（细胞生物学专业论文）铜胁迫对紫鸭跖草生长发育的影响.pdf

四川师范大学硕士论文 铜胁迫对紫鸭跖草生长发育的影响 细胞生物学专业 研究生苟静宜指导教师宗浩 摘要近年来，由重金属污染引起的环境问题已引起人们的广泛关注。 铜是植物生长发育的必须元素，在植物的生长发育过程中起着重要作用，但 是当土壤中铜含量过量时又会对植物造成伤害。本次实验以紫鸭跖草作为实 验材料，结合室内盆栽试验，分别探讨了不同浓度c u 2 + 和含不同比例的铜尾 矿对紫鸭跖草生长发育的影响，进一步研究紫鸭跖草在铜胁迫下的毒害反应， 整个实验结果得出以下结论： 1 、低浓度的c u 2 + 胁迫对紫鸭跖草的毒害不明显，且对紫鸭跖草的生长 有一定的促进作用，与对照相比，株高、生物量均有所增加，随着c u 2 + 处理 浓度的逐渐增大，紫鸭跖草的生长受到一定抑制，高浓度的c u 2 + 胁迫下，紫 鸭跖草生长缓慢，受铜伤害的症状较严重。 2 、土培盆栽实验条件下，低浓度的c u 2 + 对紫鸭跖草的毒害不明显，2 0 0 m g k g c u 2 + 胁迫对紫鸭跖草的叶绿素含量有轻微促进作用，随着处理浓度的增 大，紫鸭跖草叶绿体功能受得破坏，叶绿素含量逐渐降低，m d a 及脯氨酸 含量随着c u 2 + 处理浓度的增大而降低，紫鸭跖草s o d 活性随着铜处理浓度的 增大表现出先上升后下降的趋势，p o d 活性、c a t 活性总体上呈上升趋势， 当s o d 活性被抑制时，p o d 、c a t 活性仍然被激活。 3 、铜尾矿土对照实验：将铜尾矿沙与无污染物土按t a 0 ( 1 0 0 土壤，对 照) 、t a 2 5 ( 2 5 尾矿土+ 7 5 土壤) 、t a 5 0 ( 5 0 尾矿土+ 5 0 土壤) 、t a 7 5 ( 7 5 尾 矿土+ 2 5 土壤) 、t a l 0 0 ( 1 0 0 尾矿土) 5 个处理充分混合，进行盆栽试验，分别 测定各处理组的株高、生物量、叶绿素含量、丙二醛含量、s o d 活性、游离脯 氨酸、可溶性蛋白、可溶性糖含量等生理指标。盆栽实验结果表明，紫鸭跖 铜胁迫对紫鸭趾草生长发育的影响 草能在铜尾矿上生长，但是在高铜尾矿胁迫下，紫鸭跖草叶片各项生理指标 都受到不同程度的影响，表明铜尾矿中的重金属铜对紫鸭跖草具有毒害作用， 通过实验得出，重金属铜的毒害和尾矿的极端贫瘠是影响紫鸭跖草生长的2 个重要原因，在尾矿中加入2 5 体积比的无污染土壤，毒害作用可以得到一 定程度的缓解。 本研究结果表明紫鸭跖草在c u 2 + 和铜尾矿胁迫下可以在正常生长，在尾 矿中附加一定比例的无污染土壤进行人工种植紫鸭跖草进行植被修复。可为 矿业废弃地的生态恢复及土壤改良提供参考价值及科学依据。 关键词c u 2 + 紫鸭跖草生长发育 u c o p p e r s t r e s so np u r p u r e ag r o w t ha n dd e v e l o p m e n t m a j o r ：c e l lb i o l o g y m a s t e ro f s c i e n e ec a n d i d a t e ：g o uj i n g - y i s u p e r v i s o r ：z o n gh a o a b s t r a c ti nr e c e n ty e a r s ，h e a v ym e t a lp o l l u t i o n o ft h ee n v i r o n m e n th a s a 由 r a c t e dw i d ea t t e n t i o n c o p p e ri se s s e n t i a le l e m e n tf o rp l a n tg r o w t h ，p l a n tg r o w t h a n dd e v e l o p m e n tp l a ya ni m p o r t a n tr o l e ，b u tw h e nt h ec o p p e rc o n t e n t i ns o i lo v e r s h i y o uw i l lh a r mp l a n t s t h ee x p e r i m e n t ，s p u r p u r e aa se x p e r i m e n t a lm a t e r l a l ， c o m b i n e dw i t hi n d o o rp o te x p e r i m e n tw e r eo f d i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n so fc u a n d w i t hd i f f e r e n tp r o p o r t i o n so fc o p p e rm i n et a i l i n g s o np u r p u r e ag r o w t ha n o d e v e l o p m e n t ，f u r t h e r r e s e a r c hp u r p u r e au n d e rc o p p e rs t