基于PCR技术的绿脓杆菌快速检测方法研究.doc

基于PCR技术的绿脓杆菌快速检测方法研究中国I生检验杂志2005年9月第15卷第9期ChineseJournalofHealthLaboratoryTechnology.Sep2005:Vol15N091065基于PCR技术的绿脓杆菌快速检测方法研究张伟,李闻,张伟尉,刘红艳,黄正(华中科技大学同济医学院公共卫生学院教育部环境与健康重点实验室,武汉430030)【论着】摘要目的:应用PCR技术来实现绿脓杆菌的快速鉴定.方法:绿脓杆菌特异性的PCR扩增引物是根据已报道的ETA基因序列设计的,同时考察该PCR方法的特异性和敏感性.另外,一种不提取基因组DNA而直接制备简易模板的直接PCR方法在本研究中也被尝试.结果:PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析,仅在包含绿脓杆菌基因组DNA的样品中得到单一一条带.直接PCR方法也成功扩增出同样的条带,而整个过程在4h内完成.结论:这种扩增绿脓杆菌ETA基因的直接PCR方法对绿脓杆菌的鉴定来说是一种快速,特异,敏感和相对简单的方法.关键词绿脓杆菌;PCR;ETA;快速检测中图分类号R378.991文献标识码A文章编号10048685(2005)09106503ThemethOdOlOgicalstudyonrapididentificationofPseudomonasaeruginosabasedonPCRtechniqueZhangWei,LiWen,ZhangWeiwei,LiuHongyan,HuangZheng(MOEKeyLabofEnvironmentandHealth.SchoolofPublicHealth,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScience&Technology,Wuhan430030,China)AbstractObjective:TorapidlyidentifyP.aerugiru)sausingPCRtechnique.Methods:PrimersforspecificPCRamplificationweredesignedbasedonthepublishedsequenceoftheexotoxinAgeneofP.or/Lg/r/x)$a.ThePCRidentificationwasalsoexaminedforitsspecificityandsensitivity.Inaddition.adirectPCRusingsimpletreatedtemplatewasattemptedonP.aer/nosawithoutDNAextractionstep.Results:AsinglebandwasobtainedonagarosegelelectrophoresisonlyfromPCRproductsthatcontainedgenomicDNAofP.aerugirusa.ThedirectPCRmethodwasalsosueeessfulwiththesamebandproducedfromtheamplificationandwholeprocesswascompletedwithin4h.Conclusion:ThedirectPCRamplificationtargetingattheexotoxinAgeneofP.aenzgin0s0isarapid.specific.sensitiveandrelativelysimplemethodfortheidentificationofP.o,er/g/nosa.KeywordsPseudorm)nasaeruginosa;PCR;ETA;Rapididentification绿脓杆菌也称铜绿假单胞菌,属于假单胞菌属,是一种常见的条件致病菌.在自然界分布甚广,空气,水,土壤中均有存在,对人有致病力,常引起人皮肤化脓感染,特别是烧伤,烫伤,眼部疾病患者被感染后,常使病情恶化,并可引起败血症.传统的绿脓杆菌检测主要依据该菌的生物学特征:革兰氏阴性杆菌,氧化酶阳性,能产生绿脓菌素,此外还能液化明胶,还原硝酸盐为亚硝酸盐,在42C条件下生长等.虽然传统检测方法具有一定的特异性和敏感性,但该方法操作起来费时耗力,在大规模样品检测时不易推广,另外在II缶床上还有可能延误诊断和治疗.因此,研究绿脓杆菌的快速检测方法具有十分重要的现实意义.近年来,随着分子生物学的进展,分子生物学技术已广泛应用于细菌,病毒基因水平的研究,也给微生物的快速鉴定提供了可能.在实验室中使用PCR方法快速检测微生物已经被作者简介张伟(1976一),男,硕士生,主要从事微生物检验研究.通讯联系人,Tel:02783657874;Email:广泛报道.SaintOnge等和Kureishi等于1992年分别报道应用PCR技术检测绿脓杆菌.在这里,我们研究一种使用绿脓杆菌外毒素A(ETA)基因作为模板来快速检测绿脓杆菌的PCR技术.