维生素C及其制剂的质量控制研究.doc

摘要：维生素C，是一种无法通过人体自身合成的必需维生素，当躯体缺乏此类维生素时将导致多种疾病，尤其是坏血病，其制剂在医疗保健各方面均发挥不可忽视的作用，因此，对各种维生素C制剂进行质量控制，对其能否更好地进入机体、发挥相应的疗效具有重要意义。目前用于维生素C质量控制的方法有很多，如滴定法、光度分析法、高效液相色谱法等，各方法各有各的特点，本文将对近年来有关维生素C制剂的质量控制研究方法进行综述。关键词：维生素C；质量控制；含量测定；维生素C（vitaminC）又称L-抗坏血酸（L-ascorbic acid），是一种水溶性维生素，能促进骨胶原的生物合成，利于组织创伤口的更快愈合、促进胶原蛋白的合成，防止牙龈出血、促进牙齿和骨骼的生长，防止牙床出血，防止关节痛、腰腿痛，促进氨基酸中酪氨酸和色氨酸的代谢，延长肌体寿命、同时能改善铁、钙和叶酸的利用、改善脂肪和类脂特别是胆固醇的代谢，能够预防心血管疾病，坚固结缔组织，增强肌体对外界环境的抗应激能力和免疫力，其参与体内多种生化反应，在生物氧化和还原作用以及细胞呼吸中起重要作用。最近更有科学研究发现，维生素C在预防癌症、心脏病等都起了很重要的作用。市场上对VitC的需求量在不断增加，因此生产多种维生素C制剂以应对各种需求，具有一定的必要性，而各种制剂能否更好地发挥相应的医疗保健作用，则与其质量息息相关，故对维生素C及其制剂的质量控制研究势在必行，而又不可马虎松懈。维生素C常见的剂型主要有注射剂、片剂、颗粒剂、泡腾片及胶囊剂等，由于维生素C特殊的化学特性，对其制剂的生产过程必须严加控制，但总体的控制及含量测定方法大同小异，以下将做详细介绍。一、性质决定生产，维生素C制剂的生产与其性质息息相关，故在其制剂生产前，应将其性质了解清楚，在生产中才能通过做好相应措施，生产出优质、合格的产品。 1.1、原料概况 中文名称：维生素C 英文名称：vitamin C 其他名称：抗坏血酸(ascorbic acid) 分子式：C6H8O6 分子量： 176.13 IUPAC名：2,3,5,6-四羟基-2-己烯酸-4-内酯 1.2、性状 维生素C是一种水溶性维生素，纯品为白色结晶或结晶性粉末，无臭、味酸，久置色渐变微黄，水溶液呈酸性,具有较强的还原性，加热或在溶液中易氧化分解，在碱性条件下更易被氧化，为己糖衍生物。易溶于水，能溶于乙醇，而不溶于氯仿或乙醚，熔点为190192，熔融时同时分解。 分子结构中具有二烯醇和内酯环结构，且有两个手性碳原子（C4、C5），不仅使维生素C性质极为活泼，且具有旋光性,比旋度+20.5至+21.5。其分子中的二烯醇基具有极强的还原性，易被氧化为二酮基而成为去氢抗坏血酸，加氢又可还原为抗坏血酸，在碱性溶液或强酸性溶液中能进一步水解为二酮古罗糖酸1。由于双键使内酯环稳定，和碳酸钠作用可生成单钠盐，不致发生水解，但在强碱中，内酯环可水解，生成酮酸盐。具有糖类的性质和反应。本品具有具有共轭结构，在稀盐酸溶液中于243nm波长处有最大吸收，为560，可用于鉴别和含量测定。若在中性或者碱性条件中，最大吸收波长红移至265nm。 二、优质的产品源于优质的原料药，故生产前应对原料药进行鉴别与检验，唯有合格的原料才可投入生产，根据2010版中国药典，维生素C的鉴别方法主要有以下几种。2.1 与硝酸银反应维生素C分子中有烯二醇基，具有强还原性，可被硝酸银氧化为去氢抗坏血酸，同时产生黑色金属银沉淀。方法：取供试品0.2g，加水10ml溶解后，取该溶液5ml，加硝酸银试液0.5ml即生成银的黑色沉淀。