第八章 海藻酸钠的提取及部分性质的测定.doc

生物化学综合性实验讲义第一章 海藻酸钠的提取及部分性质的测定前言：海藻酸钠（Sodium Alginate, NaAlg）是从褐藻类的海带或马尾藻中提取的一种多糖，是由-1,4-D-甘露糖醛酸（M）和-1,4-L-古罗糖醛酸（G）组成的一种线型聚合物，是海藻酸衍生物中的一种，所以有时也称褐藻酸钠或海带胶和海藻胶。其分子式为(C6H7O6Na)n，相对分子量在(32000-200000)。海藻酸钠中的M和G以M-嵌段、G-嵌段和MG-嵌段存在。M和G的比率及排列顺序因褐藻的种类不同而有显著的差异，即或是同一种褐藻，也因部位不同而有显著的差异。海藻酸钠作为一种天然高分子物质以其良好的生物降解性和生物相容性，以及良好的增稠性、成膜性、稳定性、絮凝性和螯合性而被广泛应用于化学、生物、医药、食品等领域。实验一、海藻酸钠的提取1目的要求:学习并掌握钙凝离子交换法提取海藻酸钠原理及方法2实验原理：目前提取海藻酸钠的方法主要有四种，分别为酸凝酸化法、钙凝酸化法、钙凝离子交换法、酶解提取法。本实验采用钙凝离子交换法。在这个方法中，首先用甲醛处理海带（或马尾藻），甲醛会使藻体的蛋白质变性而固定，并将海带色素固定在表皮细胞中，不致溶于水中导致产品色泽加深。同时，甲醛对植物细胞壁纤维组织有破坏作用有利于消化过程中海藻酸盐的置换与溶出。其次用碳酸钠（Na2CO3）进行消化，此过程可以使不溶性褐藻酸盐变成可溶性褐藻酸钠盐；当加入氯化钙后褐藻酸钠变成水不溶性褐藻酸钠盐析出这一步称为钙析；将钙析后的产品过滤后用氯化钠就可以进行离子交换脱钙。反应方程式如下：2M(Alg)n+nNa2CO32nAlgNa+M2(CO3)n消化2AlgNa+CaCI2Ca2Alg +2NaCI钙析2AlgNa+CaCI2Ca2Alg +2NaCI离子交换脱钙脱钙后褐藻酸钙就又变成褐藻酸钠溶解在溶液中，通过乙醇就可以将褐藻酸钠沉淀出来。3实验材料：1)材料海带2)试剂甲醛 1%碳酸钠 3%浓盐酸氯化钠 10%氯化钙95%乙醇3)仪器电热恒温水浴锅全塑不锈钢循环水真空泵恒温箱托盘天平4实验方法与步骤:4.1 浸泡：称取5g剪细至0.5cm的海带于500ml的烧杯中，加入300ml水，并加适量的甲醛，使甲醛溶液初始浓度为1%，浸泡4小时。浸泡结束后，洗涤。4.2 消化：加入3%Na2CO3300ml消化3个小时。4.3 过滤：由于消化后，海带变成了糊状，比较粘稠。首先用纱布初滤一次，再用真空泵抽滤。4.4 钙析：将滤液用盐酸调节至pH67,加入10%CaCI2溶液进行钙析。将钙析后的产品过滤后，再往里加入200ml 15%的NaCI溶液脱钙。往离子交换后的溶液中加入2倍量的95%乙醇，析出了白色海藻酸钠絮状沉淀，继而以85%和95%的乙醇依次洗涤脱水，最后30减压干燥，即得海藻酸钠样品。5实验结果与分析海藻酸钠提取率的计算：NaAlg(%)=(W1/W2)100% NaAlg表示海藻酸钠的提取率；W1表示海藻酸钠产品的质量；W2表示海带的质量(干重)。6思考题：海藻酸钠提取的原理是什么？参考文献：周家华 崔英德 杨辉 等 食品添加剂 北京 化学工业出版社 2001， 250254 实验二、海藻酸钠旋转粘度的测定1实验目的：学习用旋转式粘度计测定海藻酸钠粘度的原理和方法2实验原理： NDJ-1旋转式粘度计工作原理：旋转粘度计上的同步电机l以一定的速度带动刻度圆盘2旋转，又通过游丝3和转轴带动转子4旋转。如果转子未受到液体的阻力,则游丝、指针与刻度盘同速旋转,指针在刻度盘上指出的读数为”0”。反之,如果转子受到液体的粘滞阻力,则游丝产生扭矩,与粘滞阻力抗衡最后达到平衡,这时与游丝连接的指针5在刻度盘上指示一定的读数(即游丝的扭转角)。