（水产养殖专业论文）Pseudoalteromonas+spAJ5913的κ卡拉胶酶酶学性质及酶解产物分析.pdf

p s e u d o alt e r o m o n a ss p a j 5 - 9 13 的k - 卡拉胶酶酶学性质及， 酶解产物分析 摘要 本论文目的是从海洋环境筛选高活性的r 卡拉胶酶产生菌株，对筛选菌株 的产酶培养条件和培养基进行优化，在此基础上对该菌株进行诱变以提高其酶 活力，纯化其k 卡拉胶酶，并研究该酶的酶学性质，利用此酶制备r 卡拉胶寡 糖，并对其酶解产物的组成和结构进行分析，为r 卡拉胶酶酶制剂秘k - 卡拉胶 寡糖的工业化生产提供理论和技术支撑。通过富集培养技术、初筛和复筛方法 从多种海藻和刺参肠道筛选出3 3 株具有r 卡拉胶降解活性的菌株，其中从刺 参肠道筛选出的a j 5 菌株产酶活力最高，为1 - 2 7 4u 札。依据形态学和生理学 特征及1 6 sr r n a 基因序列分析，将该菌株鉴定为假交替单胞菌属 ( p s e u d o a t e r o m o n a s ) ，通过比较发现该菌株与已报道该属中的惟一一种产r 卡拉胶酶菌只c a r r a g e e n o v o r a 有多种生理生化特征不同。通过单因素试验和 正交试验对p s e u d o a t e r o m o n a ss p a j 5 菌株产胞外r 卡拉胶酶的培养条件进 行了优化。实验确定p s e u d o a t e o m o n s s s p a j 5 菌株的最佳培养条件为：2 5 0 l l 三角瓶装入7 5m l 发酵培养基、摇床转速1 5 0r r a i n 、接种量7 、p h 8 0 、 培养温度2 8 ：最佳培养基组成为：k _ 卡拉胶1g l 、牛肉膏2g l 、n a c l2 0 ， g l 、k 2 h p 0 4 3 h 2 0lg l 、i d g s o , 7 h 2 00 5g l 、m n c l 2 4 1 - 1 2 00 2g l 、f e p 0 4 4 1 1 2 0 0 0 1g l 。以p s e u d o a t e r o m o n a ss p a j 5 菌株为出发菌株，经紫外线、甲基 磺酸乙酯复合诱变和自然选育，获得一株酶活力显著提高的突变株 p s e u d o a t e r o m o n a ss p a j 5 - 9 1 3 ，发酵产酶活力达6 7 8 8u i i l l ，比优化前提高 了2 9 倍。对该突变株进行液体发酵制备出k - 卡拉胶酶酶液，通过3 0 一8 0 硫 酸铵分级沉淀、s e p h a d e xg - 2 0 0 凝胶过滤层析和c m 一纤维素5 2 阳离子交换层 析技术对1 c 一卡拉胶酶进行纯化和精制，获得电泳纯度的酶蛋白组份，s d s p a g e 确定此r 卡拉胶酶的分子量为3 5k d a 。采用e d m a n 降解法测得该酶的n 端氨 基酸序列为n p l c h i a k p g e t t i l q e c r s ，通过与已报道细菌1 c 一卡拉胶酶的n 一末端 f 。， 氨基酸序列比较，没有发现与该酶同样的n _ 末端氨基酸序列，初步确定为一新 r 卡拉胶酶。采用等电聚焦龟泳测得该酶的等电点p ，为8 5 。通过对该酶酶 学性质研究，确定该酶反应的最适p h 范围为8 ，且酶活力在p h 6 6 8 6 范围内 比较稳定，最适温度为5 5 ，酶活力在2 8 下稳定，但经5 0 一7 5 处理3 0 m i n ，9 5 的酶活力丧失，最适n a c i 浓度5 0m m o l l ，金属离子z n 2 + ，c 0 2 + 和c u 2 + 几乎完全抑制酶的活性。动力学参数测定结果表明， j 5 9 1 3 菌株的r 卡拉胶 酶水解k - 卡拉胶符合米氏动力学方程，采用双倒数法作图法求得其米氏常数 砌值为9 8 + 0 2m g m l 。a j 5 - 9 1 3 菌株的k - 卡拉胶酶专门水解r 卡拉胶，对 t 一和入一卡拉胶和琼脂糖没有水解作用。利用a j 5 9 13 菌株所产的k - 卡拉胶 酶对r 卡拉胶进行酶解制备r 卡拉胶寡糖，通过电喷雾离子化飞行时间质谱 ( e s i t o f m s ) 和1 3 c n m r 分析该酶的水解产物，确定该k 一卡拉胶酶专门水解 r 卡拉胶3 ，6 一内醚一d - 半乳糖残基和4 一硫酸基一d _ 半乳糖之间的b 一1 ，4 糖苷 键，产生3 ，6 一内醚一胪半乳糖作为非还原端，旷半乳糖作为还原端的1 c 一新卡拉 寡糖，主要产物是k - 新卡拉二糖硫酸盐、k _ 新卡拉四糖硫酸盐、1 c 一新卡拉六糖 硫酸盐、k 一新卡拉八糖硫酸盐和k _ 新卡拉十糖硫酸盐，与已报道细菌的k _ 卡拉 胶酶的酶解产物有所不同。寡糖的抗病毒活性实验显示，3 1 2p g m l 一2 0 0 肛g m l 的1 c 一新卡拉寡接对单纯疱疹病毒1 型( h s v - i ) 的吸附有抑制作用，并且呈现明 显的量效关系，表明k - 新卡拉寡糖可干扰h s v - i 端r 向v e t o 细胞的吸附。 