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2 0 0 5 届中山大学硕士学位论文黄元 s a p i n 2 a 过量表达转基因龙葵胚珠及胚胎 发育的研究 专业：细胞生物学 硕士生：黄元 导师：欧阳学智教授 摘要： 蛋白酶抑制剂i i ( p r o t e i n a s ei n h i b i t o ri i ，p i n 2 ) 是一种具有胰蛋白酶和胰 凝乳蛋白酶抑制活性的丝氨酸蛋白酶抑制剂，广泛存在于番茄、土豆和烟草等许 多茄科植物中。本文研究了s a m n 2 m 。l 量表达转基因龙葵( s o i a n u ma m e r j c a p u m ) 的胚珠及胚胎发育过程。 p c r 结果表明与( 绑3 5 s 强启动子相连的s a p i n 2 0 9 基因已经成功整合到 s a p i n 2 a 过量表达转基因龙葵的基因组d n a 中。n o r t h e r nb l o t 分析显示转基因龙 葵的花组织中s a p i n 2 链转录水平上过量表达。 用石蜡切片观察了白川n 捌生量表达转基因龙葵的胚珠发育过程。雌蕊为实 心柱头，倒生胚珠。孢原细胞形成后不是减数分裂为孢原细胞和周缘细胞，而是 直接发育成大孢予母细胞。大孢子母细胞经减数分裂形成直线形的四分大孢子， 珠孔端一个发育为功能大孢子，其余三个退化。功能大孢子经历三次有丝分裂发 育为成熟胚囊。胚囊发育为蓼形。 用激光共聚焦显微镜观察了s a p i n 2 a 过量表达转基因龙葵胚胎发育过程。胚 胎发育经历球形胚，心型胚，鱼雷胚和成熟胚四个阶段。 s a p i n 2 a 过量表达转基因植株在胚珠和胚胎的发育过程中，在显微形态上与 野生型植株并没有显著的差异。 本文对过量表达花组织的石蜡切片进行了切片末端脱氧核苷酸转移酶介导 的d u t p 切刻末端标记反应( d e o x y n u c l e o t i d y l t r a n s f e r a s e m e d i a t e dd u t pn i c k e n dl a b e li n g ，t u n e h ) 检测。开花后过量表达龙葵花的胚珠组织出现特异性染 色，表明其中有p c d 发生。 x a t i r 2 a 过量表达转基因龙葵胚珠及胚胎发育的研究 野生型和s a p i n 2 a 过量表达转基因龙葵植株珠心细胞的超显微结构没有显著 差异。胚囊周围一定范围内的珠心细胞显示典型的细胞程序性死亡特征，包括细 胞质皱缩、液泡增加、核固缩、染色质边缘化等。其凋亡过程可以分为自溶型凋 亡和凝缩型凋亡。在自溶型凋亡中，细胞中发生显著的自体吞噬，在凋亡末期， 随着各类细胞器的降解，液泡减少或消失，胞质电子密度下降，最终只剩下一些 电子致密物残存在原生质腔中。在凝缩型凋亡中，原生质电子密度显著增大，细 胞变狭长，发生质壁分离，液泡和质膜的完整性保持到凋亡末期。 关键词：蛋白酶抑带i j n i i ，胚珠和胚胎发育，珠心细胞，细胞程序性死亡，龙葵 2 0 0 5 届中山大学硕士学位论文黄元 s t u d i e so no v u l ea n de m b r y od e v e l o p m e n to f s a p i n 2 ao v e r - e x p r e s s e dt r a n s g e n i cs o l a n u m a m e r i c a n u m m a j o r ： c e l lb i o l o g y n a m e ：y u a nh u a n g s u p e r v i s o r ：p r o f x u e z h io u y a n g a b s t r a c t ： p r o t e i n a s ei n h i b i t o ri i ( p i n 2 ) ，as e r i n ep r o t e i n a s ei n h i b i t o rw i t ht r y p s i na n d c h y m o t r y p s i ni n h i b i t o r ya c t i v i t i e s ，o c c u r s i nm a n ys o t a n a e e a e p l a n t si n c l u d i n g t o m a t o ，p o t a t oa n dt o b a c c o w es t u d i e do v u l ea n de m b r y od e v e l o p m e n to fs a p i n 2 a o v e r - e x p r e s s e dt r a n s g e n i cs o l a n u ma m e r i c a n u m p c ra n a l y s i ss h o w e dt h eg e n es a p i n 2 aa d j o i n e dw i t hc e d ，v 3 5 sp r o m o t o rh a d b e e nc l o n e di n t ot h eg e n