将读数乘上特定的系数即得到液体的粘度。本仪器转速由齿轮系统及离合器通过调速旋钮进行变速, 附有1-4号四种转子,可根据被测液体的高低随同转速配合选用;其装有指针固定控制机构,为精确读数用,当转速较快时(30转/分、60转/分)无法在旋转时进行读数,这时可轻轻按下指针控制杆,使指针固定下来,便于读数;还配有固定支架及升降机构,一般在实验室中进行小量和定温测定时应固定.把仪器固定于支架上以保证测量精确度;斜齿轮及阻尼升降机构,确保仪器升降平稳;引伸索便于在被测液体之容器较大而液面又较低时,及被测液体温度过高情况下使用.3实验材料：1)材料海藻酸钠2)仪器烧杯旋转粘度计恒温水浴4实验方法与步骤：称取5g样品（精确至0.01g），缓慢倒入495ml蒸馏水中，溶解样品时，应在不断搅拌下倒入，以防结块，继续搅拌约4小时，使溶解成均匀的水溶液（1%），粘度计使用时测定温度：200.5. 使用转子：2号。 转速：30r溶液粘度200mPas以上或60r(溶液粘度300mPas以下) 先调整溶液温度200.5，按规定条件进行测定，启动粘度计开关，旋转1分钟，使转盘上指针稳定后再读数。5实验结果与分析 计算：粘度=SK S指针数平均值K测定时选用的响应的转子与转速的系数附录：NDJ-1旋转式粘度计量程表与系数表量程表 系数表转/分满量程mPa.s转子6030126转/分系数转子6030126010205010000.10.20.51110020050010001125102500100025005000251025503200040001000020000320401002004100002000050000100000410020050010006思考题：旋转粘度同海藻酸钠的分子量有什么关系？参考文献：中国标准出版社总编室. 中国国家标准汇编:1985. 北京: 中国标准出版社,1985,7477实验三、海藻酸钠分子量的测定乌氏粘度法1实验目的1)掌握用乌氏(Ubbelohde)粘度计测定高聚物溶液粘度的原理和方法。2)测定褐藻酸钠的平均分子量。2实验原理2.1粘度及其表示方法在高聚物中，分子的聚合度不一定相同，因此高聚物的分子量往往是不均一的，没有一个确定的值。通过实验的方法可测得某一聚合物的分子量分布情况和分子量的统计平均值，即平均分子量。由于测定原理和计算方法不同，所得结果也不相同，常见的平均分子量有：数均分子量、重均分子量、Z均分子量和粘均分子量。在多种测量高聚物平均分子量的方法之中，粘度法具有设备简单、操作方便、且有很好实验精度的特点，因而是常用的方法之一。粘度是指液体对流动所表现的阻力，这种力反抗液体中邻接部分的相对运动，因而是液体流动时内磨擦力大小的一种量度。因此，高聚物稀溶液的粘度()应包括溶剂分子之间的内摩擦、高聚物分子与溶剂分子之间的内摩擦以及高聚物分子之间的内摩擦，三者表现出来的粘度的总和。其中溶剂分子之间的内摩擦表现出来的粘度为纯溶剂粘度，用0表示。在相同的温度下，通常0，为了比较这两种粘度，将增比粘度定义为sp (1)式中r称为相对粘度，它是溶液粘度和溶剂粘度的比值，它反映的也是溶液的粘度行为。增比粘度sp反映了扣除溶剂分子的内摩擦以后，仅仅高聚物分子间与溶剂分子和高聚物分子间的内摩擦所表现出来的粘度。高聚物溶液的增比粘度sp往往随溶液浓度的增加而增加。为方便比较，将单位浓度下所显示的增比粘度称为比浓粘度，将称为比浓对数粘度。2.2特性粘度Huggins(1941年)和Kramer(1938年)分别发现比浓粘度和比浓对数粘度溶液浓度之间符合下述经验关系式 (2) (3)式中c为溶液的浓度，k和分别称为Huggins和Kramer常数。根据上述二式，以c或c作图可得两条直线，对同一高聚物，外推至c = 0时，两条直线相交于一点，所得截距为，称为特性粘度，如图1所示。