在另一份中，加2,6-二氯靛酚钠试液1-2滴，它与维生素C反应生成无色的酚亚胺，试液的颜色即消失。2.2 与2，6-二氯靛酚反应2，6-二氯靛酚反应为一染料，其氧化型在酸性介质中为玫瑰红色，碱性介质中为蓝色。与维生素C作用后生成还原型无色的酚亚胺。方法：取供试品0.2g，加水10ml溶解后，取该溶液5ml，加2,6-二氯靛酚钠试液1-2滴，试液的颜色即消失。2.3 与其他氧化剂反应维生素C可被亚蓝基、高锰酸钾、碱性酒石酸铜试液、磷钼酸等氧化剂氧化为去氢抗坏血酸，同时抗坏血酸可使其试剂褪色，产生沉淀或呈现颜色。2.4 糖类反应维生素C可在三氯化醋酸或盐酸存在下水解、脱羧、生成戊糖，再失水，转化为糠醛，加入吡咯，加热至50产生蓝色。2.5 紫外分光光度法维生素C在0.01mol/L盐酸溶液中，在243nm波长处有唯一最大吸收，其吸收系数为545-585nm，可利用此特征进行鉴别。2.6 薄层色谱法从相应制剂中提取维生素C并制成供试品溶液，与维C对照品溶液在相同条件下展开，所显主斑点位置和颜色应相同。 三、质量是保证一个制剂能否发挥相应疗效的关键，相关剂型生产出来后，应对其质量进行检查，只有质量检查合格了，该药品才是有效的，才可投放市场。维生素C的质量检查主要有杂质检查与含量测定，相关的检步骤如下。 3.1.质量检查 中国药典规定应检查维生素C及其片剂、注射剂的澄清度与颜色，另外对维生素C原料中铜、铁离子进行检查。另外还有炽灼残渣，重金属，细胞内毒素等。注射液和泡腾制剂还需检查酸碱度。3.1.1溶液的澄清度与颜色 取维生素C供试品3.0g，加水15ml，振摇使溶解，溶液应澄清无色；如显色，将溶液经4号垂熔玻璃漏斗滤过，取滤液，照紫外-可见分光光度法（附录 A），在420nm的波长处测定吸光度，不得过0.03。3.1.2 炽灼残渣 炽灼残渣不得过0.1（附录 N）。3.1.3草酸含量 取本品0.25g，加水4.5ml，振摇使维生素C溶解，加氢氧化钠试液0.5ml，加稀醋酸1ml，加氯化钙试液0.5ml，摇匀，放置1小时，作为供试品溶液；另精密称取草酸75mg，置500ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml，加稀醋酸1ml，加氯化钙试液0.5ml，摇匀，放置1小时，作为对照品溶液。供试品溶液产生的浑浊不得浓于对照品溶液（0.3%）。3.1.4铁离子含量取本品5.0g两份，分别置25ml量瓶中，一份中加0.1mol/L硝酸溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液(B)；另一份中加标准铁溶液（精密称取硫酸铁铵863mg，置1000ml量瓶中，加1mol/L硫酸溶液25ml，加水稀释至刻度，摇匀，精密量取10ml，置100ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀）1.0ml，加0.1mol/L硝酸溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液(A)。照原子吸收分光光度法，在248.3nm的波长处分别测定，应符合规定。