关键词：k 一卡拉胶酶；假交替单胞菌属；k - 新卡拉寡糖；酶法制备 v i l c h a r a c t e r i z a t i o no f n - c a r r a g e e n a s ef r o mp s e u d o a l t e r o m o n a s s p a j 5 9 13a n da n a l y s i sf o ri t st ) y d r o l y z e dp r o d u c t s a b s 仃a c t t h i sp a p e ra i m sa ts c r e e n i n gak - c a r r a g e e n a s e - p r 6 d u c i n gb a c t e r i u mw i t hh i g h e n z y m ea c t i v i t y , o p t i m i z i n g i t sc u l t u r ec o n d i t i o n sa n dm e d i u m c o m p o n e n t s ， m u t a g e n i z i n gt h eb a c t e r i u mt oo b t a i nt h em u t a n tw i t hh i g h e r - a c t i v i t y ，p u r i f y i n gt h e _ ：- c a r m g e e n a s ef r o mt h em u t a n tc u l t u r a ls u p e r n a t a n t , s t u d y i n gt h ee n z y m a t i c p r o p e r t i e s ，p r e p a r i n gk - c a r r a g e e n a n - d e r i v e do l i g o s a c c h a r i d e sf r o mr - c a r r a g e e n a n u s i n gt h ee n z y m e ，a n a l y z i n gt h ec o m p o s i t i o na n ds t r u c t u r eo ft h ee n z y m e h y d r o l y z e dp r o d u c t s ，p r o v i d i n gt h et h e o r e t i c a la n dt e c h n o l o g i c a ls u p p o r t sf o r c o m m e r c i a lp r o d u c t i o no fr - c a r m g e e n a s ea n dr - e a r r a g e e n a no l i g o s a c c h a r i d e s b y e n r i c h m e n tc u l t u r et e c h n i q u ea k ：- c a r r a g e e n a n d e g r a d i n gb a c t e r i u ma j 5 ，c a p a b l eo f u t i l i z i n g 量：- c a r r a g e e n a na ss o l es o u r c eo fc a r b o na n de n e r g y , w a si s o l a t e df r o mt h e i n t e s t i n eo fh o l o t h u r i a na p o s t i c h o p u sj a p o n i c u s t h es t r a i nw a si d e n t i f i e da st h e g e n u sp s e u d o a l t e r o m o n a ss p a c c o r d i n gt oi t sm o r p h o l o g i c a la n dp h y s i o l o g i c a l c h a r a c t e r i z a t i o na n d16 sr r n ag e n ea n a l y s i s i tw a sf o u n dt h a tt h es t r a i nh a d d i f f e r e n tp h y s i o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c s c o m p a r e dw i t ht h eo n l yo n eb a c t e r i u m ，p c a r r a g e e n o v o r o ，i nt h i sg e n u s t h ec u l t u r ec o n d i t i o n sa n dm e d i u mc o m p o n e n t sf o r t h eb a c t e r i u mh a v eb e e ns t a n d a r d i z e df o rt h