化学体声波传感技术，与光、电或热等传统传感技术相比，它具有响应谱广、灵敏度高、结构简单、易实现数字化等独特优点i ij 。它是利用以压电材料为基底的体声波器件在厚度剪切模式振荡过程中与周边环境的相互作用，由器件超高频声波的声电阻抗谱、频谱或相位等参量的变化来对环境介质，包括质量、粘弹性、导纳、介电或流变特性、离子溶剂传输等物化性能做出相关应答并转换为响应传感检测信号，从而获取有关目标组分或多元组分体系的成分、性状的一维或多维信息，以求得到对象的全面、动态、实时或在位描述，用于化学、生命科学、生物学、药学、临床医学和环境科学等领域的传感检测。近年来，压电化学与生物体声波传感技术在生物体系和环境体系的分析表征、生物和微生物过程监测表征等方面，显示出了许多优势。结合本论文的研究方向，本章就微生物新陈代谢方面的研究进展，微生物的检测研究，水泡性口炎病毒诊断的研究进展和病毒受体的研究进展做一简述。1 1 微生物的新陈代谢概述1 1 1 新陈代谢理论新陈代谢【2 1 ，简称代谢，广义的代谢是指生命体进行的一切化学反应，是发生在活细胞中的各种分解代谢与合成代谢的总和。其中，分解代谢是指复杂的有机物分子通过分解代谢酶系的催化，产生简单分子、腺苷三磷酸( a t p ) 形式的能量或还原力( 或称还原当量，以【h 】表示) 的作用。一般可分为三个阶段：第一阶段是将蛋白质、多糖及脂类等大分子营养物质降解成氨基酸、单糖及脂肪酸等小分子物质；第二阶段是将第一阶段的分解产物进一步降解成更为简单的乙酰辅酶a 、丙酮酸等中间产物，在此阶段还可以产生一些a t p 、n a d h 及f a d h 2 等；第三阶段是通过三羧酸循环将第二阶段产生的乙酰辅酶a 、丙酮酸等中间产物完全降解生成c 0 2 ，并产生a t p 、n a d h 及f a d h 2 。合成代谢则与分解代谢相反，是指在合成代谢酶系的催化下，由简单小分子、a t p 形式的能量与【h 】形式的还原力一起合成大分子的过程，在这个过程中要消耗能量。合成代谢所利用的小分子物质来源于分解代谢过程中产生的中间产物或新型微生物传感器的应用研究环境中的小分子营养物质。无论是分解代谢还是合成代谢，代谢途径都是由一系列连续的酶促反应构成的，前一步反应的产物往往是后一步反应的底物。细胞通过各种方式有效地调节相关的代谢反应，从而保证整个代谢途径的协调性与完整性，使细胞的生命活动得以正常进行。1 1 2 微生物代谢特异性研究各种细菌具有各自独特的酶系统，因而对底物的分解能力不同，其代谢产物也不同。用细菌生物化学实验方法测定这些代谢产物，可以用于测定细菌，也可用来区别和鉴定细菌的种类。1 1 3 微生物新陈代谢的应用领域1 1 3 1 用生化反应对微生物进行检验生化方法检测病原微生物实际上是测定微生物特异性酶。由于各种微生物所具有的酶系统不完全相同，对许多物质的分解能力亦不一致。因此可利用不同底物产生的不同代谢产物来间接检测该微生物内酶的有无，从而达到检测特定微生物的目的。如沙门氏菌能产生辛酯酶，这一性能是除沙门氏菌外的各属肠杆菌科细菌所不具备的。根据这一特性，甄宏太等f 7 】报道了快速检测沙门氏菌的辛酯酶法。该方法是以4 2 甲基伞形酮辛酯( m u c a p ) 为底物，经沙门氏菌的酶降解后，释放出4 m u ，在紫外灯下观察其发出的蓝色荧光。该方法简便易行，从加入底物到紫外灯下观察到出结果仅需几分钟即可完成，其灵敏度和特异性分别可达9 5 和9 0蚶引。对与h 2 s ( + ) 反应的沙门氏菌该法更为敏感，灵敏度和特异性均接近1 0 0【9 j 。大肠埃希氏菌具p 一葡萄糖醛酸酶，但以0 1 5 7 ：h 7 为代表的肠出血性大肠埃希氏菌( e h e c ) 却不具此酶，故p 一葡萄糖醛酸酶阴性已成为初步筛查e h e c 的重要特征。白色念珠菌具脯氨酸肽酶及n 一已酰d d 半乳糖苷酶，分别以合适的试剂检测，两酶均阳性即为白色念珠菌。