显然，特性粘度可定义为 (4)图1 外推法求示意图当溶液无限稀释时，高聚物分子彼此相隔很远，它们之间的摩擦效应可以忽略不计，因此，特性粘度主要反映了溶剂分子和高聚物分子之间的内摩擦效应，其值决定于溶剂的性质，更决定于聚合物分子的形态和大小，是一个与聚合物分子量有关的量。由于sp和r均是无因次量，所以的单位是浓度单位的倒数，它的数值随浓度表示方法的不同而不同。实验证明，当聚合物、溶剂和温度确定以后，聚合物的特性粘度只与聚合物的摩尔质量有关，它们之间的关系可用Mark-Houwink经验方程式来表示K (5)式中是粘均分子量，K和都是与温度、聚合物、溶剂的性质有关的常数，在一定的分子量范围内与分子的大小没有关系。K和的数值只能通过其它绝对方法（如：渗透压法、光散射法等）确定，若已知K和的数值，只要测得就可求出。2.3液体粘度的测定方法，液体粘度的测定方法主要有三类：（1）用旋转式粘度计测定液体与同心轴圆柱体相对转动的情况来确定粘度；（2）用落球式粘度计测定圆球在液体里的下落速度来确定粘度；（3）用毛细管粘度计测定液体在毛细管里的流出时间来确定粘度。前两种方法适于高、中粘度的溶液，毛细管粘度计适用于较低粘度的溶液，本实验采用该粘度计。玻璃毛细管粘度计测量原理是：当液体在重力作用下流经粘度计中的毛细管时，遵守泊塞勒(Poiseuille)公式 (6)式中的是液体粘度，是液体密度，l是毛细管的长度，r是毛细管半径， g是重力加速度，t是流出时间，h是流经毛细管的液体平均液柱高度，v是流经毛细管的液体体积，m是动能校正系数，当时，可取m1。对于指定的某一粘度计，令A，B， 则上式可写成 At - (7)式中B1，当t100s时，等式右边第二项可以忽略。又因为通常测定是在稀溶液中进行（c1g/100mL）, 溶液与溶剂的密度近似相等，则有 (8)式中t 为溶液的流出时间，t0为纯溶剂的流出时间。所以只需分别测定溶液和溶剂在毛细管中的流出时间就可得到r。 图2 乌氏粘度计3实验材料1)材料海藻酸钠2)仪器恒温槽 移液管（5mL、10mL）乌氏粘度计 锥形瓶（100mL） 秒表 容量瓶（100mL） 洗耳球 烧杯（50mL） 3号砂芯漏斗 电吹风 4实验步骤与方法4.1海藻酸钠溶液的配制 精密称取 105干燥 6 小时的海藻酸钠适量，撒于约50mL 的 0.lmolLNaCl 溶液中(内含 0.05% EDTA-2Na)，放置 24h 后溶解并稀释至100mL,使所成溶液的增比粘度(sp)在 0.75l 为宜。然后，用预先洗净并烘干的3号砂芯漏斗过滤溶液。4.2洗涤粘度计 本实验采用乌氏粘度计，如图2所示。先将经砂芯漏斗过滤的洗液倒入粘度计内进行洗涤，再用自来水、蒸馏水冲洗。对经常使用的粘度计需用蒸馏水浸泡，除去粘度计中残余的聚合物。粘度计的毛细管要反复用水冲洗。最后，加少量丙酮萃取管内水滴，将丙酮倒入指定试剂瓶中，用电吹风的热风吹粘度计F、D球，造成热气流，烘干粘度计。4.3调节恒温槽温度 恒定温度在25.00.05，将粘度计垂直置于恒温槽中，使水浴浸在G球以上。4.4测纯溶剂的流出时间t0 移20mL已恒温的蒸馏水，由C管注入粘度计内，再恒温5min后，封闭B管，用洗耳球由A管吸溶剂上升至G球，同时松开A、B管。G球内液体在重力作用下流经毛细管，当液面恰好到达刻度线a时，立即按下秒表，开始记时，待液面下降到刻度线b时再按下秒表，记录溶液流经毛细管的时间。重复测定三次，每次测得的时间不得相差0.2s，取其平均值，即为溶剂的流出时间t0。4.5测定溶液的流出时间t 待t0测完后，在原20mL水中加入5mL配制好的海藻酸钠溶液，密封B管，用洗耳球在A管多次吸液至G球，以洗涤A管，并使溶液与溶剂水充分混合。