o m eo f & a m e r i c a n u m n o r t h e r nb l o ta n a l y s i ss h o w e d s a p i n 2 am r n ah a db e e n l a r g e l y t r a n s c r i b e di nf l o w e r si nt h es a p i n 2 a o v e r - e x p r e s s e dt r a n s g e n i cp l a n t s m e g a s p o r o g e n e s i s a n d m e g a g a m e t o g e n e s i s i nw i l d t y p e a n ds a p i n 2 a o v e r - e x p r e s s e dt m n s g e n l c a m e r i c a n u mw a ss t u d i e db yp a r a f f i n - s e c t i o n t h es t y l e w a ss o l i d t h eo v u l ew a sa n a t r o p o u s n ea r c h e s p o r i u md i dn o t u n d e r g om i t o t i c d i v i s i o nt op r o d u c eam e g a s p o r o c y t ea n das o m a t i cc e l l ，b u tf u n c t i o nd i r e c t l ya st h e m e g a s p o r o c y t e t h et e t r a sf r o mt h em e i o s i so fm e g a s p o r o c y t el i n e ds t r a i g h t l y b u t o n l yt h et a po n en e a rm i c r o p y l ec o u l dd e v e l o pi n t ot h ef u n c t i o n a lm e g a s p o r ea n d o t h e r t h r e ec e l l sd e g e n e r a t e d t h ef u n c t i o n a lm e g a s p o r eu n d e r w e n tt h r e em i t o s e sa n d f o r m e dm a t u r ee n b r y os a c t h ed e v e l o p m e n to ft h ee m b r y os a cc o n f o r m e dw i t ht h e p o l y g o n u mt y p e c o m p a r i n gw i t hw i l dt y p e a m e r i c a n u m ，t h em i c r o - s t r u c t u r eo fo v u l ea n d e m b r y od e v e l o p m e n ti ns a p i n 2 ao v e r - e x p r e s s e dt r a n s g e n i c & a m e r i c a n u mh a dn o 1 1 l s a p i n 2 a 过量表达转基因龙葵胚珠及胚胎发育的研究 a n yn o t a b l ed i f f e r e n c e t h ee m b r y od e v e l o p m e n to fs a p i n 2 ao v e r - e x p r e s s e dt r a n s g a n i c & a m e r i c a n u m w a so b s e r v e dw i t hc o n f o c a ll a s e rs c a n n i n gm i c r o s c o p y t h ee m b r y ou n d e r w e n tf o u r p h a g e s ：g l o b a le m b r y o ，h e a r te m b r y o ，t o r p e d oe m b r y o ，a n dm a t u r ee m b r y o f l o r a ls e c t i o n sw e r ed e t e c t e db yi ns i t ul a b e l i n gu s i n gt e r m i n a l d e o x y n u c l e o t i d y l t r a n s f e r a s e - m e d i a t e dd u t p n i c ke n d l a b e l i n gf r u r m e t h o d ， w h i c hr e v e a l e dp c do c c u r r e di no v u l e si nt h