em a x i m a l p r o d u c t i v i t y o ft h e e x t r a c e l l u l a rk - c a r r a g e e n a s e u s i n gt h es i n g l ef a c t o ra n do r t h o g o n a lt e s t s t h e o p t i m a lc u l t u r ec o n d i t i o n sw a sf o u n da sf o l l o w i n g ：7 5m lm e d i u mi n2 5 0m l v i e r l e n m e y e rf l a s k , s h a k i n gs p e e do f15 0r r a i n , i n o c u l u mv o l u m e7 ，p h 8 0a n d t e m p e r a t u r e2 8 0 c t h eo p t i m a lm e d i u mc o m p o n e n t sw e r eo b s e r v e d a st h e f o l l o w i n g ：r - c a r r a g e e n a n1g l ，b e e fe x t r a c t2g l ，n a c l2 0g l ，k 2 h p 0 4 3 1 - 1 2 01 g l ，m g s 0 4 。7 h 2 00 5g l ，m n c h 4 h 2 00 2g l ，f e p 0 4 4 h 2 00 0 1g l b yu s i n g t h ec o m p l e xm u t a g e n e s i so fu vi r r a d i a t i o na n de t h y lm e t h a n e s u l p h o n a t e ( e m s ) t r e a t m e n t ，t h em u t a n tp s e u d o a l t e r o m o n a ss p a j 5 9 13w i t hk - c a r r a g e e n a s ea c t i 锣 o f6 7 8 8u m lw a so b t a i n e df r o mp s e u d o a l t e r o m o n a ss p a j 5 ，w h i c hw a s2 9 - f o l d h i g h e rt h a nt h a to ft h ep a r e n tc u l t u r e a ne x t r a c e l l u l a rk ：- c a r r a g e e n a s ew a sp u r i f i e d f r o mp s e u d o a l t e r o m o n a ss p a j 5 913c u l t u r a ls u p e m a t a n tb ya m m o n i u ms u l f a t e f r a c f i o n a t i o n ，g e lf i l t r a t i o nc h r o m a t o g r a p h y ( s e p h a d e xg - 2 0 0 ) a n dc a t i o n e x c h a n g e c h r o m a t o g r a p h y ( c m - c e l l u l o s e5 2 ) t h ep u r i f i e de n z y m ey i e l d e das i n g l eb a n do n s d s p a g e 诚t l lt h em o l e c u l a rm a s so f3 5k d a t h es e q u e n c eo ft h e2 0a m i n o a c i d sa tt h en - t e r m i n a lo f n - p - t - c - h - i - a - k - p g - e t - t - i l - q ecr - s c o m p a r e d 谢t l lk n o w nn - t e r m i n a l a m i n oa c i dr e s i d u e so fk - c a r m g e e n a s e s ，n o r - c a r r a g e e n a s e 诵t 1 1 t h es a m e c o r r e s p o n d i n gn t e r m i n a la m i n oa c i ds e q u e n c ew a so b s e r v e d ，i n d i c a t i n gt h a tt h i s p r o t e i nm i g h tb ean o v e lk - c a r r a g e e n a s e t h ep io fk c a r r a g e e n a s ew a s8 5o n i s o