用上述方法测定浓度为原溶液1/5的溶液的流出时间。此后再依次加入5、5、5、10mL配制好的海藻酸钠溶液，稀释成相对浓度为1/3、3/7、1/2、3/5的溶液，并分别测定它们的流出时间。5实验结果及分析室温 大气压 恒温槽温度 原溶液浓度g/100mL溶液相对浓度流出时间123平均值01/51/33/71/23/5 本实验是用100mL溶液中所含聚合物的克数作为浓度单位。5.1 以和对浓度c作图，得两直线，外推至c0，求出。5.2 重量平均分子量 Mw的计算：按 Mark-Houwink 方程KMw根据文献取K2.010-5、l 代入，计算 Mw。注意事项：1. 做好实验的关键在于粘度计必须洗净，直至毛细管壁不挂水珠，且严格保持垂直位置。配制聚合物溶液时，确保其完全溶解。否则，这些因素都会影响结果的准确性。2实验过程中恒温槽的温度要恒定，温度要控制在0.05内溶液每次稀释恒温后才能测量。 3每次读数要准确，并且溶液配制浓度要准确6思考题1)乌氏粘度计中的支管C的作用是什么？除去支管C是否仍可以测定粘度？2)分析实验成功与失败的原因。3)评价粘度法测定高聚物相对分子质量的优缺点，指出影响准确测定结果的因素。参考文献：1 何曼君，陈维孝。董西侠，高分子物理，第127132页，复旦大学出版社（1982） 2 Hang A. Determination of intrinsic viscosity of alginates. Acta Chem Scand, 1962,16:15703 Smidsrod O. A light scattering study of alginate. Acta Chem Scand, 1968,22:797实验四、海藻酸钠红外光谱的测定：1实验目的：了解红外光谱法鉴定多糖的原理2实验原理：多糖的分析鉴定一般借助于气相色谱(GC)、高效液相色谱(HPLC)、红外光谱(IR)和紫外光谱(UV)等技术，气相(液相)色谱质谱(GCHPLCMS)联用技术成为分析多糖更为有效的手段。本实验利用红外光谱对多糖进行鉴定。红外光谱区域通常是指波数为4000200cm-1的中红外区，用这样的红外光通过样品，再测量在各种波数下透过样品的光的强度，由仪器记录下来的曲线，即是红外光谱，其横坐标是波数，纵坐标是光的透射率。在作定性用的谱图中，一般是不标出纵坐标的。红外光谱图上每一个吸收峰，都对应于分子中原子或官能团振动的情况。每一种化合物都具有其特殊的红外光谱(高分子化合物除外)，因此，利用红外光谱可以帮助我们进行一些复杂化台物的定性及定量分析，检验分子中一些官能团和氢键的存在。当然，仅凭红外光谱一种手段是难以确定一种未知化合物的结构的，但对于已知化合物，借助于标准图谱是极易检识的。其中，多糖类物质的官能团在红外谱图上表现为相应的特征吸收峰，我们可以根据其特征吸收来鉴定糖类物质。0H的吸收峰在36503590cm1，CH的I申缩振动的吸收峰在29622853cm1，CO的振动峰为151016701之间的吸收峰，CH的弯曲振动吸收峰为14851445cm1，吡喃环结构的C0的吸收峰为1090cm1。3实验材料 1)材料海藻酸钠2)试剂氯化钾3)仪器研钵干燥箱傅里叶变换红外光谱仪4实验方法与步骤取1mg左右经干燥的糖样，与100200 mg经干燥的KBr粉末在玛瑙研钵中轻轻研磨均匀，磨得愈细愈好，最好在红外灯下操作，以免KBr吸收空气中的湿气。样品或KBr吸湿后，将在0-H和N-H的高波数区域出现水峰，影响0-H和N-H的判断。经压片机压成薄片，随即上机测定。5实验结果与分析:将样品，在4000400cm-1区间内进行红外光谱扫描，有如下的多糖特征吸收峰：3401 cm-1（O-H），2919 cm-1(C-H)，10701250 cm-1的宽强吸收峰是吡喃环化合物 C-O-C 的伸缩振动峰，是海藻酸钠中-O-的吸收峰，在 10151065 cm-1附近是环醇中的-OH 振动峰，这正是海藻酸钠中的-OH 的吸收峰。