es a p l n 2 ao v e r - e x p r e s s e dt r a n s g e n i c 置 a r a e r i c a n u ma f t e rb l o s s o m t h eu l t r a - s t r u c t u r eo fn u e e u a rc e l l s i nw i l dt y p ea n ds a p i n 2 ao v e r - e x p r e s s e d t r a n s g e n i csa m e r i c a n u m h a dn oa n yn o t a b l ed i f f e r e n c e t y p i c a lf e a t u r eo f p r o g r a m m e dc e l ld e a t h ，i n c l u d i n gc y t o p l a s ms h r i n k a g e ，v a c u o l ei n c r e a s e ，c h r o m a t i n m a r g i n a t i o n ，n u c l e a rc o n d e n s a t i o ne t c ，w a sf o u n di nn u c e l l a rc e l l si nac e r t a i nr e g i o n a r o u n dt h ee m b r y os a c t h ea p o p t o s i sc o u l db ec l a s s i f i e de i t h e ri nt h ef o r mo f a u t o l y s i so rc o n d e n s a t i o n i nt h ea u t o l y s i sd e g e n e r a t i o n ，p r o m i n e n ta u t o p h a g i e a c t i v i t yo c c u r e di nt h ec e l l s i nt h ef i n a lp h a s e ，o r g a n e l l e sd e g e n e r a t e d ，v a c u o l e d e c r e a s e do rd i s a p p e a r e d ，a n de l e c t o nd e n s i t yo fc y t o p l a s md e c r e a s e a tl a s tt h e r e w a so n l ys o m em a s sw i t he l e c t o nd e n s i t yl e f ti nt h ec y t o p l a s ms a c i nt h ec o n d e n s e d t y p e ，t h ei n i t i a t i o no fc e l ld e g e n e r a t i o nw a sa c c o m p a n i e db ya ni n e a s ei nt h e c y t o p l a s m i cd e n s i t y i nt h ef m a lp h a s e ，p l a s m o l y s i so c c u r r e d ，a n dt h ec e l l st u r n e d n a r r o w t h ei n t e g r i t yo fv a c u o l ea n dp l a s m a l e m m aw a ss u s t a i n e dt i l lt h ef i n a lp h a s e k e y w o r d s ：p r o t e i n a s ei n h i b i t o r ，o v u l ea n de m b r y od e v e l o p m e n t ，n u c e l l a rc e l l s ， p r o g r a m m e dc e l ld e a t h ，s o l a n u ma m e r i c a n u m i v 2 0 0 5 届中山大学硕士研究生论文 黄元 第1 章前言 1 1 茄科花发育过程中的细胞形态学研究进展 世界上已知的植物有近3 0 万种，其中9 0 以上是开花植物。千百年来，人们对 花的形态、分类、遗传、生理等进行了大量的研究，积累了丰富的知识。但是，由 于实验手段的限制，花发育的研究一直局限在非常有限的领域中，对于其中所 包含的复杂内在机制仍不清楚。近几年来，随着分子生物学和分子遗传学的发展， 为人们从分子水平上来认识花发育的本质提供了可能，目前这一领域已成为植 物发育分子生物学研究的热点和领先学科。 在对植物的花器官发育进行相关的遗传学和分子生物学分析之前，花器官的 形态学和解剖学上的系统研究是极为重要的工作。b r u k h i n 等0 1 指出，在对植物 花器官的形态学研究中，需要将这些发育时期的时间顺序的细胞形态学标志性事 件同花发育的尺寸规模相联系，以便于研究花发育中的时间性的变化。