3.1.5铜离子含量取本品2.0g两份，分别置25ml量瓶中，一份中加0.1mol/L硝酸溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液(B)；另一份中加标准铜溶液（精密称取硫酸铜393mg，置1000ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，精密量取10ml，置100ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀）1.0ml，加0.1mol/L硝酸溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液(A)。照原子吸收分光光度法，在324.8nm的波长处分别测定，应符合规定。3.1.6重金属含量取本品1.0g，加水溶解成25ml，依法检查（中国药典附录 H第一法），含重金属不得过百万分之十。 3.2.含量测定维生素C的含量测定大多是基于其具有强的还原性，可被不同氧化剂定量氧化而进行。因容量分析法简便快速、结果准确，被各国药典所采用，目前测定维生素C含量的主要方法有：碘量法、2，6-二氯靛酚滴定法，而电位滴定法、二甲苯二氯靛酚比色法、2，4-二硝基苯肼比色法、荧光分光光度法、HPLC法、毛细管电泳法、比浊测定法、极谱法等也相继发展，适用于制剂和体液中维生素C的专属测定。3.2.1 氧化还原滴定法3.2.1 a. 碘量法Ch.P.(2010版)因维生素C具有强还原性，I2有强氧化性，I2可将维生素C氧化为去氢抗坏血酸，同时依据淀粉溶液变色而指示终点。方法：取本品20片，精密称定，精密称取适量（约相当于维生素C 0.2g），置100mL量瓶中，加新沸放冷蒸馏水100mL与稀醋酸10mL的混合液适量，振摇使之溶解并定容，摇匀，经干燥滤纸滤过，精密量取续滤液50mL，加淀粉指示剂1mL，用碘滴定液（0.05mol/L）滴定，至溶液显蓝色且持续30s不褪色。每1mL碘滴定液（0.05mol/L）相当于8.806mg的维生素C。注意：.因维生素C在碱性条件下易被空气中的氧氧化，所以为确保维生素C尽可能不被氧化，应使其处于酸性条件下。整个操作过程要迅速，防止还原型抗坏血酸被氧化。.用I2溶液滴定时，速度要缓慢，接近终点时更要放慢速度，滴至微蓝色且在30s内不褪色，即为滴定终点。.因为I2见光易分解及配制I2溶液时未能将其完全溶解的原因，都会使I2溶液的浓度有所变化。所以在每次测样品之前，都应先用维生素C的标准溶液重新标定I2溶液的浓度。本法操作简便，几乎适用于所有维生素C制剂的含量测定。3.2.1 b. 2，6-二氯靛酚滴定法2，6-二氯靛酚为一染料，其颜色反应表现为两种特性，一是取决于其氧化还原状态，氧化态为深兰色，还原态为无色；二是受其介质的酸度影响，在碱性溶液中呈深兰色，在酸性介质中呈浅红色。用兰色的碱性指示剂标准溶液，对含有维生素C的酸性浸取液进行氧化还原滴定，指示剂被还原为无色，当到达滴定终点时，多余的指示剂在酸性介质中则表现为红色，由指示剂的用量就可以计算样品中还原性抗坏血酸的含量。方法：称取药物10克，研磨后加入80mL有机溶剂萃取，用脱脂棉过滤，滤液再用滤纸过滤。将滤液转入100mL量瓶中，用相应有机溶剂定容。滴定时吸取稀释10倍的样品液三份（10mL）分别置于三个量瓶中，用2,6-二氯靛酚溶液（0.2mg/mL）滴定，记录消耗的体积数。另吸取相应的有机溶剂三份做空白滴定，方法同上。滴定度为0.088mg/mL2。为解决2,6-二氯靛酚滴定法不适合用于有色溶液中的抗坏血酸测点问题，可以利用2,6-二氯靛酚能溶于有机溶剂的特点，以1,2-二氯乙烷为有机溶剂，用2,6-二氯靛酚滴定抗坏血酸，当还原性抗坏血酸消耗殆尽，多滴入的2,6-二氯靛酚就会进入有机层呈粉红色，以此来判断滴定终点。