e l e c t r i cf o c u s i n g t h eo p t i m u mp hf o rt h ee n z y m ew a s8 0a n di t sa c t i v i t yw a s s t a b l ei nt h ep hr a n g eo f6 6 - 8 6 t h eo p t i m u mt e m p e r a t u r ew a s5 5 0 ca n dt h e e n z y m ew a ss t a b l ea t2 8 0 c ，b u t9 5 o ft h ea c t i v i t yw a sl o s ta t5 0 0 c - 7 5 0 cf o r3 0 m i n t h ea c t i v i t yo ft h ee n z y m ew a so p t i m u ma tt h ep r e s e n c eo f5 0m m o l ln a c i t h ee n z y m ea c t i v i t yw a sa l m o s tc o m p l e t e l yi n h i b i t e db yc 0 2 + ，c u 2 + a n dz n 2 + a t1 i x m m o l l t h i sk - c a r r a g e e n a s es h o w e dm i c h a e l i s - t y p ek i n e t i c sw h e nh y d r o l y z i n g t k - e a r r a g e e n a n , 弱c a l c u l a t e df r o ml i n e w e a v e rp l o t , t h ea p p a r e n t v a l u ew a s 9 8 士0 2 m # m l t h ee n z y m es p e c i f i c a l l yh y d r o l y z e d 一：- c a r r a g e e n a n t - a n d k - e a r r a g e e n a n sa n da g a r o s ew e r en o th y d r o l y z e db yt h i st c - c a r r a g e e n a s e t h e c o m p o s i t i o na n ds t r u c t u r eo fm a i ne n z y m eh y d r o l y z e dp r o d u c t se x a m i n e db y e s i t o f m sa n d ”c - n m rw e r ek - n e o c a r r a b i o s e ，- t e t r a o s e ，- h e x a o s e ，- o c t a o s e ， a n d d e c a o s es u l f a t e s 谢也3 - l i n k e d1 3 - d g a l a c t o p y r a n o s e4 - s u l f a t e 嬲t h er e d u c i n g e n d , i n d i c a t i n g t h e k - c a r r a g e e n a s e f r o mp s e u d o a l t e r o m o n a s s p a j 5 - 9 13 s p e c i f i c a l l yh y d r o l y z e d t h e p - l ，4g l y c o s i d i cl i n k a g e b e t w e e n 3 , 6 - a n h y d r o - d g a l a c t o s ea n dd g a l a c t o s e t h em a i ne n z y m eh y d r o l y z e dp r o d u c t s o ft h i se n z y m ew e r ed i f f e r e n tf r o mt h o s eo fk - c a r r a g e e n a s e sf r o mo t h e rb a c t e r i a l s t r a i n s t h ea n t i - h s v - 1a c t i v i t i e so f ) c - n e o c a r r a o l i g o s a c c h a r i d e sw e r ed e t e r m i n e d k - n e o e a r r a o l i g o s a c c h a r i d e s ( 3 1 2 - 2 0 0v e g m l ) c o u l di n t e r f e r ea b s o r p t i o no fh s v i t ov e r oc e l l sa n dt h e r ew a so b v i o u sr