目前多种 模式植物已经进行了这样的形态学描述。例如，烟草( n i c o t i a n at a b a c u m ) ， 拟南芥( a r a b i d o p s i st h a l i a n a ) “，和s i l e n el a t i f o l i a “1 等。 早在1 9 3 1 年，作为茄科的代表性模式植物，番茄( l y c o p e r s i c o ne s c u l e n t u m ) 的雌雄配子体的形态解剖学研究已经开始旧。番茄的小孢子发生和雌配予体发育 中的细胞形态，包括染色体数目的变化，有丝分裂和减数分裂中的细胞形态都做 了描述。k o l t u n o w 等“1 构建了烟草( n i c o t i a n at a b a c u m ) 的花发育模型，根据 花芽长度和形态学标志事件，把烟草的花发育分为1 2 个阶段，对每一阶段相应 的花外部形态和花发育细胞学事件做了详尽的描述。在此基础上，k o l t u n o w 研 究了三个发育相关的基因的时空特异性表达，讨论了它们在花药发育中的可能作 用。b r u k h i n “1 等确立了番茄( l y c o p e r s i o ne s c u l e n t u m ) 的心皮、雄蕊和雌蕊 发育的细胞学标志性事件和花被形态上的相互关系，建立了番茄花发育时问表模 型，将番茄的花发育被分为2 0 个阶段，为分析基因在花组织发育中的时空和组 织特异性调控打下了基础。 本文研究的茄科植物龙葵( s o l a n u ma m e r i c a n u m ) ，是一年生草本。花序短 蝎尾状或近伞状，侧生或腋外生，有花4 一l o 朵，花序梗长卜2 5 c m ；花细小， & u 。v 2 a 过量表达转基因龙葵胚珠及胚胎发育的研究 柄长约i c m ，下垂；花萼杯状，绿色，5 浅裂；花冠白色，辐射状，5 裂，裂片 卵状三角形，约3 c 砸；雄蕊5 ，花药顶端孔裂；子房上位，卵形，花柱中部以下 有白色绒毛。浆果球形，直径约8 舢，熟时黑色。种子多数，近卵形，压扁状。 龙葵的花发育形态解剖学并没有相应的系统研究。 1 1 1 1 胚珠的形成 雌蕊的主要部分是予房，在子房的胚珠中产生胚囊，并在成熟胚囊中产生卵 细胞。而胚珠又是子房中的重要结构。胚珠是种子的前身，由珠心、珠被、珠孑l 、 合点和珠柄等部分组成。 胚珠发生在胎座上，初出现时是个很小的突起，这个突起叫做珠心。珠心 增大体积。并从珠心的基部生出一种保护珠心的构造，叫做珠被。珠被通常有两 层，外层硝外珠被，内层叫内珠被，内外珠被向上生长。将珠心包被起来，形成 胚珠。胚囊是从珠心细胞中分化而来。 1 1 2 胚囊的发育过程 胚囊的发育过程可以分为两个阶段：大孢子发生( m e 9 8 s p o r o g e n e s i s ) 和雌 配予体发生( m e g a g a m e t o g e n e s i s ) 。一般说来，在大孢子发生过程中，胚囊母细 胞( r a e g a s p o r o c y t e ) 经历减数分裂，产生凹个单核胚囊。接下来在雌配子体发 生过程中有丝分裂，核移动，胞浆移动( c y t o k i n e s i s ) ，形成成熟的胚囊。植物 中的胚囊发育有各种各样的形式。其中7 0 的植物属于廖形胚囊”1 。我们所研究 的龙葵也属于廖形胚囊。 1 大孢子发生的形态学过程： 胚囊发生于珠心组织中。最初，珠心是一团均匀一致的薄壁细胞，在珠被刚 开始形成时，珠心内部的细胞发生变化。在胚珠表皮下分化出一个孢原细胞，该 细胞的体积较大，细胞质浓厚，核大而显著，孢原细胞进一步发育成为胚囊母细 胞。 在向日葵等合瓣花植物及小麦、水稻等植物中，孢原细胞先进行一次平周分 裂，形成内外两个细胞，外侧的为周缘细胞，内侧的为造孢细胞。周缘细胞经过 分裂使珠孔附近的珠心细胞增加数目和层次，而造孢细胞则发育为胚囊母细胞。 胚囊母细胞接着进行减数分裂，形成4 个单倍体的大孢子，它常呈线形排列。这 4 个细胞中，靠近珠孔的3 个常萎缩退化至消失，只有远离珠孔的1 个细胞继续 2 2 0 0 s 届中山太学硕士研究生论文 发育成为单核胚囊。单核胚囊从珠心组织和退化的细胞中吸取营养，使细胞体积 扩充雠。 雕t 呐 单沁鳓瓣：千 n ) 珏曩 l他蔓烛枉1 t ( 盈o l 庋足椭3 “囊多十tn ) 图1 1 胚囊发育过程图解 2 雌配子体发生的形态学过程 随后，单核胚囊发生3 次有丝分裂，第一次分裂形成2 个核，分别移到两极， 以后每个核又相继进行2 次分裂，每极各形成4 个核。这3 次的分裂都是核分裂， 不伴随细胞质的分裂和新壁的形成，因此胚囊中出现了8 个游离核。接着每一端 的4 核中，各有l 核移向胚囊的中央部分，这2 个核称为极核。留于胚囊两端的 其余细胞核，也各自发生变化，外围产生细胞壁，分化成细胞。靠近珠孔端的3 个核分化成为1 个较大的卵细胞和2 个较小的助细胞；位于合点端的3 个细胞核， 分化成3 个反足细胞。2 个极核所在的大型细胞则称为中央细胞。至此，单核胚 曩已发育成为成熟胚囊，即被子植物的雌配子体，它具有7 个细胞共8 个核，其 中的卵细胞即为雌配子“1 。 