r e s sp o i s o nu n d e rt h e r e a c t i o n ，t h ee x p e r i m e n t a lr e s u l t st h ef o l l o w i n gc o n c l u s i o n s ： 1 1 0 wc o n c e n t r a t i o no fc u 2 + s t r e s so np u r p u r e ap o i s o n i n gi s n o to b v i o u s ，a n d o nt h eg r o w t ho fs p u r p u r e ah a v eac e r t a i nr o l ei np r o m o t i n g ，c o m p a r e dw i t ht h e c o n t r 0 1 ，p l a n th e i g h t ，b i o m a s si n c r e a s e d ，b u tt h ed i f f e r e n c e w a sn o ts i g n i f i c a n tw i t h t h ei n c r e a s eo fc u 2 + c o n c e n t r a t i o n ，t h eg r o w t ho fs p u r p u r e aw a si n h i b i t e d ，h i g h c o n c e n t r a t i o n so fc u 2 + s t r e s sp u r p u r e as l o wg r o w t h ，am o r e s e r i o u si n ju r y 2 s o i lc u l t u r ep o te x p e r i m e n tc o n d i t i o n s ，t h el o wc o n c e n t r a t i o no fc o p p e r p o i s o n i n gi ns p u r p u r e a i sn o to b v i o u s ，5 0m g k g c u z s t r e s so np u r p u r e a c h l o r o p h y l l c o n t e n t s l i g h t l yp r o m o t e d w i t hi n c r e a s i n gc o n c e n t r a t i o n ，p u r p i e c o m m e l i n aw a sd e s t r o y e db yc h l o r o p l a s tf u n c t i o n ，d e c r e a s e dc h l o r o p h y l lc o n t e n t ， m d aa n dp r o l i n ec o n t e n ti n c r e a s e dw i t hi n c r e a s i n gc 矿。c o n c e n t r a t i o nd e c r e a s e s p u r p u r e as o da c t i v i t yi n c r e a s e dw i t ht h ec o n c e n t r a t i o no fc u s h o w e di n c r e a s e d a n dt h e nd e c r e a s e dt r e n d ，p o da c t i v i t y , c a ta c t i v i t yi ng e n e r a li sr i s i n g ，w h e n i i i s u d a c t i v l t yw a si n h i b i t e dw h e n ，p o d ，c a t a c t i v i t yi ss t i 】la c t i v e j c o p p e r t a i l i 麟g s o i lc o n t r o l l e de x p e r i m e n t ：t h ec o p p e r t a i l i n g ss a n da n ds o i l p o l l u 2 1 0 n 。眠b yt a 00 0 0 s o i l ，c o n t r 0 1 ) ，t a 2 5 ( 2 5 t a i l i n g s 十7 5 s o i ls m i a 5 0 ( 5 0 a i l i n g ss o i l + 5 0 o ft h es o i l ) ，t a 7 5 ( 7 5 t a i l i n g s + 2 5 s o i ls o i l ) , i a10 0 ( 1 0 0 t a i l i n g ss o i l ) t of u l l ym i x e d ，t h ep o te x p e r i m e n t ，e a c ht r e a t m e n t g r o u pw e r em e a s u r e di n b i o