绿脓杆菌能产生多种与毒力有关的物质,如内毒素,外毒素A,弹性蛋白酶,胶原酶,胰肽酶等,其中以外毒素A(ETA)最为重要.Gray等人已经从一个过量表达ETA的绿脓杆菌菌株中克隆和测定了ETA结构基因,而ETA基因仅在绿脓杆菌基因组中存在,因此,我们选择ETA基因作为PCR反应的靶基因.另外,我们也尝试一种利用煮沸法裂解菌体制备简易模板的直接PCR方法,该方法绕过了在PCR反应之前必需提取基因组DNA的步骤,因此可以使绿脓杆菌的鉴定在4h内完成.1材料与方法1.1材料1.1.1菌株绿脓杆菌ATCC15442由湖北省疾病预防控制中心赠;其它实验菌株均为本实验室从环境样品中采集分离所得.中国卫生检验杂志2005年9月第15卷第9期ChineseJournalofHealthLabora!.ryTechno|ogy,Sp2005;Vol15N.91.1.2培养基营养肉汤培养基,普通琼脂平板培养基.1.1.3试剂TaqDNA聚合酶,dNTPs,琼脂糖,DNAmarker均购自武汉天源生物有限公司;细菌基因组DNA抽提试剂盒为上海华舜生物工程有限公司产品.1.1.4PCR扩增引物两个特异性引物参照Khan等,根据已报道的绿脓杆菌ETA基因序列设计,扩增该基因上一段396bp的区域.ETA1和ETA2的序列分别为:5一GACAACGCCCTCAGCATCACCAGC一3和5一CGCTGGCCCAT-TCGCTCCAGCGCT一3,委托上海博亚生物技术有限公司合成.1.2方法1.2.1绿脓杆菌增菌培养用无菌接种环挑取绿脓杆菌(ATCC15442)接种到50IIll营养肉汤培养基中,置37C摇床过夜培养.1.2.2分离培养从增菌液中挑取培养物,划线接种在普通琼脂平板上,置37培养1824h.1.2.3基因组DNA提取细菌基因组DNA的提取采用细菌DNA抽提试剂盒(上海华舜)来完成.整个提取步骤参照其产品说明书进行,1ml过夜培养至对数生长期菌液经过Lysozyme破壁及ProteinaseK消化后上柱,DNA与吸附膜特异性联结,而绝大部分RNA,蛋白质及其它杂质被离心去除.再经过洗涤更彻底去除杂质后,用2mmol/Lriffs将DNA从吸附膜上洗脱下来.提取的DNA用含有EB的琼脂糖凝胶进行电泳检测,并用分光光度计测定其浓度和纯度.1.2.4PCR反应简易模板的制备用无菌牙签从分离培养平板上挑取少量菌体重悬于20无菌ddHO中,沸水中煮沸10min,立即置于冰上5min,4C,10000g离心5min,立即置于冰上,使用时取1.5上清直接作为PCR反应的模板.1.2.5PCR反应反应体系总体积为25,包括:2.5wl10buffer(含Mg”),0.5dNTPs(10mmol/L),1UTaqDNA聚合酶,引物量为10pmol,模板DNA用量为10ng(菌体的粗裂解物为1.5).PCR反应条件:95C预变性2min,94C变性1min,65oC复性1min,72oC延伸1min,30个循环,72终末延伸7min.PCR反应在MJResearchPTC200上进行.1.2.6PCR产物电泳取5PCR产物用2.0%琼脂糖凝胶电泳检测,电压为5V/cm,电泳时间为1.5h.2结果2.1PCR反应的特异性PCR反应所用ETA引物是根据已报道的绿脓杆菌ETA基因序列设计的,为了确定该引物是否对绿脓杆菌具有特异性,我们以绿脓杆菌和其他几种细菌基因组DNA作为模板分别进行PCR反应.PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测显示,只有绿脓杆菌PCR反应得到了一条396bp带型清晰可辨的DNA条带,结果见图1.由此说明,该ETA引物对绿脓杆菌具有特异性.为了证实从PCR产物中得到的条带是从绿脓杆菌ETA基因扩增的结果,而不是非特异性扩增,我们把几种细菌基因组DNA混合在一起作为模板进行PCR反应,结果显示,只有混有绿脓杆菌基因组DNA的PCR反应得到了阳性结果,见图2.这些结果进一步证实了该ETA引物对绿脓杆菌的高度特异性.400bp图1对不同细菌基因组DNA进行PCR的琼脂糖凝胶电脉图谱lane1:绿脓杆菌基因组DNA;lane25:不同细菌PCR产物,分别为绿脓杆菌,金黄色葡萄球菌,荧光假单孢杆菌,大肠杆菌DH5ctMarker12400bp图2混合几种细菌基因组DNA进行PCR的琼脂糖凝胶电脉图谱lane1:包括绿脓杆菌,金黄色葡萄球菌,荧光假单孢杆菌,大肠杆菌DH5Q基因组DNA的PCR产物;lane2:包括金黄色葡萄球菌,荧光假单孢杆菌,大肠杆菌DH5ct基因组DNA的PCR产物2.2PCR反应的敏感性通过确定能够产生目的条带所需模板DNA的最小量来检验该PCR反应的敏感性.将模板DNA经过系列10倍稀释以后,分别进行PCR反应,反应条件与前述相同,PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测,结果见图3.该结果显示,当模板DNA的量最小为10pg时,大小为396bp的目的条带仍然清晰可辨.