1 2 植物细胞程序性死亡的调控 1 2 1 细胞程序性死亡的定义 细胞程序性死亡( p r o g r a m m e dc e l ld e a t h ，p c d ) 是生物体在发育过程中或 者环境影响下，通过自身内部机制启动并调节的细胞生理死亡过程。作为主动死 亡过程，其主要是高度的自控性和发生部位、发生时序的准确性，而且通常在细 胞死亡的过程中有新的大分子合成。1 。从细胞水平看，p c d 是生物体以一种与 细胞分裂相反的方式趋调节相对平衡的重要镶略，在生物体的发育中有重要意 义。对动物细胞程序性死亡的研究开始较早，已经取得了较大的进展，而对植物 3 s a p i n 2 a 过量表达转基因龙葵胚珠及胚胎发育的研究 细胞程序性死亡的研究相对不成熟“。 对于p c d 的认识和研究最初是从观察两栖类动物的变态现象开始的，后来 人们发现p o d 普遍发生于无脊椎和脊椎动物体中“，例如昆虫变态反应中无用 细胞的去除、蝌蚪尾巴的消失、脊椎动物和人类非功能性腺的退化以及皮肤表面 细胞的死亡等等。l o c k s h i n 等“2 1 在研究昆虫变态时便注意到一些细胞按明显规 律的预定程序死亡，从而提出程序性死亡( p r o g r a m m e dc e l ld e a t h ，p c o ) 这一概 念。k e r r 等“”在研究肝缺血时注意到两种不同的细胞死亡形式：第1 种，细胞膜 解体，细胞器形态改变，溶酶体消失即坏死：而第2 种则细胞膜完整，细胞器形态 完整，染色质固缩，核碎裂，细胞最终自行分割为若干外膜完整的小体。前者称为 细胞坏死，后者为细胞程序性死亡。p c d 不同于细胞坏死( n e c r o s i s ) 。细胞坏 死是指由不同的物理、化学因素，包括缺氧、缺血、损伤及不同的外源生物因素 导致的，是在细胞受到极度有害刺激时出现的，以原生质膜的破裂为特征，是一 种被动的，突发性的非正常死亡；而细胞程序性死亡是主动的、按照一定程序进 行的细胞死亡过程，这种细胞死亡通常与基因的有序活动相关“。凋亡不仅为机 体组织细胞不断更新提供一条安全的途径，而且是机体在自身发育过程中清除特 异细胞的一种手段。 植物的p c d 可以分为以超敏反应( h y p e r s e n s i t i v er e a c t i o n ，h r ) 为代表的 类似凋亡的细胞死亡( a p o p t o s i s - 1 i k ec e l ld e a t h ) ，类似叶片衰老的细胞死亡 和以输导组织分化为代表的液泡起关键作用的细胞死亡三种形式o “。 1 2 2 植物p c d 的主要特征及检测方法 最近几年，植物细胞p c d 已经成为一个研究热点，被进行了广泛的研究。 1 细胞程序性死亡的形态学特征。 细胞凋亡的形态学特征主要表现为细胞核固缩：染色体凝集：大多数细胞出 现d n a 片段化( f r a g m e n t a t i o n ) ，经琼脂糖凝胶电泳出现梯形条带( d n al a d d e r ) ： 细胞骨架紊乱，内质网起泡，并与细胞膜融合，形成细胞质气泡：染色体片段、细胞 器和细胞质被细胞膜包裹，形成凋亡小体。细胞凋亡过程中，细胞的生化特性也发 生改变，例如一些蛋白酶被激活或抑制，核酸内切酶激活等。研究发现，植物p c d 与动物的细胞凋亡有许多相似的特征“6 ”1 。 在植物细胞凋亡的主要形态特征中，其中一部分与动物细胞凋亡相符。发生 4 2 0 0 5 届中山大学硕士研究生论文 黄元 p o d 的细胞先以细胞质和细胞核浓缩、染色质边缘化为特征，随后由膜包围d n a 片段而形成诵亡小体。用透射电镜可以在相应组织中观察到这些p o d 的形态特征。 用流式细胞仪可以检测出p c d 中的染色体凝集。 在动物细胞凋亡的很末期，凋亡小体形成并最后被吞噬。但是在植物细胞中 并没有发现形态学上与凋亡小体类似的结构。在植物中可能是没有凋亡小体结构 的，这是因为细胞壁的存在下死亡的细胞不可能被相邻细胞吞噬。取代凋亡小体， 植物中可能的相应通路是自溶作用口叮。 从形态学角度，植物细胞p o d 可以分为四大类：( 1 ) 程序性坏死( p r o g r a m m e d o n c o s i s ) 。对玉米叶片的h r 中发现，其p c d 不需要半胱天冬酶的参与，单纯的钙 离子浓度增高并不能诱导凋亡的发生。这证明这一p c d 是与编程性坏死是共用信 号转导的早期路径的。其形态特征与细胞坏死类似，主要的不同在于对周围细胞 不造成影响。这一类p c d 称为细胞程序性坏死。( 2 ) 自体吞噬的细胞程序性死亡 ( a u t o p h a g i cp c d ) 。自体吞噬的p c d 的最大特征是细胞广泛的液泡化，高度致密 化的核和细胞器常被包裹在液泡内，液泡膜完整。( 3 ) 自溶作用( a u t o l y s i s ) 。 自溶作用中，液泡膜破裂，各种细胞器皱缩或不完整。胚柄的消失是典型的自溶 作用。( 4 ) 细胞凋亡( a p o p t o s i s ) 。对植物细胞凋亡的研究已经达到分子水平， 然而对其它三类p o d 仍然知之甚少住玎。 2 d n al a d d e r d n al a d d e r 是在植物中最早发现的动物细胞凋亡的特征。