m a s s ，c h l o r o p h y l lc o n t e n t ，m a l o n d i a l d e h y d ec o n t e n t , s o da c t l v l t y , f r e e p r o l i n e ，s o l u b l e p r o t e i n ，s o l u b l es u g a rc o n t e n ta n do t h e r p h y s l 0 1 0 9 i c a l 础c a t o r s ap o te x p e r i m e n t ，t h er e s u l t s i n d i c a t et h a ts p u r p u r e a g r o w l n go nt h et a i l i n g s ，b u tt a i l i n g ss t r e s s ，l e a v e so f s p u 印u r e ai np h y s i 0 1 0 9 y h a v eb e e na 胝t e d ，t h a tc o p p e rh a so n p u r p u r e ap o i s o n i n ge f f e c t 懈o b t a i n e db y e x p e n m e n t s ，h e a v ym e t a lt o x i c i t ya n dc o p p e rr a i l i n g se x t r e m ei n f e r t i l i 七y 0 ft h e 伊。叭ho fs p u 叩u r e at w oi m p o r t a n tr e a s o n s ，i na d d i t i o no f 2 5 o ft h ev o l u m eo f 伽i m g st h a l lt h ep o l l u t i o no fs o i l ，c a nb et o x i ct os o m e e x t e n tm i t i g a t i o n t h er e s u l t ss h o w e dt h a ts p u r p u r e aa n d c o p p e rm i n et a i l i n g si nt h ec u 2 + s t r e s si n n o m a l 黟。叭h ，i nac e r t a i np e r c e n t a g eo fa d d i t i o n a l t a i l i n g sp o l l u t i n gs o i l s c u j t i v a t e ds p u r p u r e av e g e t a t i o nr e s t o r a t i o n f o r e c o l o g i c a lr e s t o r a t i o no fm i l l i n g w a s t et os o i ll m p r o v e m e n ta n d p r o v i d er e f e r e n c ev a l u ea n ds c i e n t i f f cb a s i s k e y w o r d s ：c u 2 + p u r p u r e ag r o w t ha n dd e v e l o p m e n t 四川师范大学学位论文独创性及 使用授权声明 本人声明：所呈交学位论文，是本人在导师塞浩指导下， 独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不 含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品或成果。对本文的研究做出 重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律结果由 本人承担。 本人承诺：已提交的学位论文电子版与论文纸本的内容一致。如因不符 而引起的学术声誉上的损失由本人自负。 本人同意所撰写学位论文的使用授权遵照学校的管理规定： 学校作为申请学位的条件之一，学位论文著作权拥有者须授权所在大学 拥有学位论文的部分使用权，即：1 ) 已获学位的研究生必须按学校规定提 交印刷版和电子版学位论文，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数 据库供检索；2 ) 为教学、科研和学术交流目的，学校可以将公开的学位论 文或解密后的学位论文作为资料在图书馆、资料室等场所或在有关网络上供 阅读、浏览。 本人授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到中国学位论 文全文数据库，并通过网络向社会公众提供信息服务。