在 14001440 cm-1 附近有一吸收峰，是羧酸根离子对称伸缩振动峰，这正是海藻酸钠中的羧酸离子6思考题：红外光谱法假定多糖的原理是什么？这种方法在鉴定多糖的结构中有哪些局限性？参考文献: 1张惟杰 糖复合物生化研究技术（第二版） 浙江大学出版社 1998 1931982王孝华 海藻酸钠的提取和应用研究 2004 重庆大学 硕士学位论文 3738第二章 酸性磷酸酯酶的提取实验一 酸性磷酸酯酶的提取1目的 掌握胞内酶的分离提取方法，学会离心机的使用。2原理酸性磷酸酯酶(Acid Phosphatase，E C 3 132)存在于植物的种籽、霉菌、肝脏和人体的前列腺之中，能专一性地水解磷酸单酯键。本实验选用绿豆芽的酸性磷酸酯酶为材料，磷酸苯二钠为底物。磷酸苯二钠经过酸性磷酸酯酶作用，水解后生成酚和无机磷，其反应式如下： 由上式可见，当有足量的底物磷酸苯二钠存在时，酸性磷酸酯酶的活力越大，所生成的产物酚和无机磷也越多。根据酶活力单位的定义，在酶促反应的最适条件下每分钟生成1微摩尔(umo1)产物所需要的酶量为一个活力单位，因此可用Folin一酚法测定产物酚或用定磷法测定无机磷来表示酸性磷酸酯酶的栝力。本实验采用的是Folin一酚法。 实验前将绿豆芽细胞破碎，释放出酸性磷酸酯酶，离心除去细胞碎片和植物纤维等杂质，得到酸性磷酸酯酶的粗酶溶液，为下面的酶学性质研究及SDS-PAGE电泳法测分子量等系列生物化学实验做准备。 3实验器材 1）LGl02.4A高速离心机：北京医用离心机厂生产，1台组，参见图8-1-5以及附录,并观看光盘中的视频离心机的使用。 2）托盘天平：1台组。 3）滴管：1支组。4）100 mL烧杯：2只组。 5）100mL三角烧瓶：1只组。 6）漏斗：1只组。 7）纱布：若干。 8）滤纸：若干。 9）碾钵：1套组。 10）培养皿：1个组。 11）100mL量筒：1支组。 12）塑料手套：多双组。 13）记号笔：公用。 14）绿豆芽：当日采摘，50克组。4操作4.1匀浆：参见图8-1-1，戴上手套，将绿豆芽掐去根和叶得绿豆芽茎，称取50 g的绿豆芽茎，在碾钵中用碾锤彻底捣碎，室温静置0.5 h，在培养皿中用双层纱布挤滤，得到滤液。4.2平衡：参见图8 -1-2，将2只100mL烧杯分别放到托盘天平的2只托盘上进行平衡。将滤液倒人2支离心管中，再把离心管连同其盖子分别放入托盘上的2只烧杯中，用滴管增、减离心管中的溶液使其在托盘天平上进行平衡，平衡后盖上离心管的盖子，用记号笔做好标记。 4.3离心：参见图8 -1-3图8-1-6和附录，按住离心机右侧面上方的按钮，即可掀开离心机的盖子，再旋开转子的盖子，将平衡好的2支离心管插入离心机转子的2个相对的槽中(这是为了保护离心机)，等2组或3组同学都插好了以后(即转子中的4个或6个槽均插上了离心管)，旋上转子的盖子，再合上离心机的盖子，在离心机面板上将“定时”旋钮州到21min，将“转速”旋钮调到最大，插上电源插头，开启“电源”开关，按下“启动”按钮。此时，离心机开始加速旋转，当转速指针接近4 000 rmin时，将“转速”旋钮回调至中间附近的位置(12点钟位置)，转速便会恒定在4 000 rmin。离心20 min后，离心机会自动减速。必须等到转速指针指尔为“0”时，即转子彻底停止了旋转，才能开盖取离心管，请观看光盘中的视频离心机的使用。 4.4保存：将离心管中大部分上清液倒人量筒中，少部分接近沉淀物的上清液经滤纸过滤，一并收入量筒中以测量体积，然后倒入三角烧瓶中做好标记，用塑料薄膜密闭，作为“原酶液”在冰箱中保存备用。 