3.2.1 c. 电位滴定法以Pt为指示电极，甘汞为参比电极，根据滴定过程中电池电动势的变化来确定滴定终点。E池E+-E-+E液接电位EI2/I-+k(常数)电位滴定法可以有效解决滴定分析过程中遇到的有色或浑浊溶液时无法指示终点的问题。 3.2.2.薄层扫描法3 （1）对照品溶液的配制 精密称取维生素C标准品100mg，用缓冲液配成lmg/ml的标准溶液。精密称取维生素C标准溶液1、2、3、4、5ml，分别置于10ml容量瓶中，用缓冲溶液稀释至刻度。 （2） 样品的含量测定取维生素C片1O片，研细，精密称取平均片重一片的粉末，放入l00ml容量瓶中，加缓冲液至刻度，振摇，使维生素C溶解，放置、澄清，用吸液管 取3ml 移至10ml容量瓶中，用缓冲稀释至刻度。用5l定量毛细管点样品溶液与不同浓度的标准液于同一试纸上，然后扫描测定峰面积，由工作曲线法计算维生素c片中的维生素C含量。用薄层扫描法测定维生素C片中的维生素C的含量，结果准确，重现性好，样品中的其它辅料不干扰。 3.2.3. 分光光度法 3.2.3 a. 紫外分光光度法4 （1）供试品溶液的准备 取本品20片精密称定 ，研细，精密称取适量(约相当于维生素C (0.05 g)，置100ml量瓶中，加0005 mol/L硫酸液适量，振摇使维生素C溶解，加0.005 mol/L硫酸液至刻度，摇匀，滤过，弃去初滤液；精密量取续滤液5 ml置250 ml量瓶中，用0005 mol/L硫酸液稀释至刻度，摇匀，即得。 （2）样品测定 取供试品溶液，照紫外分光光度法在243 nm波长处测定吸光度，按为560 计算含量。与中国药典采用的碘量法比较用紫外分光光度法测定维生素C片含量，方法操作简单、快速，结果准确，但操作费时。 3.2.3 b. 红外分光光度法5 （1） 样品的制备根据维生素C在水中易溶，在乙醇中略溶的性质，选择以无水乙醇做溶剂提取维生素C，取维生素C片1O片，研细，置锥形瓶中，加无水乙醇8O mL 振摇使溶解，滤过，滤液水浴蒸干，残渣置硅胶干燥器内。 （2）样品的含量测定取维生素C对照品及”24.1”项下样品，用溴化钾压片，测定红外吸收光谱。维生素C片与维生素C对照品的红外吸收光谱完全一致，并与国家药典委员会颁布的药品红外光谱集第一卷(1995年)中的维生素C标准光谱一致，因此，本法可作为维生素C片的鉴别方法之一 。 3.2.3 c. 菲林B近红外分光光度法6取两支10 mL具塞比色管，其中一支加入适量的维生素C注射剂(在稀释后浓度小于50 mgL)，另一支不加；然后分别依次加入2 mL的Folin B试剂，用pH3三氯乙酸溶液稀释至刻度，摇匀，反应5 min后，以试剂空白为参比，使用l cm玻璃吸收池在920 nm波长处测定吸光度A值。平行测量3次，取平均值。423标准曲线制备：分别准确配制浓度为0-50.0 mg/L的维生素C系列标准工作液，按上述实验方法测定吸光度并根据标准曲线求出维生素C含量。是一种测定维生素C的新方法，它是基于Folin B试剂与抗坏血酸在pH=3的三氯乙酸酸性介质中反应生成脱氢抗坏血酸，该方法简单、快速、准确。 3.2.3 d.重铬酸钾分光光度法7K2Cr2O7在0.16mol/L的硫酸介质中与维生素C发生褪色反应，利用分光光度法测定维生素C含量。K2Cr2O7是基准物资，在常温下与维生素C反应完全，且体系颜色变化明显，在350nm波长处测定其吸光度，就可以计算维生素C的含量与回收率，有较好的准确度和灵敏度。