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：撕鸟 导师签名： 签字日期：别1 年弓月虺日 签字日期：驯年岁月西日 四川师范大学硕士论文 1 引言 随着人类活动的频繁，环境污染问题日益加剧，对人类的生产和生活造 成了很大的影响，在环境污染源中，重金属污染是土壤污染的重要方面，尤 其是矿区重金属污染破坏作用更加明显，已成为全球面临的环境问题，引起 各国的广泛关注，重金属具有显著的生物毒性，重金属污染会导致土壤的正 常结构发生变化，其污染具有隐蔽性、可在生物体内富集、和后果严重等特 点。通过各种途径及植物一土壤途径进入土壤，对土壤造成更大的污染。 重金属一旦进入土壤，不易随水流失，很难被微生物降解，尤其是不易 被清除和治理，铜是植物生长发育代谢过程中必需的微量元素。在植物光合 作用过程中，铜是酶蛋白的重要组成部分，对电子传递链起着重要作用，在 重金属污染土壤中，铜容易引起富集，铜容易被农作物吸收，少量的铜 对植物的生长发育不会有太大的影响，有定的促进作用，但是，当土壤 中重金属含量超标、植物受到胁迫时，其生长发育就会受到影响。 随着我国经济的不断发展，城市化过程不断加剧，由此引起铜矿开采的 企业越来越多，引起许多的环境问题，我国铜尾矿污染的问题也日趋严重。 矿产资源是人类生存和发展的重要物质来源之一，对我国的经济发展起着重 要作用，矿产资源的加工利用和开采、冶炼是尾矿土壤重金属污染的主要来 源，随着矿产的开发，利用尾矿地带的环境污染也不容乐观，治理难度不断 加大，目前，有关铜对植物生长发育的危害的研究主要集中在植物的外部特 征、物质代谢、遗传分化等方面的报道，但是对尾矿对植物的影响这方面的 研究不是很多，尤其是观赏植物在尾矿污染胁迫下生长发育影响研究还不多。 紫鸭跖草，鸭跖草科一年生草本植物，茎多分枝，带肉质，紫红色， 下部匍匐状，节上常生须根，上部近于直立。叶互生，披针形，种子呈 三棱状半圆形，汉棕色，花期夏秋。多栽培于庭园。由于重金属铜等离 子胁迫的影响，许多植物难以正常生长，但紫鸭跖草植物可以在铜矿区 等和铜污染土壤正常生长，虽然对紫鸭跖草对铜的富集和铜污染土壤的 修复作用有了一定的认识，但有关铜尾矿对紫鸭跖草的影响研究鲜有报 道研究， 铜胁迫对紫鸭趾草生长发育的影响 本文以紫鸭跖草为实验材料，采用盆栽实验和铜尾矿对照实验研究 了不同浓度重金属铜处理下，紫鸭跖草幼苗生长发育及生理特性的影响， 为紫鸭跖草用于同矿区及铜污染地区的植被修复提供理论依据和实践经 验。 2 四j t tq o 范大学硕士论文 2 材料与方法 2 1 铜尾矿对照实验 2 1 1 实验材料 本次实验对照正常土壤由成都市三圣乡花卉市场提供，污染铜尾矿沙采 自彭州市白水河矿区表层，供试植株紫鸭跖草幼苗采自四js 1 1 ) i t i 范大学狮子山 校区校园内。尾矿自然风干，过2 n m 筛。 2 1 2 实验仪器及实验试剂 仪器：e s j 2 0 5 4 电子天平、7 5 5 b 紫外分光光度计、恒温水浴锅、 h p g 2 8 0 b x 光照恒温培养箱、0 4 1 2 1 型离心机、漏斗及其它玻璃仪器。 试剂：碳酸钙、核黄素，硫代巴比妥酸( t b a ) 、氮兰四唑( n b t ) 、愈创 木酚、三氯乙酸( t c a ) 、石英砂、乙醇、牛血清蛋白、乙酸乙脂、双氧水、 考马斯亮蓝g 2 5 0 等( 试剂为分析纯，购于成都市长征化学试剂公司) 。 2 1 3 实验方法 实验方法参照田胜尼【l 】等进行，盆栽实验在四川师范大学实验室内进行， 本次实验共设5 个处理即t a o ( 1 0 0 土壤，对照) 、t a 2 5 ( 2 5 尾矿土+ 7 5 土壤) 、 t a 5 0 ( 5 0 尾矿土+ 5 0 土壤) 、t a 7 5 ( 7 5 尾矿土+ 2 5 土壤) 、t a l 0 0 ( 1 0 0 尾矿 土) ，以上处理按正常土壤和尾矿以不同体积比充分混合，装盆( 1 8 2 0 c m ) ，每 盆2 5 娃，平行样n = 3 重复，平衡一周。 将采集的幼苗植物带回实验室，用自来水将植株清洗干净，置于预先装 土的盆钵中培养，约3 个月后，采集样品进行测定。 对紫鸭跖草的各项生理指标进行测定，其方法主要参照张志良，翟伟箐 所著植物生理学实验指导( 第3 版) 1 2 j 。 2 1 3 1 紫鸭跖草生物量的测定 约3 个月以后，将紫鸭跖草植株收割，分成地上和地下部分两部分测定， 铜胁迫对紫鸭趾草生长发育的影响 烘干，称重。单位：( g ) 2 1 3 2 叶绿素的测定 ( 1 ) 取新鲜植物样品紫鸭跖草叶片，将植物组织表面污物擦净。 ( 2 ) 准确称取新鲜o 5 9 植物样品紫鸭跖草，剪碎，混匀，平行样，n = 3 ， 分别置于研钵中，加碳酸钙粉，少量石英砂，及9 5 的乙醇2 m l ，研磨至匀 浆，再加1 0 m l 乙醇，继续研磨至组织变白，静置3 至5 m i n 。 ( 3 ) 将滤纸置于漏斗，用乙醇湿润滤纸，提取液倒入漏斗中，过滤至2 5m l 棕色容量瓶中，避光保存，用乙醇冲洗研钵，最后连同残渣一起倒入漏斗中。 ( 4 ) 用滴管吸取乙醇，将残渣一起倒入棕色容量瓶，最后用乙醇定容至 2 5m l 棕色容量瓶，混匀，避光保存。 ( 5 ) 把提取液倒入比色皿，在6 6 5 n m 、6 4 9 n m 波长下测定其吸光度。以 9 5 的乙醇为空白对照。 叶绿素a = 12 9 5 a 6 6 5 6 8 8 氏4 9 叶绿素b = 2 4 9 6a 6 4 9 7 3 2 氏6 5 。 