1 1 3 2 用于微生物传感器( 1 ) 原材料及代谢产物的测定微生物传感器可用于原材料如糖蜜、乙酸等的测定，代谢产物如头孢霉素、谷氨酸、甲酸、甲烷、醇类、青霉素、乳酸等的测定。测量的原理基本上都是用适合的微生物电极与氧电极组成，利用微生物的同化作用耗氧，通过测量氧电极电流的变化量来测量氧气的减少量，从而达到测量底物浓度的目的。( 2 ) 微生物细胞总数的测定在发酵控制方面，一直需要直接测定细胞数目的简单而连续的方法。人们发现在阳极表面，细菌可以直接被氧化并产生电流。这种电化学系统己应用于细胞硕i 二学位论文数目的测定，其结果与传统的菌斑计数法测细胞数是相同的【l0 1 。( 3 ) 代谢试验的鉴定传统的微生物代谢类型的鉴定都是根据微生物在某种培养基上的生长情况进行的。这些实验方法需要较长的培养时间和专门的技术。微生物对底物的同化作用可以通过其呼吸活性进行测定。用氧电极可以直接测量微生物的呼吸活性。因此，可以用微生物传感器来测定微生物的代谢特征。这个系统已用于微生物的简单鉴定、微生物培养基的选择、微生物酶活性的测定、废水中可被生物降解的物质估计、用于废水处理的微生物选择、活性污泥的同化作用试验、生物降解物的确定、微生物的保存方法选择等1 1 1 1 。1 1 3 3 用于环境监测目前，有研究人员分离了两种新的酵母菌种s p t i 和s p t 2 ，并将其固定在玻璃碳极上以构成微生物传感器用于测量b o d ，其重复性在l o 以内。将该传感器用于测量纸浆厂污水中b o d 的测定，其测量最小值可达2m g l ，所用时间为5 m i n 1 2 】。将荧光素酶导入大肠杆菌( e c o l i ) 中构成的微生物传感器，可以用来检测砷的有毒化合物l l 。目前，有9 种革兰氏阴性细菌从西西伯利亚石油盆地的土壤中分离出来，以酚作为唯一的碳源和能源。它对酚的监测极限为5 x 1 0 一t o o l 。该传感器工作的最适条件为：p h = 7 4 、3 5 0 c ，连续工作时间为3 0 h 1 4 】。还有一种假单胞菌属( p s e u d o m o n a sr a t h o n i s ) $ 0 成的测量表面活性剂浓度的电流型生物传感器，该传感器能在测量结束后很快地恢复敏感元件的活性【l5 1 。还有种专门测量铜离子的电流型微生物传感器。该生物传感器可以在浓度范围7 ( 0 5 2 ) x1 0 。m o l 范围内测定c u s 0 4 溶液。目前已经将各类金属离子诱导启动子转入大肠杆菌中，使得大肠杆菌会在含有各种金属离子的溶液中出现发光反应。根据它发光的强度可以测定重金属离子的浓度，其测量范围可以从纳摩尔到微摩尔，所需时间为6 0 10 0 m i n t l 6 以7 1 。用于测量污水中锌浓度的生物传感器也已经研制成功，其结果令人满意【l 引。估测河口出水流污染情况的海藻传感器对三种主要污染物( 重金属、除草剂、氨基甲酸盐杀虫剂) 的不同浓度进行了测定，均可监测到它们的有毒反应，重复性和再生性都很高【i9 1 。有一种应用p c r 技术的d n a 压电生物传感器，可以测定一种特殊的细菌毒素。这种压电生物传感器可以鉴别样品中是否含有气单胞菌属的特殊基因片段，从而为从水样中检测是否含带有这种病原的各种气单胞菌提供了可能f 2 0 1 。还有一种通道生物传感器可以检测浮游植物和水母等生物体产生的腰鞭毛虫神经毒素等毒性物质，目前已经能够测量在一个浮游生物细胞内含有的极微量的p s p 毒素【2 1 1 。一种固定有表面细胞质粒基因组的生物传感器已经制得，用于测量水中微藻素的含量，它直接的测量范围是( 5 0 1 0 0 0 ) 1 0 西g l t 2 2 1 。一种基于酶的抑制性分析的多重生物传感器3新型微生物传感器的应用研究用于测量毒性物质的设想也已经提出。其性能已经得到测试，效果较好2 3 1 。