e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h ec o n c e n t r a t i o n sa n dt h e e f f e c t so fr - n e o c a r r a o l i g o s a c c h a r i d e s k e y w o r d s ：k - c a r r a g e e n a s e ；p s e u d o a l t e r o m o n a s ；k ：- n e o c a r r a o l i g o s a c c h a r i d e ； e n z y m a t i cp r e p a r a t i o n x 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得 ( 洼_ 翅鎏直墓丝蚕墓缱别直盟数! 奎拦亘窒或其他教育机构的学位或证书使 用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 学位论文储签名芳蟛彦乏签字醐。一护石月步 i l l 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人 授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用 影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权中国科学技术信息 研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库，并通过网络向社会公 众提供信息服务。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：粤屹孜 导师签字：1 穸7 j t 签字日期乡沪月! 娟 签字日期：乒。淳舌月倜 i v 0 前言 p s e u d o a l t e r o m o n a ss p a j 5 9 1 3 的k - 卡拉胶酶酶学性质及酶解产物分析 第一章文献综述 卡拉胶是一类从某些红藻细胞壁中提取的硫酸胶体多糖。我国每年卡拉胶 产量近2 万吨，目前8 0 9 6 的卡拉胶用于食品及与食品相关工业，其余2 0 9 6 用于医 药、轻工、纺织、化工和化妆品领域。近年来海藻多糖类药物的研究受到高度 重视，多糖被认为是一种广谱的非特异性免疫促进剂，能够增强人体的细胞免 疫和体液免疫功能，可激活巨噬细胞，促进抗体的形成，激活补体及诱导产生 干扰素等。由于未降解卡拉胶粘度大、扩散困难，很难被机体吸收，而且毒性 大，严重限制了卡拉胶的应用。在这种形势下，人们逐渐认识到卡拉胶降解形 成的寡糖片段及其经过人工修饰、改造后获得的衍生物具有多种新型生理和药 理活性，如抗病毒、抗肿瘤、抗溃疡、抗凝血等。利用从海洋微生物提取的卡 拉胶酶制备卡拉胶低分子量活性片段成为卡拉胶工业高值化研究的新型领域。 我国辽阔的海域蕴藏着极其丰富的海藻资源。目前，我国已经成为世界上 为数有限的三大胶都能生产的国家之一，海藻加工业成为我国海洋资源综合利 用的重要领域。随着海藻开发和利用的广泛开展，提高海藻产品的附加值，寻 找海藻多糖的新型生理活性，成为新时期人们关注的焦点。目前我国对红藻多 糖的降解基本采用化学法降解方法。由于化学降解方法反应条件不易控制、卡 拉胶酸水解寡糖的得率较低，目的产物不易分离；而酶解法得率则有较大的提 高，而且酶解反应条件温和、易于控制、产物易分离。国外的科研工作者已经 将目光转移到通过酶解法获取低聚糖这一新的方向，特别是海洋微生物这一极 其丰富的自然资源。现在已经在假单胞菌属p s e u d o m o n a s 、假交替单胞菌属 p s e u d o a t e r o m o n a s 、噬纤维菌属c y t o p h a g a 、交替单胞菌属a t e r o m o n a s 、弧 菌属v i b r i o 及某些未鉴定菌种中发现卡拉胶酶( 包括1 c 一卡拉胶酶，t 一卡拉胶 酶和入一卡拉胶酶) 。有关酶解得到的卡拉胶寡糖的组成结构和生物学活性国外 也有报道。国内在该领域的研究很少，牟海津等从噬纤维菌c y t o p h a g as p 卅2 分离到卡拉胶酶，但其酶活力较低。然而，目前国际市场上仍没有卡拉胶降解 酶的产品，无法将其应用于工业化卡拉胶寡糖的生产。这是因为如何提高海洋 p s e u d o a i t e r o m o n a ss p a j 5 - 9 1 3 的静卡拉胶酶酶学性质及酶解产物分析 微生物产酶活性和稳定性，以达到酶制剂工业化的需要；如何通过控制酶解工 艺的方法，制备特定聚合度的卡拉胶寡糖等问题还需要进一步的研究解决。 本论文拟从以下几个方面进行研究： ( 1 ) 从不同海藻样品和刺参消化道分离筛选出具有较高卡拉胶酶活性的菌株。 ( 2 ) 研究不同培养条件对菌株生长和产酶能力的影响，通过优化实验，确定出最 佳培养基组成和培养条件，对菌株的生长曲线和产酶曲线进行测定。通过诱变 选育出卡拉胶酶活性显著提高的突变株。 ( 3 ) 对该突变株所产卡拉胶降解酶进行分离纯化，制备出电泳纯度的酶蛋白组 分，测定酶蛋白的分子量和等电点，并对酶蛋白的n 一端氨基酸序列进行测定。 对纯化酶的基本酶学性质进行研究，确定该酶的最适作用条件和反应稳定性。 ( 4 ) 确定卡拉胶的酶解工艺，通过乙醇分级和凝胶层析等技术对酶解产物进行纯 化，获得不同聚合度的卡拉胶寡糖样品，并对其组成、聚合度和化学结构通过 质谱、n m r 等现代技术进行分析，进一步确定该酶的具体作用特点和作用方式。 ( 5 ) 测定卡拉胶寡糖对h s v - 1 病毒吸附的影响，初步分析其抗病毒吸附机理， 1 卡拉胶的研究进展 1 1 卡拉胶的的来源及生产工艺 1 1 1 卡拉胶的来源 卡拉胶是从某些红藻的细胞壁中提取的一种多搪。卡拉胶是其英文名称 c a r r a g e e n a n 的音译，我国早期曾称其为咖啦胶、角叉莱胶、鹿角菜胶f 后统一 为卡拉胶。现在知道，从许多种红藻可以提取卡拉胶，目前世界上生产的卡拉胶 有近一半是用麒麟菜作原料，苏联用具脉育叶藻和伊红藻提取卡拉胶，此外还有 角叉菜、海萝、杉藻、沙菜、银杏藻、叉红藻、育叶藻等均可提取卡拉胶，我国 南方广东省用麒麟菜、北方辽宁省用角叉菜作原料生产卡拉胶。 2 p s e u d o a l t e r o m o n a ss p j 5 - 9 1 3 的b 卡拉胶酶酶学性质及酶解产物分析 1 1 2 生产工艺 生产卡拉胶有两种不同的方法，分别依据不同的原则。第一种方法作为惟一 的方法一直使用到二十世纪7 0 年代末至8 0 年代初，卡拉胶从海藻提取到水溶液 中，残留的海藻通过过滤去除，然后从溶液中获取卡拉胶，最后的干物质主要含 有卡拉胶。与第二种方法的成本比较，这种方法是困难和昂贵的。第二种方法卡 拉胶并没有从海藻真正的提取出来，其原则是洗去海藻溶解于碱和水中的所有物 质，留下卡拉胶和其他不溶物质。然后干燥主要由卡拉胶和纤维素组成的不溶部 分，作为半精制卡拉胶出售。因为不用从溶液中获取卡拉胶，因此该方法简单和 便宜n 1 。一 ， 国内的卡拉胶生产采用稀碱溶液分离提取制备，一般为卡拉胶的钠盐，以麒 麟菜、沙菜为主要原料，一般工艺过程如下： 原料一碱处理一洗涤至中性一提胶一过滤一冷却一切条一冻结脱水一解冻一干 燥一成品 卡拉胶生产的关键工序为碱处理、提胶精制和脱水干燥。这三个工序的处理工艺 科学与否不但影响卡拉胶的性能和质量，而且对卡拉胶的提取率和生产成本有着 重要的影响嘲。碱用量大，环境污染严重，能耗高，用水量大，这严重困扰着企 业发展。而我国海域有大量沙菜资源，卡拉胶存在于沙菜细胞间层中，碱处理导 致卡拉胶质量差。添加适量的复合酶( 纤维素分解酶、半纤维素酶和果胶降解酶 等) 在温和条件下可以有效地破坏细胞壁，而对卡拉胶基本成分不破坏，所提取 的卡拉胶质量高。 1 2 卡拉胶的主要特性 卡拉胶产品一般为白色和淡黄色粉末，无味，是一种天然高分子化合物， 无一定的分子量。商业( 食品级) 卡拉胶的分子量通常为4 0 0 - 6 0 0k d a 啪。 1 2 1 溶解性能 各种类型的卡拉胶都能溶解于热水，而入一、f 和t 一卡拉胶的钠盐也能溶于 冷水，但r 卡拉胶钾盐和钙盐在冷水中只能吸水膨胀，而不能溶解。在热牛奶中， 入一、r 和t 一卡拉胶都溶解，入一卡拉胶大部分能分散在冷牛奶中，并增加其粘稠 性。而k - 和t 一卡拉胶在冷牛奶中难溶或不溶，其3 ，6 一内醚一半乳糖含量越高，硫酸 基含量越低，越难溶于冷牛奶中。卡拉胶难溶于有机溶剂，如甲醇、乙醇、丙醇、 p s e u d o a l t e r o m o n a ss p a j 5 - 9 1 3 的静卡拉胶酶酶学性质及酶解产物分析 异丙醇和丙酮等。所以常用这些溶剂作为沉淀剂，使卡拉胶从水溶液中沉淀出来 【帕 口 1 2 2 凝胶化性能 卡拉胶的凝胶性能主要与其化学组成、结构和分子大小有关。卡拉胶中的k - 卡拉胶和t 一卡拉胶，在加水并加热近沸时就融化成溶胶，放冷后则形成凝胶， 即有凝胶一溶胶的可逆反应。关于r 卡拉胶热可逆凝胶化的理论研究，“二步 凝 胶化机理的看法已成共识嘲。所谓“二步 机理是指k - 卡拉胶热可逆凝胶化过程 分两步完成：第一步搿线团至廿螺旋；第二步“聚集到凝胶化 。也即无规线团 ( c o i l ) 构象的k - 卡拉胶大分子链，先转变成螺旋( h e l i x ) 构象，然后由螺旋聚集再 形成三维网状凝胶结构。r 型卡拉胶的凝固性能好于t 一型卡拉胶，其它类型的 卡拉胶在水中不能形成凝胶。阳离子对卡拉胶的凝胶化影响很大，如c a 2 + 、r 、 r b + 、c s + 和n h + 等阳离子，能显著提高凝胶强度。在一定范围内，凝胶强度随阳离子 浓度增加而增强。另外，一些多糖对卡拉胶的凝固性也有影响，如槐豆胶可以显著 提高k _ 卡拉胶的凝胶强度和弹性，而羧甲基纤维素则降低其强度，但增加弹性。 1 2 3 粘度 卡拉胶能形成高粘度的溶液，这是由它们无分枝的直链型大分子结构和聚电 解质的性质所造成的。卡拉胶溶液的粘度与溶液的温度和浓度成指数函数变化， 不同类型的卡拉胶粘度有很大差异。一般f 卡拉胶的粘度较低，而亲水基团较多 的入一卡拉胶粘度较高。