求得色素的质量浓度后，按下式计算，即a 的质量分数( m g g ) = v c n w c 。为叶绿素a 的浓度；c 。为叶绿素b 的浓度；心。、a 。、a 。，。分别为叶绿素 色素提取液在波长6 6 5 n m 、6 4 9 n m 和4 7 0 n m 处的吸光度；c 为色素含量，m g l ； v 为提取液体积，m l ；n 为稀释倍数；w 为样品鲜质量，g 。 2 1 3 3m d a ( 丙二醛) 含量的测定 ( 1 ) 取新鲜紫鸭跖草植株上不同部位的叶片，将样品表面洗净擦干，剪碎， 混匀。 ( 2 ) 准确称取o 5 9 新鲜紫鸭跖草样品，平行样n = 3 ，放入冰浴的研钵。加 入少量石英砂和2 m l0 6 7 硫代巴比妥酸( t b a ) ，研磨至匀浆，转入至试管， 继续加入三氯乙酸( t c a ) 3 m l 并研磨至匀浆，合并提取液。 ( 3 ) 在提取液中加入加硫代巴比妥酸( t b a ) 2 m l 溶液，充分摇匀。 ( 4 ) 将试管放入沸水中，煮沸1 5 m i n ，( 自试管中出现小气泡时开始计时) ， 1 5 m i n 以后，立即取出试管并迅速放入冷水浴中。 ( 5 ) 待试管溶液冷却以后，离心，取上清液，分别在4 5 0 n m 、5 3 2 n m 及6 0 0 n m 波长下测定其吸光值，用蒸馏水为空白对照。 4 p l j 川师范人学硕士论文 计算结果：c = 6 4 5 ( o d 5 3 2 - o d 6 0 0 ) 一0 5 6 0 1 ) 4 5 0 m d a 质量摩尔浓度( u m o l g ) = c n w 2 1 3 4 超氧化物岐化酶活性的测定 ( 1 ) 制取酶液：先将研钵预冷，准确称取0 5 9 新鲜植物紫鸭跖草样品，剪 碎，混匀，平行样n = 3 ，至于研钵中，研磨至匀浆，得匀浆，定容至5 m l ，在 4 0 0 0 r m i n 下离心1 0 分钟，上清液为所需酶液，即s o d 酶液。 ( 2 ) 反应：取4 支试管，清洗干净，要求透明度好，其中2 支管为测定，2 支管作为空白对照，加入反应液，充分混和，将其中1 支对照管罩上黑色纸， 用以遮光，并于4 0 0 0 i x 光照强度下反应2 0 m i n 后，以遮光的对照管作为空白 比对，分别测定其它各管的吸光值。 ( 3 ) 超氧化物岐化酶( s o d ) 活性的测定与计算： s o d 总活性( u g ) = vx ( a o _ a 。) ( 1 2 x w x a o x v t ) v 为样品液总体积m l ；a o 为光照对照管的光密度；钆为样品管的光密 度；w 为样品鲜质量g ，v 。为测定时样品用量m l 。 2 1 3 5 过氧化物酶活性的测定 ( 1 ) 制备酶液：准确称取o 5 9 新鲜紫鸭跖草样品，剪碎，混匀，平行样 n = 3 ，研磨至匀浆，在4 0 0 0 r m i n 离心1 0 m i n ，取上清液，备用。 ( 2 ) p o d 活性测定：将预先准备的试管清洗干净，分别加入2 9 m l 的磷 酸缓冲液，再依次加过氧化氢溶液1m l ，o 0 5 m o l l 愈创木酚溶液1m l 以及 酶液o 1 m l 。用煮死的酶液为对照，各体系加入酶液后，置于3 70 c 恒温水浴 中，保温1 5 m i n ，然后迅速冰浴，于4 7 0 n m 波长下比色，测定其吸光值。 ( 3 ) 计算： p o d 活性 u ( g m i n ) 】- ( v t x 出k 7 0 ) ( v s x 0 0 1x t x w ) v ，为提取酶液总体积，m l ；a a 4 7 0 为反应时间内吸光度的变化；t 为反应 时间，m i n ；v s 为测定时取用酶液总体积，m l ，t 为反应时间，m i n ；w 为材料 鲜质量，g 。 2 1 3 6 脯氨酸含量的测定 ( 1 ) 标准曲线制作 取7 支具塞刻度试管按表2 1 加入各试剂。混匀后在沸水中加热3 0 m i n 。 铜胁迫对紫鸭趾草生长发育的影响 取出冷却后向各管加入5 m l 甲苯，振荡3 0 m i n ，静置，转移色素，待分 层后用注射器吸取上层脯氨酸甲苯溶液，在波长5 2 0 n m 处比色，以0 号管为 空白对照。 以吸光值为纵坐标，脯氨酸质量为横坐标，绘制标准曲线，求线形回 归方程。 ( 2 ) 提取脯氨酸取新鲜紫鸭跖草叶片0 5 9 ，加5 m l3 的磺基水杨酸，研 磨提取，匀浆液转入带塞试管中，沸水浴l o m i n ( 经常摇晃) ，冷却后以 3 0 0 0 r m i n 1 离心l o m i n ，取上清液待测。 ( 3 ) 取上清液2 m l ，加2 m l 冰乙酸和3 m l 显色液，于沸水浴中加热3 0 m i n ， 溶液变红，冷却后加入4 m l 甲苯，静置，取上清液3 0 0 0 r m i n 1 离心5 m i n ，在 波长5 2 0 n m 处比色，以甲苯为空白对照。 ( 4 ) 计算。从标准曲线中查出测定液中脯氨酸的质量，按下式计算样品中 脯氨酸干重或鲜重的质量分数。 样品中脯氨酸的质量分数( u g g 。1 ) - - ( c v ) ( a w ) 。 