这个结果表明,通过PCR检测ETA基因的方法对绿脓杆菌是非常敏感的.4oobpMarker12345图3敏感性试验的PCR产物琼脂糖凝胶电泳图谱lanel5:绿脓杆菌DNA模板量分别为l0ng,1ng,100Pg,10Pg,1Pg中国卫生检验杂志2005年9月第l5卷第9期ChineseJournalofHealthLaboratoryTechnology,Sep2005;Vol15No91067为了进一步缩短检测时间,我们采取了一种简易模板制备方法来进行直接PCR反应.其具体制备过程见前述,挑取的细菌菌体经煮沸处理后,菌体被完全裂解,基因组DNA释放出来,经离心后上清可直接作为PCR反应的模板.为了确定直接PCR方法的敏感性,我们先测定绿脓杆菌增菌液的吸光度值(0D),然后根据绿脓杆菌标准曲线(见图4)计算该增菌液的菌液浓度(cfu/m1),再将该增菌液经系列l0倍稀释后,取各稀释度菌液分别制备简易PCR模板,然后分别进行PCR反应.结果见图5,可见采用简易模板的直接PCR方法不仅成功得到了阳性结果,而且敏感性很高,仅需要3个cfu即可得到阳性结果.口0一400bp图4绿脓杆菌标准曲线Marker1234图5不同cfu绿脓杆菌进行直接PeR的琼脂糖凝胶电泳图谱lanel一4:绿脓杆菌简易模板量分别为3000,300,30,3cfu;lane5:以无菌水作为阴性对照3讨论传统用于绿脓杆菌鉴定的方法通常需要几天甚至更长的时间才能得到阳性结果.在大规模样品(如食品,化妆品,环境样品)检测中,如何实现绿脓杆菌的快速鉴定成为我们关心的重点.PCR方法较传统生化鉴定方法最大的优点就是快速,它可以在几个小时内实现对微生物的鉴定,大大缩短了检测的时间.另外在送检样品中,绿脓杆菌的数量比较有限,在这种情况下,PCR方法因为其具有高度的特异性和敏感性,即使痕量的细菌DNA残留也足以被检测,这对样品中绿脓杆菌的快速鉴定就更具现实意义.我们应用PCR技术扩增绿脓杆菌基因组中一段ETA基因来检测样品中的绿脓杆菌.ETA是致病性绿脓杆菌分泌的一种具有种属特异性的外毒素.它具有细胞毒性,通过使真核生物的延长因子2(EF一2)ADP一核糖基化而抑制蛋白质的生物合成j.在本研究中使用的引物是根据已报道的ETA基因序列设计的.为了评估该引物的特异性,我们对绿脓杆菌和其他几种细菌分别应用该引物进行了PCR反应,除了绿脓杆菌外,其他细菌均没有产生396bp的PCR产物(见图1).另外,我们确定了该PCR反应的最低检测限为l0pgDNA(见图3)或3个cfu(见图5).基于上述结果我们可以认为,该PCR方法用于样品中绿脓杆菌的鉴定具有高度的特异性和敏感性.在细菌的PCR鉴定中,模板的制备对PCR反应的结果是至关重要的,通常我们都是提取细菌基因组DNA来作为PCR反应的模板,但是提取过程需要花费几个小时的时间,虽然现在可以直接购买一些商品化的抽提试剂盒来完成提取过程,能够节省一些时间,但仍然需要l2h,而且在提取过程中还会有一些有害的有机溶剂的使用.在本研究中,我们尝试了一种PCR模板的简易制备方法,整个模板制备过程仅需要20min,从而可以大大缩短检测的时间.在PCR反应之前只需要将少量菌体煮沸10min即可释放出足够多的细菌基因组DNA来产生阳性结果(见图5).应用该方法不仅使整个细菌检测过程缩短至4h,而且也减少了提取过程中DNA的损失.随着分子生物学的广泛应用,越来越多的分子生物学技术应用于微生物的鉴定,除了我们研究的PCR技术外,还有质粒指纹图谱分析,脉冲场凝胶电泳分析,基因芯片技术以及16SrDNA分型鉴定技术等J.虽然这些技术都可以从分子水平完成对细菌的定性鉴定,但与这些技术相比较,PCR技术无疑具有简单,快速的优点,也便于在实际工作中推广.总之,根据我们研究的结果,扩增绿脓杆菌ETA基因的PCR方法,是一种十分特异,敏感和快速的检测绿脓杆菌的技术.该PCR方法也可以作为传统生化鉴定方法的一种有效的补充.参考文献1SaintO,RomeyerF,LebolP,eta1.SpecificityofthePseudomonasaeruginosaPAO1lipoprotein1geneasaDNAprobeandPCRtargetregionwithinthePseudomonadaceaeJ.JGeneralMicrobiol,1992,138(4):733741.2KureishiA,BryanLE.PreboilinghishGCcontent,mixedprimerswith3complementationallowsthesuccessfulPCRamplificationofPseudomonasn,nDNAJ.NucleicAcidsRrsearch,1992,2O(5):1155.3liuPV,HsiehH.ExotoxinsofPseudomonasaeruginosa.1.FactorsthatinfluencetheproductionofexotoxinAJ.JInfectiousDiseases,1973,128(4):506513.4GrayGL,SmithDH,BaldridgeJS,eta1.Cloning,nucleofidese