发生p o d 的细胞表 现为被诱导产生核酸内切酶，核d n a 从核小体间降解断裂，产生带有3 一0 h 端的、 大小不同的寡聚核小体片段，这些片段在凝胶电泳上可以见到以1 4 0 b p 倍增的“梯 形”d n a 条带。而在细胞坏死中，d n a 的降解产物是随机发生的，在电泳中表现为 拖尾。因而，d n al a d d e r 可以作为p c d 的特异性标记。”。 3 t u n e l 反应 根据d n al a d d e r ，用t u n e l 标记d n a 末端的自由3 一o h ，可以用来探测d n a 片段。在动物细胞的凋亡中，t u n e l 反应已经成为了一种特异性的凋亡的判定标 准啪1 。但是必须指出，用固定、包埋和切片处理的植物组织样品，会产生足够 的核d n a 切刻，有可能造成t u n e l 假阳性“7 。2 “。不过，现在的t u n e l 反应方法已 经做了相应的改进，以适应植物细胞的体内的d n a 片段的检测“”。与双乙酸荧 s a p n 2 a 过量表达转基因龙葵胚珠及胚胎发育的研究 光素( f l u o r e s c e i nd i a c e t a t e ，f d a ) 或e v e n sb l u e 等其它方法相比，f d a 和e v e n sb l u e 可标记所有死亡的细胞，包括细胞坏死和p c d ，对p c d 没有特 异性。运用整体t u n e l 反应的方法更适用于时间过程的p c d 检测。 总之，用t u n e l 反应作为标记判定特定植物系统中的p c d ，一定要小心谨慎， 最好要加上基因组d n al a d d e r 或其它典型的生化特征，才能支持p c d 的结果 4 a n n e x i nv 细胞膜不对称性的丧失是p c d 诱导后最早期的事件之一。用a n n e x i ny 可以优 先结合于带负电的磷酸腊上，可以检测出细胞外膜磷酸脂丝氨酸的转位，从而检 测到细胞膜不对称性的丧失。例如，用喜树碱诱导的烟草细胞和人细胞的细胞程 序性死亡的近似的试验中，都能检测到细胞外膜上的a n n e x i nv 的结合。 此外，植物p c d 还涉及半胱天冬酶样活性的变化，多a d p 核糖聚合酶( p l o y ( a d p - r i b o s e ) p o l y m e r a s e ，p a r p ) 的剪切等。 1 2 3 植物与环境互作中的p c d 在低氧、低盐和病原侵袭等环境压迫下，植物细胞会发生细胞程序性死亡。 其中，超敏反应( h y p e r s e n s i t i v er e a c t i o n ，h r ) 是植物的一个最为显著的抗病 反应，即在病原物侵染处诱发局部的细胞死亡。h r 可以将病原物限制在侵染部位， 防止其迸一步扩散。细胞染色反应显示h r 中死亡的细胞都靠近维管束，表明维管 束鞘细胞的死亡，对于阻止病原物进入维管系统，防止病原体的系统传播有积 极意义。h r 中的细胞死亡已成为p c d 研究的热点之一“1 。 1 2 4 植物有性生殖和胚胎发育中的p c d 目前植物细胞程序死亡研究程度落后于动物，而有关高等植物有性生殖过 程中的细胞程序死亡的研究又落后于植物营养体发育过程中的细胞程序死亡研 究。 1 大孢予发生过程中的细胞程序死亡 在胚珠中，大孢子母细胞经过减数分裂形成四个大孢子，其中三个大孢子退 化死亡，只有个大孢子能发育成雌配予体。退化的大孢子呈现出细胞收缩、细 胞质失去组织状态和细胞核裂解等现象，这些特征类似动物细胞中的细胞程序死 亡现象。早期认为四个大孢子的命运不同与其位置、细胞内含物多少以及生长 物质的极性化分布有关，然而这些解释均缺乏足够证据。r o d k i e w i c z 扭耵曾对数十 6 2 0 0 5 届中山大学硕士研究生论文 种植物大孢子发生时胼胝质壁的积累和消失做过观察。他发现蓼型胚囊的长花劳 伦菊( l a u r e n t i a o n g i f l o r a ) 四分体中，合点端的功能大孢子缺少胼胝质壁。在 待宵草型胚囊的月见草( o e n o t h e r ab i e n n i s ) 中功能大孢子位于珠孔端，虽然同 时形成的4 个大孢子都被胼胝质壁包围，但功能大孢子的胼胝质壁较早消失，而 退化大孢子则较长时间地被胼胝质壁包围，表明胼胝质壁的隔离造成了四分体中 3 个大孢子退化。b e l l 等口订提出：大孢子的死亡可能是一种p c d ，受遗传控制。决 定大孢子死亡的基因是类似于自交不亲和性的双座位顺反子a 和b 。大孢子母细 胞经减数分裂产生的四个大孢子基因型为a i b i 、a 1 8 2 、a 2 8 1 、a 2 8 2 ，其中a 2 8 2 型孢子注定死亡，a 1 8 1 型始终能够存活，而a i b 2 、a 2 b i 型则取决于其存在位置以 及受粉花粉的基因型。这一观点得到了一些实验的支持，但仍缺乏p c d 特征性 的证据o ”。 2 雌配子体发育过程中的细胞程序性死亡 大多数被子植物胚囊珠孔端的卵器由一个卵细胞和两个助细胞构成。传粉 后，花粉管经助细胞进入胚囊，并在助细胞中释放出其内含物，包括两个精细 胞，使双受精顺利完成。