式中c 提取液中脯氨酸的质量( u g ) ，由标准曲线求得； v 一提取液总体积( m 1 ) ； a - 一测定时所吸取的体积( m 1 ) ； w - 一样品重( g ) 。 6 四川师范大学硕士论文 2 1 3 。7 可溶性蛋白含量的测定 ( 1 ) 制作标准曲线 将牛血清蛋白分别稀释成1 0 0 、8 0 、6 0 、4 0 、2 0 、0 嵋m l 一，准确吸取所 配各管溶液l m l ，加5 m l 考马斯亮蓝g 2 5 0 混匀，静置2 m i n 后，在波长为 5 9 5 n m 下比色，测定o d 值。以蛋白质浓度为横坐标，吸光值为纵坐标绘制 蛋白质含量标准曲线。 ( 2 ) 样品提取液中蛋白质浓度的测定 准确称取新鲜样品0 5 9 叶片，加2 m l 蒸馏水，少量石英砂，研磨，4 0 0 0 r m i n 离心2 0 m i n ，取上清液l m l ，加5m l 考马斯亮蓝，混匀，放置2 m i n ，在波 长5 9 5 n m 下测定吸光值，通过标准曲线查得相应浓度计算叶片中可溶性蛋白 质浓度( g g m l 。) ，以蒸馏水为空白对照。 样品蛋白质含量( 1 ag g 1 鲜重) = c x v w c 为查标准曲线所得的每管蛋白质浓度，岭m l ；v 为提取液总体积， m l ；w 为样品质量，g 。 2 1 3 8 可溶性糖含量的测定 ( 1 ) 制作标准曲线 精确配置浓度分别为0 、1 0 、2 0 、3 0 、4 0 和5 0 r t g m l 的葡萄糖系列液， 各取1 0 m l ，加5 m l 蒽酮试剂和5 m l ，沸水浴1 0 m i n ，冷却，静置，6 3 0 n m 波长处测吸光值，以糖含量为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，以上 操作各重复3 次。求出标准线性方程。 ( 2 ) 样品中可溶性糖含量的测定 取样品材料o 3 9 剪碎混匀，各3 次重复。分别加1 0 m l 蒸馏水，用塑料 薄膜封口，沸水浴3 0 m i n ，提取液过滤后定容至2 5 m l 。吸取样品提取液o 5 m l 于2 0 m l 刻度试管中( 重复3 次) ，加蒸馏水1 5 m l ，以下步骤同( 1 ) ，测定 样品吸光度。 可溶性糖含量( ) = c v r n 1 0 0 ( w v s l 0 6 ) c 为从标准曲线查得的可溶性糖含量，g g ：v x 为提取液总体积，m l ：v s 为测定用的样品提取液体积，m l ：n 为稀释倍数；w 为样品质量，g 。 7 铜胁迫对紫鸭趾草生长发育的影响 2 2 盆栽实验及生理指标的测定 2 2 1 实验材料 供试植株紫鸭跖幼苗采自四川i 师范大学校园内。将供试植株带回实验室 冲洗干净，盆栽试验的土壤来自四川师范大学表层土，为栽培土，土壤背景 值为：有机质1 1 3 2g k g 一，p h 7 2 ，全氮1 7 8g k g 一，全磷0 7 4g k g 一， 铜2 0 5 0m g k g ，( 不考虑土壤自身重金属含量) 【3 1 。见表i 。 表1 四川师范大学田园土理化性质 t a b1 s o i lp h y s i c a la n dc h e m i c a lp r o p e r t i e s ，s i c h u a nn o r m a lu n i v e r s i t y , p a s t o r a l 供试土壤采自四川师范大学成龙校区表层土壤，自然风干，过筛，重金 属污染土壤铜浓度处理依次设为以下几六组0m g k g 、2 0 0m g k g 、4 0 0m g k g 、 8 0 0m g k g ，1 2 0 0m g k g ，1 5 0 0m g k 9 1 ，作为模拟污染土壤的不同浓度，硫酸 铜以水溶液的形式加入正常土壤，充分混匀，将污染土壤与正常土壤装盆 ( 1 8 c m * 2 0 c m ) ，每盆2 5 埏，平行样n = 3 ，重金属污染土壤和正常土壤均平衡一 周，每盆载紫鸭跖草植株幼苗5 株，紫鸭跖草幼苗株高和生物量基本相当， 于实验室内进行正常培养，培养初期，每天用自来水浇灌植物幼苗，以后每 隔一周灌溉一次，使土壤保持充足水分以保证植株幼苗能正常生长发育。约3 个月后采集紫鸭跖草植株进行各项生理指标的测定。以不加重金属的正常土 壤为空白对照。 2 2 2 实验仪器和试剂 实验仪器：e s j 2 0 5 4 电子天平、7 5 5 b 紫外分光光度计、恒温水浴锅、 四) j i n 范大学硕士论文 h p g 一2 8 0 b x 光照恒温培养箱、0 4 1 2 1 型离心机、漏斗、其它玻璃仪器等。 实验试剂：碳酸钙、硫酸铜、核黄素，硫代巴比妥酸( t b a ) 、氮兰四唑 ( n b t ) 、硝酸铅、酸铅愈创木酚、三氯乙酸( t c a ) 、石英砂、乙醇、牛血清 蛋白、乙酸乙脂、过氧化氢、考马斯亮蓝g 2 5 0 等( 试剂均为分析纯，购于成 都长征化学试剂公司) 。 2 2 3 实验方法 本次盆栽实验于6 月中旬进行，采集样品，对各生理指标( 株高、生物量、 叶绿素、丙二醛、超氧化物歧化酶、过氧化物酶、过氧化镁) 进行测定，测定 指标与方法同铜尾矿对照实验。 