卡拉胶的粘度会受其它溶质的影响，砂糖可使卡拉胶的 粘度上升，两价阳离子在高浓度时会使粘度下降，在低浓度时会使粘度上升，而 一价阳离子对粘度的影响较小啷。 1 2 4 与蛋白质反应 卡拉胶与其它水溶性高分子物质的不同之处就是与蛋白质的反应性。结合在 卡拉胶分子上的硫酸根和半乳糖上的羟基，具有极强的负电荷。而蛋白质是一种 两性物质，在等电点以下的条件中带正电的氨基酸会和卡拉胶结合而产生沉淀， 在等电点以上的条件下，蛋白质带负电荷，有多价阳离子作为交联剂和卡拉胶结 合形成亲水胶体，在等电点，由多价阳离子为交联剂与卡拉胶相结合而形成沉淀。 卡拉胶的种类不同，其所含的硫酸根数量及其位置也不一样，使得与蛋白质的反 应也有差异。比较起来，入一卡拉胶比c 一和- 一卡拉胶与蛋白质的反应要差1 。 4 p s e u d o a l t e r o m o n a $ s p a j 5 - 9 1 3 的k - 卡拉胶酶酶学性质及酶解产物分析 1 2 5 泌水性 卡拉胶的凝胶放置时有的会分泌出一些水来，这是凝胶收缩造成的。r 卡拉 胶形成的水凝胶的泌水性较大。t 一卡拉胶的水凝胶无泌水性，但它在乳中形成 的凝胶有泌水性。卡拉胶泌水性的大小除与卡拉胶本身的类型有关外，还与凝胶 的浓度、系统中含有的电解质与非电解质的种类、浓度、压力的大小等有关。 1 2 6 稳定性 干的卡拉胶粉末很稳定，长期放置不会很快降解，比褐藻胶、果胶等的稳定 性好。卡拉胶的溶液在微碱性和中性时很稳定，但在酸性情况下不稳定，容易发 生水解。水解的程度主要决定于p h 、温度、时间和卡拉胶本身的结构。在p h 为 9 时，卡拉胶溶液最稳定，在此p h 下短时间加热粘度下降不大。 1 3 卡拉胶的结构组成与分类 卡拉胶是由1 ，3 一b d _ 半乳糖和1 ，4 一q d 一半乳糖作为基本骨架，交替 连接而成的硫酸线性多糖。商业化的卡拉胶主要有k 一( ka p p a ) 型、t 一( i o t a ) 型和入一( l a m d a ) 型三种。r 卡拉胶由3 ，6 一内醚一a d 一半乳糖和4 一o 一硫酸一 b - d 一半乳糖单位重复组成；l 一卡拉胶由2 一o 一硫酸一3 ，6 一内醚一n - d 一半乳 糖和4 一o - 硫酸一b d 一半乳糖单位重复组成；入一卡拉胶由2 ，6 一o _ 硫酸一q d - 半乳糖和2 沪硫酸一b d - 半乳糖单位重复组成( 图1 - 1 ) 。 5 腑谢砸厅e 洲彻s p a j 5 9 1 3 的x - 卡拉胶酶酶学性质及酶解产物分析 oh o k a p p a - 卡拉胶 。一 0h 0 oh i o t a - 卡拉胶 o s 0 3 k o o 一 os0 3k o s 0 3 k l a m d a - 卡拉胶 图1 - 1r 型、l 一型和入一型卡拉胶结构 根据卡拉胶重复二糖的1 。3 1 3 一沪半乳糖单位上的硫酸基所在位置的不同， 将其分为8 族卡拉胶( 无s o , 2 。) 、1 c 族卡拉胶( c 2 一s 衅一) 和入一族卡拉胶( c 4 一s 嘎2 ) ， 又根据重复二糖的l ，4 一一d 一半乳糖单位上3 ，6 一内醚的有无及硫酸基所在位 置的不同，口族卡拉胶可分为丫一，口一，6 一和a 一卡拉胶；k 族卡拉胶可分为 p 一、k 一、u 一和t 一卡拉胶；入族卡拉胶( 可分为毛一、o 一、入一和一卡拉胶。 o 一卡拉胶在藻体内不存在，是天一卡拉胶经碱处理后形成的。此外，还有不属 于这三族类型的一卡拉胶。各种类型卡拉胶的结构组成见表1 - 1 m 。 6 p s e u d o a l t e r o m o n a ss p _ j s - 9 1 3 的k - 卡拉胶酶酶学性质及酶解产物分析 表卜1 不同类型卡拉胶的结构组成 1 4 卡拉胶的应用 卡拉胶具有形成亲水胶体和凝胶、增稠、乳化、成膜、稳定、分散等特性， 在食品行业中主要用作胶凝剂、增稠剂或悬浮剂，可用于稳定乳液、控制脱液收 缩、赋形、胶结和分散，广泛应用于乳制品、冰淇淋、果汁饮料、面包、水凝胶 ( 水果冻) 、肉制品、调味品、罐头食品等方面。可调配成果冻粉、软糖粉、布 丁粉、爱玉米、西式火腿调配粉等。除此以外，卡拉胶还被应用于化妆品、日用 品、化工、医药、轻工、纺织等工业生产中心廿1 们。 2 卡拉胶及卡拉胶寡糖组成与结构的研究 传统的糖链分析方法主要是化学方法，如甲基化分析、s m i t h 降解、过碘酸 氧化、乙酰化、三氧化铬氧化、部分酸水解和碱性降解等。它不仅可以确定糖的 组成及糖链的连接方式，还可以提供大量的其他结构信息。生物方法如酶学方法 7 p s e u d o a l t e r o m o n a ss p a j 5 - 9 1 3 的k 卡拉胶酶酶学性质及酶解产物分析 等，在糖链的精细结构分析中也具有重要的作用。随着现代仪器分析技术的迅速 发展，多种先进的仪器分析方法己应用到多糖和寡糖结构分析中，如红外光谱 ( i r ) 、核磁共振( h - n m r ，1 一n m r ，蹦b c ，n m q c ，t o c s y ) 、质谱( e s i m s ，e s i - t o f - m s ， m a l d i - t o f - m s ，u v m a l d i t o f m s ，f a b - m s ) 等n l q 刀，这些方法使多糖和寡糖的结 构分析有了质的飞跃，使人们能够在毫克级，甚至微克级水平上确定一些寡糖的 一级结构及空间构象。 