1 2 新型微生物测定方法人们的生活离不开微生物，在工业、农业、医学、药学等领域，微生物已获得了广泛的应用。不仅如此，微生物在人类科学发展史上，特别是在生命科学的发展上做出了巨大的贡献。因此，发展快速而简单的微生物分析测定方法是十分有意义的。广大的微生物学家、物理学家、化学家及其它学科的科学家们充分利用微生物的光学、电化学，生物化学和物理性质，提出了一系列新型微生物快速测定技术。1 2 1 细胞成分分析法微生物的某些特定细胞成分的含量是相对稳定的，因此可以通过测定这些成分来进行微生物的测定。1 2 1 1 质粒指纹图谱法( p l a s m i df i n g e r p r i n t i n g )该法是用于质粒分析的间接分子生物学技术。包括用琼脂糖凝胶电泳监测细菌的质粒特性和采用限制性内切酶对质粒d n a 作同源性分析。该技术能对社会感染的细菌进行监测和传染源的追踪。国内外许多学者都用质粒d n a 分析方法来进行细菌性感染的流行病学调查和对耐药性细菌的监测。1 2 1 2 核酸探针( n u c l e a ra c i dp r o b e )核酸探针对人体与动物体中致病菌的成功检测，使原来难以人工培养繁殖的细菌、病毒的检测成为可能。它显著优点是特异性强，缺点是检测临床标本的敏感性低，一般标本中含1 1 0 4 c e l l s m l 细菌才能进行杂交阳性反应。特异性强的d n a 探针与敏感性高的p c r 技术相结合己成为研究与临床的一种良好途径【2 4 1 。1 2 1 3 聚合酶联式反应( p c r ) 技术p c r 技术最早于1 9 8 5 年由美国人类基因学会( a s h g ) 年会在d n a 片段扩增工作的研究中得以描述，由此开始在各个相关领域得到了迅速而广泛的研究，现已成为一个世界性的前沿课题。最先利用p c r 技术扩增而出的d n a 序列是人的p 一球蛋白基因【2 5 1 ，并在1 9 8 7 年6 月首次临床应用。该技术可用于生长缓慢或难以培养的病原体的鉴定，其中最成功的是结核杆菌的鉴定【2 6 1 。也可以用于难以鉴定的病原体的诊断。一般是指发酵革兰氏阴性杆菌和厌氧菌。n i e d e r h a u s e r 等【2 7 l 利用p c r 技术检测了食品中的单核细胞增生李斯特氏菌( 三m o m o c y t o g e n e s ) ，只需几个小时的时间即可完成对该菌的检测。此方法十分灵敏，可测定低至1 0e e l l s m l 的微生物。实验证明，p c r 具有灵敏度高、特异性强、硕十学位论文快速等特点。但在临床中存在许多亟待解决的问题。p c r 检测的假阳性和假阴性是影响其应用的关键问题，主要是引物的特异性不高、电泳结果判断有误、标本中存在抑制因子、标本前处理与d n a 提取方法等有关，另外还与试剂质量、操作方法不当有关【2 8 1 。另# - d n a 的检测并不意味着必须使用活细胞，从理论上讲任何可以提供核酸物质的样品都可以进行p c r 扩增，这就是说p c r 技术不能区分活细胞和死细胞【2 9 1 。各种衍生技术如反转录p c r ( r t p c r ) 、多重p c r 3 0 1 、巢式p c r t 3 l 】、p c r 单链构象多态性( p c r s s c p ) 、r f l p 、r a p d 技术、荧光定量p c r 3 2 】等。其中定量p c r 既可以用于临床感染性疾病的诊断，又可用于监测其疗效。而d n a 测序分析可用于病原菌的鉴定和亚型的区分，以及同种病原菌不同菌株的区分。免疫p c r ( i m m u n op o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ，i mp c r ) 是19 9 2 年s a n o 等【3 3 】建立的一种检测微量抗原的高灵敏度技术。