2 3 数据统计与分析 本次实验数据均采用e x c e l 及s p s s l 3 0 软件进行分析，结果均为平行样， 3 次重复的平均值。 9 铜胁迫对紫鸭趾草生长发育的影响 3 结果与分析 3 1 铜尾矿沙重金属含量 对四川彭州铜尾矿沙的重金属含量分析表明：该尾矿矿沙中除n i 和z n 外， c u 、p b 、c d 的全量( 表3 ) 均已超过中华人民共和国国家标准土壤环境质 量标准( g b l 5 6 1 8 1 9 9 5 ) - - - 类标准( 附录2 ) ，即已超过农林业生产和植物正 常生长的土壤临界值。对该地区的水源和土壤造成严重污染，对动、植物的 生长和人类健康造成危害。必须对其进行一定的改良，以减少其危害。重金 属在土壤中一般以多种形态存在，不同的化学形态对植物的有效性不同。土 壤中可被植物所吸收的金属元素很大程度上来源于土壤溶液，而与土壤颗粒 物紧密结合的部分一般是不能为植物所利用。重金属生物有效态是指能被该 土地上生存的生物( 通常为植物) 所吸收的那部分重金属。所以对植物产生 毒性的重金属，主要是有效态。本实验中，铜的有效态高达2 9 0 m g k g ，远超 过顾国平等测得的浙江四个地区蔬菜地土壤中以n h a o a c 为提取剂的有效态 含量( o 2 6 2 2 7 m g k g ) ，其它重金属的有效态含量也均超过这些蔬菜地的最 高值。说明该尾矿中的重金属污染极为严重，将会影响植物的正常发育p 引。 表2 铜尾矿沙重金属全量与有效态 t a b l e2c o n t e n to fh e a v ym e t a li nc o p p e rt i l l i n g 3 2 铜尾矿对紫鸭跖草幼苗生长发育的影响 3 1 1 铜尾矿对紫鸭跖草株高和生物量的影响 幼苗栽种一周以后，从外观上看，各尾矿比例处理之间株高无明显差异， l o 四川师范大学硕士论文 3 0 d 后，株高开始出现变化，约3 个月后，t a 0 和t a 2 5 的处理之间无明显 差异，但高于其它各尾矿处理组，随着尾矿含量的增加，各处理组的株高明 显降低，在铜尾矿处理为t a 7 5 的处理表现出明显的递减趋势。 不同尾矿处理对紫鸭跖草生长的影响见表3 。由表3 可知，紫鸭跖草性 状如株高、根生物量、依次均为：t a 2 5 t a 0 t a 5 0 t a 7 5 t a l 0 0 ，差异 显著，这说明在低比例铜胁迫下，紫鸭跖草生长受到刺激，生长指标在一定 程度上会有提高，而高比例铜尾矿对植物生长有明显抑制作用。当用无污染 土壤与一定比例的尾矿混合时，紫鸭跖草生长有明显的改善，毒害作用得到 一定缓解，这一结果与l e e p 的观剧4 】相吻合。这对于紫鸭跖草用于废弃地 带尾矿污染土壤改良、植被修复等起到一定积极作用。 表3 铜尾矿对紫鸭跖草生物量的影响 t a b 3e f f e c t so f c o p p e rt i l l i n go np u r p l ec o m m e l i n ao f t r i f o l i u mr e p e n s 注：t a 0 - 1 0 0 土壤，对照，t a 2 5 2 5 尾矿+ 7 5 土壤，t a 5 0 5 0 尾矿+ 5 0 土壤，t a 7 5 7 5 尾矿+ 2 5 土壤，t a l 0 0 1 0 0 。同一列数据字母不同者表示差异显著p 0 0 5 。下同。 3 1 2 尾矿砂对紫鸭跖草光合作用的影晌 重金属铜是植物正常生长的微量元素之一，在重金属胁迫下，植物的光 合作用会受到抑制，同时，铜又是叶绿素的重要组成部分，叶绿体是植物进 行光合作用的重要场所，植物一旦受到重金属胁迫，叶绿体结构就会遭到破 坏，光合作用就会降低，对植物的生长造成一定的影响，c u 也是多种酶的重 要组成部分，比如，抗坏血酸氧化酶、多酚氧化酶、半乳糖氧化酶等，在植 铜胁迫对紫鸭趾草生长发育的影响 物体内进行氧化还原代谢过程以及光合作用的电子传递都需要铜的参与“1 。 表4 铜尾矿对紫鸭跖草叶绿素的影响 t a b 4e f f e c t so f c o p p e rt i l l i n go np u r p l ec o m m e l i n ao ft r i f o l i u mr e p e n s 注：1 a 0 1 0 0 土壤，对照，t a 2 5 2 5 尾矿+ 7 5 土壤，t a s 0 5 0 尾矿+ 5 0 土壤，t a 7 5 7 5 尾矿+ 2 5 土壤，t a l 0 0 1 0 0 从表4 可以看出，处理与对照组的叶绿素含量有显著差异，而尾矿对叶 绿素a b 的影响不大。从表4 可以看出，紫鸭跖草叶片叶绿素含量从无污染 到全尾矿处理呈现下降趋势，表明含铜尾矿渣能干扰紫鸭跖草叶片叶绿素合 成、降解等代谢途径，从而引起紫鸭跖草叶片失绿、叶绿素含量变化。这与 束文圣【5 】和秦天才【6 】等的研究结果一致，而在紫鸭跖草叶绿素a b 含量差异无 显著，与对照相比，t a 7 5 和t a l 0 0 处理叶绿素a f o 值差异显著除土壤中的重 金属对叶绿素a b 含量有影响之外，土壤营养条件等也会对紫鸭跖草叶绿素a b 含量有一些对影响。 