方法：分别取0.005mol/L K2Cr2O7标准溶液2mL，1mol/L H2SO4溶液4mL，放入25mL量瓶中，定容，以除氧去离子水为参比液，在350nm波长处测定其吸光度A0。再分别取0.005mol/L K2Cr2O7标准溶液2mL，1mol/L H2SO4溶液4mL，放入25mL量瓶中，加入一定量的维生素C溶液，用除氧去离子水定容，反应30min后，在350nm波长处测其吸光度值A1，计算吸光度值之差A= A0- A1, A与维生素C含量成正比。3.2.3 e.磷钼蓝分光光度法8磷钼蓝法是一种常用来测定微量磷含量的分光光度方法，利用磷钼酸铵定量地与维生素C反应，生成磷钼蓝来测定其含量。该方法用过量的磷钼酸铵测定微量的还原型维生素C，不会生成钼蓝，测试条件允许范围较宽，抗干扰能力强，分析结果准确度高，重复性好。适合于分析生物、药物等试样中微量维生素C的含量。方法：取25mL比色管,依次加入NaAc-HAc缓冲溶液3mL，（NH4）2MnO4溶液3mL,NaH2PO4溶液2mL，Bi(NO3)3溶液1mL,摇匀，然后准确吸取一定量的试液加入比色管中，稀释至刻度，摇匀，85恒温水浴10min使反应完全，冷却至室温（如有浑浊，可过滤，取滤液测定），用1cm比色皿，于700.1nm处测量吸光度。3.2.4 毛细管电泳法9以 25 mmol/L磷酸盐缓冲液（pH7.40）为背景电解质，检测波长为254 nm，分离度好，灵敏度高，在较短的时间内达到基线分离。毛细管在使用前，分别用0.1mol/LNaOH溶液、二次重蒸水、缓冲溶液洗3、5、5 min。每次测定后，用运行缓冲溶液洗2min。运行缓冲液为25mmol/L 磷酸盐缓冲液（NaOH调至pH7.30）。分离温度25； 恒定电压18 kV； 压力进样1.8kPa10s；检测波长为254nm。实验中，在两次进样间采用缓冲液冲洗2 min。注意：缓冲液的 pH值和浓度对分离的灵敏度和分离度都有一定的影响。缓冲溶液浓度的选择对于减小溶质与管壁的相互作用，克服峰形畸变，改善分离度都具有十分重要的作用。随着分离温度的升高，维生素C迁移时间均明显减小，分离度加大。为了使维生素C得到明显的分离并且更加实用，综合考虑，最终选择 25本法操作简便，分析快捷，结果准确，消耗试剂少，测试费用低，不污染环境。3.2.5 高效液相色谱法 HPLC10色谱条件：采用Kromasil C18色谱柱,以甲醇-0.1%磷酸(595)为流动相,柱温: 25,流速: 0.8mL/min;检测波长: 242nm。理论板数按维生素C峰计算应不低于3000。对照品溶液制备：精密称取维生素C对照品20mg,置25mL量瓶中,加1%偏磷酸溶液溶解并稀释至刻度,摇匀;精密量取1mL,置25mL量瓶中,加1%偏磷酸溶液稀释至刻度,摇匀,即得(每1mL中含维生素C 32g)。供试品溶液的制备：取本品适量(约相当于维生素C 20mg),置25mL量瓶中,加1%偏磷酸溶液溶解并稀释至刻度,摇匀,精密量取1mL,置25mL量瓶中,加1%偏磷酸溶液稀释至刻度,摇匀,即得。测定法：分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液及1%偏磷酸溶液各10L,按上述色谱条件进样,测定。维生素C水溶液在空气中极不稳定，只有在酸性环境中稳定性较好，故选用1%偏磷酸作为溶媒提取，效果与稳定性均好。本法