该技术把抗原抗体反应的高特异性和聚合酶链反应的高敏感性有机结合起来，它的基本原理是用一段已矢h d n a 分子标记抗体作为探针，用此探针与待测抗原反应，p c r 扩增粘附在抗原抗体复合物上的这段d n a 分子，电泳定性，根据特异性p c r 产物的有无，来判断待测抗原是否存在。目前，国内外报道的免疫p c r 的敏感性一般比现行的e l i s a 法高1 0 2 1 0 5 倍【3 引。由于p c r 产物在抗原量未达到饱和前与抗原抗体复合物的量成正比，因此免疫p c r 还可用于抗原的半定量试验。1 2 1 4 脂及衍生物法磷脂是所有活细胞原生质膜中的主要成分。在细菌的自然群落中，磷酸脂在细菌的生物量中的比例是相对恒定的【3 5 1 ，所以通过测定磷酸脂及其衍生物可以指示活细胞的生物量。1 2 1 5 代谢酶法所有大肠菌含有特异的代谢酶p 一半乳糖苷酶。在自然条件下可以水解吡喃半乳糖底物，水解的产物可被细菌继续利用于生长。实验中采用标记营养物质o n p g( 邻硝基苯p d 吡喃半乳糖) 和m u g ( 4 - 甲基伞形p - d 葡糖苷酸) ，样品中的大肠菌分解相应的标记营养物o n f g ，打开o n p g 的营养部分吡喃半乳糖和指示剂部分邻硝基苯之间的结合键，其中营养部分被菌吸收用于生长，游离的指示剂呈黄色( 结合态无色) 。这种方法灵敏度高可测至1 1 0 之c f u m l 的细菌。1 2 1 6 细胞壁组分测定法细菌细胞壁的肽葡聚糖含有其它有机体不存在的几种组分，因此可作为细菌生物量的指示。革兰氏阳性菌生物膜的测定可以通过磷酸脂被浓氢氟酸的选择性水解，分析胞壁酸来完成【3 6 】。革兰氏阴性菌则可以通过测定脂多糖( l p s ) 组分来5新型微生物传感器的庞用研究测定。1 2 2 生物电化学方法生物电化学方法是指通过电极测定生物量产生或消耗的电荷，从而提供分析信号的方法。基于微生物生长过程中培养基的电化学性质的改变，许多新的生物电化学方法被提出用于微生物的测定。1 2 2 1 阻抗及电导分析法这种方法是最早应用于细菌测定的电化学技术之一。随着细菌的生长代谢，培养基的导电性升高，阻抗下降，用电极测定流经培养基的交流阻抗，可以实现对细菌生长的连续监测。此外，通过阻抗一时间曲线与校正曲线的比较可以估计细菌的存在数目。1 2 2 2 电流分析法电流分析法是在控制恒电位的情况下，通过测定工作电极上的电流来测定微生物的生物量的方法。c a s m i r i 等3 7 1 构建了l 一乳酸氧化酶和l 一乳酸脱氢酶电流型传感器，并用于大肠杆菌生长培养基中的l 一乳酸盐的测定，l 一乳酸盐的量被用作细胞数目的指标。1 2 2 3 电位分析法微生物在生长代谢过程中，0 2 的消耗、c 0 2 的产生和对电活性物质的氧化等现象能够引起电极( 如氧电极、c 0 2 电极和p h 电极等) 电位的改变。本法具有简便、快速和灵敏等特点，但不适用于实时分析。1 2 2 4 循环伏安法及方波极谱法循环伏安法可用于测定酵母和细菌，并可用于区分革兰氏阳性和阴性菌，h a n等【3 8 1 用四环素修饰玻碳电极构建的生物传感器，采用伏安法测定了1 6 个食品和环境中的微生物群落，检测限为2 5 10 4 c e l l s ，测定一个样品仅需3 0 m i n 。方波极谱法利用膜染料测定微生物【39 1 ，通过研究固定于电极表面的染料与细菌发生反应前后的电化学性质，根据阴极峰电流对菌细胞浓度进行直接测定。1 3 水泡性口炎病毒( v e s i c u l a rs t o m a t i t i sv i r u s ，v s ) 诊断的研究进展及时而正确的诊断是预防工作的重要环节，它关系到能否有效地组织预防措施；诊断v s v 常用的方法有很多种，但并非需要全面去做，由于疾病的特点各不相同，常需根据具体情况而定，有时采用其中的一、两种方法就可以及时做出诊断，现将各种诊断方法简介如下。