3 1 3 尾矿砂对紫鸭跖草丙二醛( m d a ) 的影响 植物只有处于在正常生长环境的条件下，植物体内的活性氧的产生和清 除才能维持在一个平衡的稳定状态，一旦正常的环境遭到破坏，这种维持稳 定的平衡状态代谢系统就会被打破，尤其是当植物受到重金属胁迫时，就会 导致体内活性氧的增加，从而有利于活性氧的产生，对植物的正常生长产生 1 2 四川师范人学硕士论文 影响。 丙二醛( m d a ) 是植物膜脂过氧化的产物，活性氧增加导致一系列的活性氧 反应，能与植物体内的活性物质如蛋白质、核酸、氨基酸等发生反应形成不 溶性的沉积化合物，可干扰细胞的正常生理活动，活性氧的产物m d a 含量反 映膜脂受伤害的程度，m d a 产生的量越多，说明脂质过氧化程度越显著，通常 作为植物过氧化程度强弱一个重要的指标晦3 。 从图l 可以看出，紫鸭跖草叶片中m d a 含量随着铜尾矿含量的增加而增 大，这说明重金属含量越高，m d a 积累的越多，说明铜尾矿中的重金属对紫鸭 跖草膜结构和功能造成了一定的破坏，使其抗逆性降低。当尾矿含量为7 5 时，m d a 的含量明显下降，说明加入一定的无污染土壤有助于缓解重金属对紫 鸭跖草的危害。 垩 量 嬲 重 2 5 2 1 5 1 o 5 o 02 55 07 5 1 0 0 尾矿沙含量( ，v v ) 图1 铜尾矿对紫鸭跖草叶片丙二醛( m d a ) 含量的影响 f i g 1c o p p e rm i n et a i l i n g so nl e a v e so fs p u 印u m am a l o n d i a l d e h y d e ( m d a ) c o n t e n t 3 1 4 尾矿砂对紫鸭跖草( s o d ) 的影响 过氧化物酶( s o d ) 、过氧化氢酶( c a t ) 、超氧化物岐化酶( p o d ) 是植物体内 主要的抗氧酶，是植物抵抗外界逆境的主要屏障，保护细胞过氧化，从而避 免植物受到伤害，s o d 同时也是一种自由基，是植物体内清除活性氧自由基 铜胁迫对紫鸭趾草生长发育的影响 的重要酶类，植物受到尾矿的胁迫后，膜脂发生过氧化作用，体内积累大量 的自由基，细胞膜受损伤，正常的防御系统被破坏，植物的抗逆能力相应的 降低 5 1 。 由图2 可以看出，在本次实验中，在铜胁迫下的紫鸭跖草叶片的s o d 活 性随着铜尾矿比例的增加而增加。但是，当尾矿含量为7 5 时，s o d 值急剧下 降。出现这种变化，是因为尾矿沙中的重金属诱导s o d 产生过量的0 2 和h 2 0 2 ， 引起紫鸭跖草叶片受到伤害，使s o d 酶活性慢慢失活。 2 0 0 1 5 0 1 0 0 5 0 o 02 5 5 07 5 1 0 0 尾矿沙含量( ，v v ) 图2 铜尾矿对紫鸭跖草叶片( s o d ) 含量的影响 f i g 2c o p p e rm i n et a i l i n g so nl e a v e so fs p u r p u r e a ( s o d ) c o n t e n t 3 1 5 尾矿砂对紫鸭跖草( p o d ) 的影响 丛图3 可以看出，p o d 的含量随着尾矿的增加而增加，直至尾矿含量为7 5 ， p o d 活性几乎趋于平缓，增长缓慢出现这种变化这说明在尾矿污染中的重金属 对紫鸭跖草植株伤害不大，可能是尾矿中的重金属导致酶蛋白受到抑制，清 除膜脂过氧化，导致p o d 酶失活，p o d 的含量会出现变化，从而导致紫鸭跖草 正常生长受到伤害。 1 4 p l j 川师范人学硕士论文 0 尾矿沙含量( ，v v ) 图3铜尾矿对紫鸭跖草叶片( p o d ) 含量的影响 f i g 3c o p p e rm i n et a i l i n g so nl e a v e so fs p u r p u r e a ( p o d ) c o n t e n t 3 1 6 尾矿砂对紫鸭跖草叶片脯氨酸和可溶性糖含量的影响 脯氨酸是植物蛋白质的组分之一，是植物体内重要的渗透调节物质，并 以游离状态广泛存在于植物体中。在正常情况下植物体内游离脯氨酸含量 并不多，在干旱、盐渍、重金属毒害等逆境条件下胁迫下，许多植物体内脯 氨酸会大量积累。通过这一机制调节细胞内的渗透压，对膜和代谢功能具有 保护作用，避免酶受到直接伤害，增强植物体适应环境的能力。积累的脯氨 酸除了作为植物细胞质内渗透调节物质外，还在稳定生物大分子结构、 降低细胞酸性、解除氨毒等方面起重要作用，因此游离脯氨酸含量的变化 是反映逆境条件下植物受伤害程度的重要指标之一。 由图可知，随着铜尾矿沙比例的增加，紫鸭跖草叶片脯氨酸含量呈递增 趋势，呈显著的相关，与对照相比，在t a l 0 0 处理时紫鸭跖草叶片脯氨酸的 含量显著增加( 图4 ) 。 c u 5 月， 3 2 l n u 一比皇一旨o卜寸司一qo乱 铜胁迫对紫鸭趾草生长发育的影响 b o b o 吕 皿旺| 1 钿 豁 酶 餐 0 2 55 07 51 0 0 尾矿沙含量( v v ) 图4铜尾矿对紫鸭跖草叶片游离脯氨酸含量的影响 f i g 4c o p p e rm i n et a i l i n g so np u r p u r e ac o n t e n to ff r e ep r