过去的超微结构观察表明，在花粉管到达之前或到达时 助细胞发生退化。在有些植物中，即使未传粉，助细胞在开花时也发生退化现 象。但在另一些植物中，未传粉花中的助细胞没有退化现象，只有传粉后花粉管 即将达到时才引起助细胞的退化。在两个助细胞中仅一个助细胞发生退化时， 花粉管总是进入退化助细胞中，因此在确保精细胞能被送到胚囊中受精上，助 细胞的退化起了非常重要的作用。在这个退化过程中，细胞质成分的电子密度增 加，细胞器退化，液泡破裂，细胞自溶，这些现象都是细胞程序死亡的特征。现 在深入的研究表明，助细胞中的这些变化受胚囊发育控制，为吸引花粉管进入胚 囊做准备：或受即将到达的花粉管的刺激而发生的变化，为花粉管释放精细胞做 好准备啪1 。 3 花药发育过程中绒毡层的p c d 绒毡层是花药壁的最内层体细胞组织，它的发育及退化对花粉的发育有重要 生理作用。，随着小孢子中央大液泡的形成，绒毡层细胞从生长转变为衰退，一 般在小孢子第一次分裂前后，经过细胞死亡过程而逐渐消失。绒毡层细胞在特定 时间的细胞程序死亡与花粉的发育密切相关，许多研究表明绒毡层细胞死亡过程 s a p i n 2 a 过量表达转基因龙葵胚珠及胚胎发育的研究 的异常往往导致花粉的败育。绒毡层细胞开始退化的特征是细胞壁变薄、细胞收 缩、细胞质电子密度增加和极性化咖。 4 胚柄细胞的p c d 胚柄是由合子第一次分裂产生的基细胞发育形成的。对胚柄的发育已有许多 研究，它除了起将幼胚固着在胚囊孔珠端的作用以外，还将母体的营养物传递 给胚，并合成一些生长因子调控幼胚的生长。当胚发育到心型胚时，胚柄细胞退 化。在金莲花( t r o p a e o u m 船j u s ) 胚柄细胞的退化过程中，线粒体转变为自体 吞噬体，并在细胞中产生了水解酶和酸性磷酸酶“”。胚柄细胞死亡的起因还不 清楚，但根据胚柄细胞的形态( 细胞体积很大或成为吸器构造) 和超微结构特征 ( 具传递细胞的壁内突结构) ，早期的胚柄细胞起为胚提供营养物质的作用，当 胚具有一定独立生长能力后，胚柄细胞成为多余结构而被抑制。到胚成熟时， 胚柄细胞已完全消失。因此胚柄细胞的死亡很可能是一种受胚发育控制的细胞程 序死亡过程m ，。 5 珠心细胞的p c d 研究 胚囊是由珠心细胞分化而来。在雌配子体的发育过程中，胚囊附近的珠心细 胞，持续地衰退和解体，为胚囊的发育提供养料。 对珠心细胞的p c d 研究开始较晚。1 9 8 5 年，尤瑞麟。”研究了小麦珠心细胞的 衰退过程的亚细胞结构，指出珠心细胞的衰退过程是遗传控制的细胞死亡。近年 来，国内对多种植物的珠心细胞的衰亡都进行了研究，包括甘薯。”，小麦。“1 ，非 洲狼尾草等”1 ，银杏“7 1 等。珠心细胞的衰退被明确为植物的细胞程序性死亡 ( p c d ) 3 4 o 对珠心细胞的p c d 研究已经成为近年来p c d 研究的热点之一。 离胚囊边缘一定距离并已经形成中央液泡的珠心细胞开始出现衰退现象珠 心细胞有两种不同的衰退方式，第一种是通过细胞质在原位自溶。细胞质中的核 糖体密度急剧下降细胞中到处可见被溶解的细胞组分的碎片，细胞核中的染色 质团块逐渐减少或染色质呈凝缩状。最后这类细胞成为紧贴胚囊边缘只剩下细胞 核残体或完全空瘪的死细胞。第二种细胞衰退方式是通过内质网增生，槽库膨大 及其对细胞组分的吞噬与分隔。同时内质网加厚，原生质对电子染料的亲和性加 强。最后质膜和液泡膜消失，原生质体收缩成一团暗黑色的“无结构”的物质。”。 田国伟等。”对小麦珠心细胞进行了a t p 酶的定位，不论是哪一种衰退方式，细胞 8 2 0 0 5 届中山大学硕士研究生论文 黄元 核染色质始终存在a t p 酶活性，并向胚囊方向转移这一研究为小麦珠心细胞的 衰亡是p c d 提供了细胞化学方面的依据。 韦存虚等洲考察了c 酽+ 与珠心p c d 的相关性，认为c 矿在珠心细胞的p c d 中有 诱导作用。 d o m e n g u e z 等啪1 检测了在麦粒的母系组织( m a t e r n a lt i s s u e ) 中的p c d 现象。 在开花前5 2 0 天的麦粒，其d n a 电泳条带有d n al a d d e r i n g 现象出现。这表明 在母系组织中而不是在胚乳中有核小体的核d n a 片段。在谷粒发育中期的珠心 p r o j e c t i o n 细胞( n u c e l l u sp r o j e c t i o nc e l l ) 中的t u n e l 分析显阳性。透射 电镜下可见，在p c d 初期，细胞质片断出现，核膜( n u c l e a re n v e l o p e ) 扩大， 液泡形成，异染色质内容物( c o n t e n to fh e t e r o c h r o m a t i n ) 增加。后期可观察到 细胞溶胶核细胞器的降解，细胞膜瓦解。然而，高尔基体仍保持完整，在细胞死 亡的最终阶段仍明显保持活力。 6 此外，在自交不亲和植物中，花粉管发生细胞程序性死亡，以预防自体受精， 从而确保杂交繁殖，使后代具有较高的生活力。在谷类作物中，糊粉层和胚乳发 生细胞程序性死亡，为胚提供营养物质“”。 