硕十学位论文1 3 1 临床诊断临床诊断是最基本的诊断方法，也是一种简便易行的方法。由于在临床上有很多疾病能引起水泡性病变，如当牛感染牛瘟、口蹄疫、蓝舌病、牛病毒性腹泻、腐蹄病等中的任何一种疾病时，都能出现与v s 相似的症状；当羊出现水泡症状时，可怀疑痘病、羊口疮、v s 及f m d 等；对猪来说，f m d 、s v d 、v e 及v s 在临床上更是难以区别【4 0 1 。因此，有任何可疑的水泡病应该速报有关部门，结合早期的实验室诊断才能进行确诊。1 3 1 1 家畜牛、马、猪感染v s v 后的潜伏期一般为1 7 d ，早期表现为发热、嗜睡、迟钝、食欲减退、流涎多，继而出现5 至数厘米大小白色至灰红色水泡，内部充满黄色液体，通常成群聚集。水泡多见于舌、牙床、鼻唇，也可在乳头、趾间及蹄冠上出现水泡性病灶和腿部的罐状环带；水泡内含有大量的病毒，有病毒血症和全身感染 4 1 i 。由于水泡性口炎而死亡的较少，但常会由于局部继发细菌和真菌感染而导致体重下降、产奶下降和乳腺炎，带来重大经济损失【4 列。7 -成年牛的感染性高于l 岁以内的犊牛，可能犊牛由于母源抗体受感染而不出现临床症状。牛的自然损伤常出现在唇、上颚、舌和齿跟、蹄冠和乳头，主要症状包括；消瘦、粘膜脱落、鼻孔肿胀、鼻孔皮肤脱落，2 一1 0 的奶牛出现乳头损伤，大多数出现趾间及蹄冠损伤，病的早期出现发热，完全康复需要2 3 周【4 3 1 。所有年龄段的马均易感，但易感马不出现病理损伤【4 4 1 。自然感染的马在感染后1 3 d 在唇、上颚和舌的表面出现暗斑和苍白，迅速发展成2 4 c m 的暗红色水泡弥漫在整个舌面、蹄冠、母马的乳房、公马的阴茎包皮，甚至耳部、腹部等。饮食困难导致体重下降、口腔涎液分泌增多、口腔恶臭、磨牙、盆腔出血、呼吸困难。蹄冠肿胀、蹄俞裂开、有渗出液流出，这些症状导致跋行，蹄子残废甚至腐烂【4 5 1 。猪病初出现急性发热，2 4 4 8 h 后口腔( 主要是舌部) 、鼻镜、鼻端、舌、蹄冠部、趾间部的皮肤或粘膜形成水泡，水泡初期呈小丘疹状，不久形成有明显水泡，并相互融合成几毫米至3 0 m m 大小不等的水泡，水泡内充满稍带蓝色的透明液体，l 一2 d 后水泡破裂，形成糜烂、溃疡。食欲减退，磨牙，口流涎。水泡很易破裂，此期非常短，随后表皮脱落留下糜烂和溃疡，体温也在几天内恢复正常。如果水泡在蹄部形成，猪就会表现出跋行，严重者行走困难。在自然感染时，发现蹄部典型水泡是困难的，多数是在溃疡时期才发现。随之蹄冠和趾间发生水泡，不久破裂而形成痂块，蹄冠水泡病灶扩大则可使蹄壳脱落：病程约2 周，转归良好，病灶不留痕迹【4 6 1 。1 3 1 2 人7新型微生物传感器的应用研究人感染i n d i a n a 、n j 、a l a g o a s 、p i r y 和c h a n d i p u r a5 个毒株均可出现临床症状，感染后2 0 3 0 h 发病，病程持续3 6 d 4 7 1 。p a t e r s o n 4 6 1 等发现人感染后首先出现结膜炎，由此推测可能感染开始于结膜，接着出现急性、发热、流感样症状，包括发热、发冷、恶心、呕吐、头疼、眼球疼痛、肌肉疼痛、胸骨疼痛、不适、咽炎、结膜炎和淋巴腺炎症。脑炎很少发生但有时可发生于儿童4 引。水泡病变可以出现于咽、口腔乳膜、或者舌部，或者出现在皮肤接种部位【4 9 1 。1 3 1 3 实验动物感染用v s v 实验接种可以致死乳鼠、鸡胚、大部分豚鼠、苍鼠、雪貂、老鼠和鸡，发病情况与接种的剂量、途径、病毒有关5 0 , 5 1 】。1 3 2 流行病学诊断流行病学诊断是针对患传染病的动物群体，经常与临诊诊断联系在一起的一种诊断方法。虽然某些疫病的临诊症状与v s 的基本一致，但其流行特点和规律确很不一致。