2 1 红外光谱( i r ) 红外光谱是糖结构研究的重要手段之一n 们，可以提供各种官能团和糖苷键 的波数范围的糖链结构的信息。根据各种吡喃糖和呋喃糖的特征吸收，可以对不 同糖进行鉴别。在多糖中旷d - l ，4 结合键，与o t d - 1 ，3 交替结合键，随着聚合度 的增加，环伸缩振动的吸收峰向高波数移动，而对大多数是旷d 1 ，6 结合键的葡 聚糖和异麦芽糖来说没有明显移动，旷和p 一型差向异构体中c - h 键，分别出现 在8 4 4 8 c m - 1 ，8 9 1 + 7 c m - 1 处嘲。以卡拉胶寡糖为例，红外光谱可以获得关于硫酸 基的总量、硫酸基不同的连接位置及含量、3 ，6 一内醚半乳糖的含量等重要的信 息。虽然仅凭i r 一种手段很难确定一种未知化合物的结构，但对于己知化合 物，借助标准图谱是极易识别的，且红外光谱也具有不破坏样品的优点。 2 2 质谱( m s ) 技术 质谱是目前寡糖序列微量分析最重要和灵敏的方法n 司。由于其灵敏度高，样 品用量少，在糖链分析中得以广泛应用。利用质谱可以测定寡糖的相对分子质量 和糖链的一级结构。根据电离方式的不同，质谱可分为电子轰击电离质谱 ( e l m s ) 、化学电离质谱( c i m s ) 、快原子轰击电离质谱( f a b - m s ) ，基质辅助激光 解吸离子化飞行时间质谱( m a l d i - t o f m s ) 和电喷雾离子化质谱( e s i - m s ) 等。 e s i - m s 是目前寡糖分析中最常用的方法技术，由于卡拉胶寡糖是酸性寡糖，因 此通常采用负离子方式，可以得到较理想的图谱，通过对碎片的分析获得糖链结 构信息n 5 盥1 。 f u k u y a m a 等利用u v m a l d i t o f m s 和e s i - t o f m s 技术对几种硫酸新卡拉二 糖寡糖进行了分析，结果表明u v - m a l d i t o f m s 是一种分析硫酸寡糖的有用工 具，结合e s i - t o f - m s 可以分析样品是不同程度硫酸化的寡糖纯品还是混合物， 因此可以研究即时的寡糖片段化。 p s e u d o a l t e r o m o n a ss p a j 5 9 1 3 的静卡拉胶酶酶学性质及酶解产物分析 2 3 核磁共振波谱( n m r ) 技术 n m r 对多糖或寡糖结构的分析起十分重要的作用坞，一1 。n m r 分析样品用量 较少且无破坏性，样品可回收，尽管糖链中氢谱重叠严重，但6 0 0 b 任i z 以上的高 分辨n m r 能准确测定结构基团的化学位移和峰宽，糖链的各种结构特征均可由这 些表征基团的微小位移变化表现出来。碳谱需要较长的积分时间，样品用量也相 对增加，各种二维波谱技术( n o e ，c o s y ，h m b c ，删q c 等) 的应用，极大促进了寡 糖链及其序列分析的研究水平口一。t o j o 等汹1 利用1 h - n m r 方法定量分析卡拉胶混 合物中r 、i 一和入一型卡拉胶的含量。v a nd ev e l d e 掣3 瑚1 对应用于研究和工业 的卡拉胶的1 h 和1 3 c 核磁共振谱作了详细的综述，后又对其化学位移数据进行了 校正。y u 等利用温和酸水解方法从k a p p a p h y c u ss t r i a t u m 卡拉胶制备k _ 卡拉胶 寡糖，通过强阴离子交换高效色谱纯化三种寡糖，使用1 d n m r 、2 d n m r ( 1 h 一1 hc o s y ， 1 h _ 1 ht o c s y ，1 3 c 一h 删q c ) 结合e s i - m s 技术确定了三种寡糖的结构，即r 卡拉 三硫酸基五糖，r 卡拉七糖和k 卡拉十一糖n 町。y u a n 和s o n g 用1 h - n m r 和1 c - n m r 技术结合e s i m s 研究了温和酸水解制备的卡拉胶寡糖混合物( f 1 ) 的组成和结 构嘲。 3 卡拉胶酶的研究进展 3 1 卡拉胶酶的来源及分类 3 1 1 来源 海洋微生物来源的卡拉胶酶：目前发现卡拉胶酶主要来源于海洋细菌，包括 假交替单胞菌属p s e u d o a t e r o m o n a ，船删、假单胞菌属p s e u d o m o n a 翦1 、噬纤维 菌属c y t o p h a g a l 3 ”、弧菌属盱所d 、交替单胞菌属a lt e r o m o n a s 和z o b e l l a 【3 4 】 其它海洋生物也可产生卡拉胶酶。例如从朝鲜花冠小月螺，单齿螺，疣荔枝 螺等海螺的消化液中可以提取卡拉胶降解酶。投喂g r a c i l a r i av e t t u c o s a 的鲍 鱼的肝胰脏呈现卡拉胶酶活力嘲。 3 1 2 分类 根据卡拉胶酶的底物专一性不同可将卡拉胶酶分为：r 卡拉胶酶，i 一卡拉 胶酶和入一卡拉胶酶，分别降解k - 卡拉胶，l 一卡拉胶和入一卡拉胶。目前的研究 9 p s e u d o