1 2 5p c d 的意义 植物p c d 的生物学意义主要表现为以下5 个方面：( 1 ) 植物p c d 能消除那些 已完成其使命的或已不需要的细胞或组织如胚柄、糊粉层等，以有利于其它组织 或器官的生长发育。( 2 ) 植物在发育过程中，通过p c d 使某些细胞或组织能执行 新的功能，有利于植物的进一步生长发育。如筛管分子( t r a c h e a r ye l e m e n t ，t e ) 的分化、通气组织的形成等。( 3 ) 植物为避免病原体的进一步侵入，使某些特定 的细胞或组织进行p c d 如h r ，使植物个体产生系统获得性抗病( s y s t e m i c a c q u i r e dr e s i s t e n c e ，s a r ) 。( 4 ) 某些组织或器官如种皮和心皮等进行p c d ，以 阻止病原体通过衰老器官感染活器官。( 5 ) 为度过外界的不良环境如高盐、低温 和水涝等，使某些细胞、组织或器官进行p c d “。 1 3 p c d 的执行者一蛋白酶 蛋白水解是一种需要蛋白质加工和降解的重要代谢过程在植物中，植物细 胞蛋白酶可以降解贮藏蛋白，并在细胞程序性死亡中起到重要作用。在萌发过程 9 s a p i n 2 a 过量表达转基因龙葵胚珠及胚胎发育的研究 中，蛋白酶介导了把氮转入生物合成途径的储存蛋白的降解这些酶也同一些发 育过程有关，并且也是植物和其它有机体的相互作用的重要成分。蛋白酶在疾病 感染中有重要作用，而且，它也在食草性动物对植物蛋白的消化中起重要作用因 此，细胞蛋白酶执行的蛋白水解不论是在植物的细胞内还是细胞外的调控中，都 有着至关重要的作用“”。 蛋白酶在细胞程序性死亡中起到重要作用m 1 。对无脊椎动物和其它多细胞动 物模型的研究表明，半胱天冬酶( c a s p a s e ) 、丝氨酸蛋白酶等酶类特异性地作用 于天冬氨酸残基，降解靶蛋白，在动物体内充当了细胞死亡的主要执行者。“。 这些蛋白酶不仅涉及在细胞凋亡的初期，还在细胞凋亡的信号转导和执行阶段起 作用。一些决定细胞形态的重要蛋白被这些蛋白酶所剪切，例如，多聚二磷酸腺 营核糖聚合酶( p o l y ( a d p r i b o s e ) p o l y m e r a s e ，p a r p ) ，层连蛋白( 1 a m i n s ) ，溶 胶蛋白( g e l s o l i n ) 等啪1 。这些重要的蛋白的破坏，直接导致了从p c d 早期到晚 期的细胞形态的一系列变化。半胱天冬酶激活的d n a 酶( c a p a s e a c t i v a t e d d n a a s e ，c a d ) 的活性被抑制蛋白i c a d ( i n h i b i t o ro fc a d ) 所抑制，当i c a d 被 半胱天冬酶所剪切以后，c a d 的激活特异性地导致了基因组d n a 核小体间剪切这 一典型的凋亡特征“”。 在动物体内，半胱天冬酶在细胞凋亡中起到保守的调控作用( c o n s e r v e d r e g u l a t o r ) ，其活性的变化已被作为细胞程序性死亡的主要指标之一。在植物中， p c d 的主要执行者的身份一直模糊不清，然而近年来，对抑制剂的分子研究和一 些生化研究表明，半胱天冬酶样蛋白酶参与了植物细胞凋亡的调控m 1 。在许多模 式植物中，半胱天冬酶已被是p c d 第一个执行者。而且，线粒体和活性氧族 ( r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ，r o s ) 可能组成了一种动植物中普遍存在的细胞死 亡活性通路m 1 。 也有一些报道表明，丝氨酸蛋白酶在细胞凋亡中起到调控作用。在动物的肿 瘤细胞“”，免疫细胞呻1 ，神经细胞的等不同类型细胞的凋亡机制中，均发现了 丝氨酸蛋白酶的参与。在未成熟t 细胞中，三种内源丝氨酸蛋白酶抑制剂能抑制 地塞米松和替尼泊苷( t e n i p o s i d e ) u m 一2 6 诱导的细胞凋亡中的核小体片断化。 这表明内源丝氨酸蛋白酶参与了细胞凋亡过程1 。在猪粒层细胞的凋亡中也有证 据支持丝氨酸蛋白酶的参与呻1 。在人白血病细胞中，利用荧光标记的抑制剂对丝 1 0 2 0 0 5 届中山大学硕士研究生论文 黄元 氨酸蛋白酶活性中心的抑制，在一种核糖核酸酶细胞毒素o n c o n a s e 诱导的细胞 凋亡中，观察到胰凝乳蛋白酶样丝氨酸蛋白酶活性的参与m 1 。最近的研究表明， 丝氨酸蛋白酶和丝氨酸蛋白酶抑制剂在神经细胞的发育和病理反应中起调控作 用。丝氨酸蛋白酶可能有助于神经细胞的死亡，用基因敲除或者抑制剂处理的方 法对丝氨酸蛋白酶的抑制，可以对神经细胞起保护作用“”。虽是单细胞动物，酵 母在环境压力下也会发生基因调控的有序的细胞死亡。一些证据表明，丝氨酸蛋 白酶参与了酵母细胞凋亡的调控嘲1 。 1 4 蛋白酶抑制剂i i 的研究概况 在生物体内部的蛋白酶是受到严格调控的。细胞蛋白酶在p c d 中的调控，主 要来自三个不同的水平：转录水平、转录后加工和特异性蛋自酶抑制剂的作用。 植物中有大量的蛋白酶抑制荆积累。目前所知的植物蛋白酶抑制剂的作用主要是 在抗病虫害方面。然而，也有一些报道证实，蛋白酶抑制剂在植物p c d 中起调控 作用嘲。