例如f m d 、v s 、s v d 、v e 在临诊症状几乎是完全一样的，无法区别，但从流行病学方面却不难区分5 2 1 。1 3 3 病理学诊断v s 发病初期在表皮的马尔皮基氏层的上皮细胞间浆液蓄积，不久相互融合、扩大形成水泡。生发层细胞水肿，上皮细胞坏死，在真皮发生嗜中性白细胞和单核细胞浸润，真皮的炎症达到真皮层呈现不同程度的炎症，有时在皮下也发现细胞浸润等炎性变化。淋巴管和血管充血，血管周围有炎性细胞浸润，大脑神经胶质细胞及大脑和心肌的单核细胞浸润) 。但由于这些病理变化并非是该病所特有的，故病理学诊断对该病并无多大价值。1 3 4 微生物学诊断j运用兽医微生物学的方法进行病原学检查是诊断v s 的重要方法之一，通常会采用下列方法：1 3 4 1 病料的采集样品的采集应来自感染动物的水泡液、未破裂的水泡上皮或新破裂的水泡上皮片、伤口的粘液或者血清，这些样品可以从口腔的损害处采集，除此之外，还可从蹄和产生水泡的其他部位采集；当不能采集上皮组织时，可采集牛的食道咽( o p ) 粘液样品或猪的咽喉拭子；将采集到的样品在实验室进行分离和鉴定5 3 1 。1 3 4 2 应用组织培养分离培养和鉴定由于v s v 能感染多种动物和昆虫，在大多数脊椎动物、鸟类、爬行动物、鱼硕十学位论文类、及昆虫的细胞培养上可以生长。v s v 在感染脊椎动物细胞后，可以很快引起明显的细胞病变，1 8 2 4 h 即可引起细胞快速圆缩、脱落，而感染昆虫细胞则引起持续性感染，无细胞病变。病毒可在7 1 3 日龄鸡胚绒毛尿囊膜上及尿囊内生长，于2 4 2 8 h 内使鸡胚死亡。在猪和豚鼠的肾细胞、鸡胚上皮细胞、牛舌、猪胎、羔羊细胞培养中有致细胞病变作用，并能在牛、猪、恒河猴、豚鼠、及其他动物的原代肾细胞单层培养上形成蚀斑【5 4 5 5 】可用非洲绿猴肾细胞( v e r o ) 、幼仓鼠肾细胞( b h k 2 1 ) 和i b r s 2 细胞培养物作为水泡病的鉴别诊断，v s v 在这三个细胞系中均能产生细胞病变效应( c p e ) ；f m d v 能在b h k 2 1 和i b r s 2 产生c p e ，s v d 只能在i b r s 2 产生c p e 。其他细胞系以及一些动物器官的原代细胞培养物，对v s v 也具有敏感性【4 0 1 。也可以进行8 l o 日龄鸡胚尿囊膜接种、3 周龄小鼠的脑内接种、5 - , , 9 日龄小鼠腹腔内或皮下接种来复制和分离v s v 病毒，接种v s v 后2 9 d ，均可引起死亡【5 4 1 。从培养的细胞中分离病毒的方法很敏感，病毒的浓度过低时也可以检测出，但是较费时，一般需要4 d ，还有一个问题是培养病毒所用的细胞系本身有可能已被该病毒污染了。1 3 4 3 电镜快速检测病毒因不同家族的病毒分类与病毒粒子的形态学有一定的关系，此法结合临诊诊断，对一些具有特征性形态的病原微生物可以迅速做出诊断，如弹状病毒科( v s v ) 、微核糖核酸病毒科( f m d v 和s v d ) 和杯状病毒科( v e v ) ，这些病毒粒子的具有不同形态水泡性口炎病毒糖蛋白截短后在大肠杆菌中的表达和诊断技术的研究特征，可用常用的方法分离到病毒，利用电子显微镜来鉴别这些病毒【5 2 1 。1 3 4 4 动物接种试验对于马和牛，最敏感的途径是舌皮内接种，猪是接种蹄的冠状带或口鼻部。接种后2 4 d ，可在嘴、乳头和蹄部的上皮组织见到水泡性损害。接种后的牛和马第二次是否出现水泡，主要取决于所使用的v s 病毒株。猪的口鼻部是正常感染的部位。人工接种马、牛、猪、绵羊、兔、豚鼠的舌面内可发生水泡，但接种于牛肌肉内则不发病1 5 引。可以通过接种乳鼠和乳兔接种试验来鉴别v s v 、f m d 、s d v 和v e v 这四种病毒。v s v 动物接种2 日龄和7 9 日龄乳鼠及乳兔，乳兔不发病，乳鼠均发病；f m d 用病料接种2 日龄和7 - 9 同龄乳鼠及乳兔均发病；s d v 接种2 日龄和7 9 日龄乳鼠及乳兔，7 9 日龄乳鼠不发病，其余均发病，v e v 用病料接种2 日龄和7 9 日龄乳鼠及乳兔均不发病【5 5 】。1 3 5 免疫学诊断9新型微生物传感器的应用研究免疫学诊断是传染病诊断和检疫中最常用的重要方法，目前，己经建立了很多检测v s v 和其抗体的免疫学方法。1 3 5 1 酶联免疫吸附试验( e l i s a )相比琼脂扩散法、c f 试验、v n 试验，e l i s a 具有快速、可靠、灵敏度高的优点，且不受前补体和抗补体因子的影响。应用e l i s a 可以在拿到样品几小时后给出结果，但当所取的样品所含的病毒的浓度过低时，该法检测不出病毒的存在。( 1 ) 间接夹, i 二, e l i s a ( i s - e l i s a )间接夹, i 二, e l i s a ( i s e l i s a ) 是v s 和其他水泡性病毒血清型鉴定目前广泛选用的诊断方法，也是国际贸易指定的抗原检测试验。用i n d 血清型三个亚型代表株的病毒颗粒制备的一套多价兔豚鼠抗血清的i e l i s a 方法，可以鉴定v s 病毒i n d血清型的所有毒株；对于v s 病毒n j 毒株的检测，可利用单价兔豚鼠抗血清试剂合【5 6 - 5 7 】x l i xo( 2 ) 竞争e l i s a ( c - e l i s a )a f s h a r 等1 58 】用小鼠抗v s v i n d 型和v s v n j 型多克隆抗体成功建立了竞争e l i s a 方法，并检测了绵羊、猪、马、牛的血清。该方法被广泛应用于血清学检测和流行病学调查。k a t z l s 等【5 9 】在昆虫细胞内表达了v s v n j 和v s v i n d 的n 蛋白，以重组蛋白代替全病毒对本方法进行了改进。( 3 ) 间接e l i s a ( i - e l i s a )郑增忍和花群义等【6 0 。6 1 1 分别构建y v s vn 基因原核和真核表达载体，生产的重组核蛋白具有良好的抗原性，可以代替完整病毒作为间接e l i s a 检测用的标准抗原。因为核蛋白较保守，其诱导的抗体为非中和抗体，可用e l i s a 检测出来：但若需要鉴定病毒的型时，e l i s a 方法还不能取代中和实验。黄运生于【6 2 】1 9 8 9 年建立了间接e l i s a 方法用于鉴定v s ，该法用b h k 2 1 细胞增殖n j 毒株，用离心的方法提纯v s v ；提取糖蛋白作为e l i s a 诊断抗原：用辣根过氧化酶联结的山羊抗马、牛、猪l g g 为酶联结合物。此法仅需6 7 h ，即可把n j 型v s v 从水泡性疾病里鉴别出来。但是该方法对v s v i n d 型反应性较低，且过程中需培养活的v s v ，有散毒的潜在危险，且成本较高，不能产业化，故限制了其应用范围。( 4 ) 液相阻断e l i s a ( l p e l i s a )液相阻断e l i s a ( l p e l i s a ) 是国际贸易指定对v s v 抗体进行定型和定量的首选方法，建议以病毒糖蛋白作为抗原，因为它们无感染性，检测中和抗体其假阳性比v n 试验要低【4 0 , 6 3 。( 5 ) l g m 捕捉e l i s a ( m c - e l i s a )v e r n o n 等【6 4 l 建立了l g m 捕捉e l i s a ( m c e l i s a ) 检测牛和马的血清。z h o u 等6 5 】建立了用羊抗猪和抗马的l g m 为基础的m c e l i s a 检测了感染初期猪和马的血清，硕十学位论文并和竞争e l i s a ( c e l i s a ) 做了对比。1 3 5 2 中和试验( n t )该试验可以检测v s v 抗原，也可检测中和抗体，并可以对v s v 进行定型；但用于急性感染和早期诊断时，其敏感性会有所下降。尽管组织培养物、未断乳的小鼠和鸡胚都能作中和试验，但动物中和试验较少用。该试验要求严格无菌操作，需活的病毒及细胞培养，耗费时间较长，操作起来较麻烦，但结果比较准确4 0 1 。1 3 5 3 补体结合试验( c f )补体结合试验也是国际贸易中进行v s v 检测的指定方法之一，当得不到e l i s a试剂时，可进行c f 试验。可用于早期抗体的定量，一般在感染后5 9 d 就能检测到抗体；近年来广泛采用微量补反试验，一般儿小时内可完成，但它的敏感性比较低，且常受到前补体和非特异因子的影响。由于补体结合试验参与反应的成分多，影响因素复杂，操作步骤繁琐并且要求十分严格，稍有疏忽便会得出不正确的结果，所以在多种测定中已被其他更易被接受的方法所取代。1 3 5 4 免疫荧光检测从细胞培养中分离到的病毒，可用荧光标记抗体鉴定感染细胞中的病毒抗原 6 6 1o1 3 6 病毒核酸的检测与分析1 3 6 1 核酸电泳分离与病毒检测提取到的病毒核酸用聚丙烯酞胺凝胶或琼脂糖凝胶进行电泳分离。有些病毒基因组具有特定的电泳图谱，且同一属病毒的不同株间的基因组电泳图谱也不相同，可借助此来准确诊断病毒。1 3 6 2 分子杂交技术检测病毒核酸先标记核酸的一条链，再通过核酸分子杂交方法检测待查样品中是否有与标记的核酸分子同源或部分同源的碱基序列，或“钓出同源核酸序列，这种被标记的核酸分子水泡性口炎病毒糖蛋白截短后在大肠杆菌中的表达和诊断技术的研究称为“探针 。有了核酸探针，便可检测待检样品中是否有与探针同源的病毒核酸序列【6 6 1 。1 3 6 3 病毒核酸指纹图谱分析待分析的核酸样品先用核糖核酸酶t 和核糖核酸酶a 裂解，然后在二维电泳中分开，经放射显影制出该核酸的指纹图谱。此法是病毒分析的先进技术，能对病毒株系的确认和研究提供权威性的佐证。由于病毒抗原比整个病毒基因组r n a 序新型微生物传感器的应用研究列更具保守性，所以，用指纹图谱分析病毒株间的差异比血清学分析更敏感【6 引。v s v 的演化非常慢，以致在许多年后仍能分离到相同指纹图谱的病毒【6 4 1 。1 3 6 4 基于r t - p c r 技术的检测方法r t p c r 是近些年来发展起来的一种快速诊断技术，现己广泛应用于v s v 的鉴定及临床诊断，并在方法上做了不断的改进和提高。r t p c r 可以扩增v s v 基因组中的某些小片段，被用来检测组织、水泡液样品和细胞培养物中v s v 的r n a ，检测临床样品是比病毒分离或补体结合试验更敏感、更快速的方法，但不能确定是否有病毒感染，故不作为筛检v s v 病毒病例的常规方法【lj 。由于r t p c r 检测v s v 的重复性较好，且具有快速、准确、特异、敏感等优点；且只涉及引物使用与保存，而不用进行繁琐的病毒分离和其他辅助性试验，可以避免散毒的危险。该试验可在l d 内完成，能够达到快速诊断的目的，同时还能检出血样中不具感染性的v s v ，可用于持续性感染的检测。因此，此法特别适合没有v s v 的国家和地区的口岸检疫，也可用于v s 的诊断和流行病学调查。( 1 ) 普通r t p c rr o d r i g u e z 箸j ；1 6 7 】对v s v n j 的p 基因设计了一对特异性引物，对临床样品进行了检测，具有良好的特异性和实用性。杨桂梅等【6 8 】选取v s v 具有高度保守性的n 基因序列，通过引物设计软件设计l 对引物，建立了v s v 的r t p c r 快速检测方法。应用此法检测v s v n j 株、v s v i n d 株均为阳性；而检测其他相关病毒性疾病的病毒如b v d v 、b t v 等均为阴性结果，实验证明r t p c r 检测v s v 具有良好的特异性。( 2 ) 多重r t