以上操作请观看光盘中的视频酸性磷酸酯酶的提取。 4.5洗净所有用过的玻璃仪器、碾钵和离心管，收拾干净桌面，请老师检查5计算上清液体积（mL）粗酶液得率（mL）=上清液体积绿豆芽茎质量100%6注意事项 1）使用离心机前必须将离心管(连同其盖子)精确平衡。 2）离心过程中，若听到异常响声，可能是出现了离心管破碎或离心管不平衡等情况，应立即切断电源，停止离心，检查原因 3）在离心机高速运转过程中切勿打开离心机盖，以防造成意外事故。 4）避免离心机连续使用时间过长，一般使用60 min后要隔2030 min再使用。 5）有机溶剂会腐蚀离心管，酸、碱、盐溶液会腐蚀金属，若发现渗漏现象应及时擦洗干净以免损坏离心机。7思考题 1）实验操作过程中为什么需戴上手套？ 2）豆芽在碾钵中用碾锤彻底捣碎对酶液提取起到什么作用? 3）离心管中的沉淀物可能是哪些成分？实验二 酶促反应进程曲线的制作1目的 学会制作酶促反应的进程曲线，掌握可见分光光度计的使用。2原理 请参见实验一要进行酶的活力测定，首先要确定酶的反应时间。酶的反应时间并不是任意规定的，应该在初速度范围内进行选择。要求出代表酶促反应初速度的时间范围就必须制作酶促反应的进程曲线。所谓进程曲线是指酶促反应时间与产物生成量(或底物减少量)之间的关系曲线，参见图82一l。它表明了酶促反应随反应时间变化的情况。本实验的进程曲线是在酶促反应的最适条件下采用每间隔一定的时间测定产物生成量的方法，以酶促反应时间为横坐标，产物生成量为纵坐标绘制而成的。从进程曲线可以看出，曲线的起始部分在某一段时间范围内呈直线，其斜率代表酶促反应的初速度。但是，随着反应时问的延长，曲线的斜率不断下降，说明反应速度逐渐降低。反应速度随反应时间的延长而降低这一现象可能是由于底物浓度的降低和产物浓度的增高使逆反应加强等原因所致。因此，要真实反映出酶活力的大小，就应该在产物生成量与酶促反应时间成正比的这一段时间内进行测定。换言之，测定酶活力应该在进程曲线的初速度时间范围内进行。制作进程曲线，求出酶促反应初速度的时间范围是酶动力学性质分析中的组成部分和实验基础。3实验器材 1）VIS-7220型可见分光光度计：请参见实验六，公用。 2）HH一2型数显恒温水浴锅；请参见实验一，公用。 3）取样器：请参见实验一，5 mL、1 mI。各1支组。 4）试管：20支组。 5）试管架：1个组。4实验试剂 1）酸性磷酸酯酶酶液：取原酶液用0.2 molL的pH56乙酸盐缓冲液稀释1020倍。 2）5 mmolL磷酸苯二钠溶液(pH5.6)：精确称取磷酸苯二钠(C6H6Na2PO42H2O，相对分子质量254.10)2.54 g，加蒸馏水溶解后定容至100mL，即配成了100 mmolL磷酸苯二钠水溶液，密闭保存备用。用0.2molL的pH5.6的乙酸盐缓冲液稀释20倍，即得5mmolL磷酸苯二钠溶液(pH5.6)。 3）0.2 molL的pH5.6乙酸盐缓冲液。 4）Folin-酚试剂：于2 000 mL磨口回流装置内加入钨酸钠(Na2WO42H2O)100 g，钼酸钠(Na2MoO42H 2O)25 g，水700 mL，85磷酸50 mL，浓盐酸100 mL。微火回流10 h后加入硫酸锂150 g，蒸馏水50 mL和溴数滴摇匀。煮沸约15min，以驱逐残溴，溶液呈黄色，轻微带绿色；如仍呈绿色，须重复滴加液体溴的步骤。冷却后定容到1000mL，过滤，置于棕色瓶中可长期保存，使用前，用蒸馏水稀释3倍。 5）1 molL碳酸钠溶液。 6）0.4 mmolL酚标准应用液：精确称取分析纯的酚结晶0.94g溶于0.1molL的HCl溶液中，定容至1 000mL，即为酚标准贮存液，贮存于冰箱可永久保存，此时的酚浓度约为0.01molL。使用前将上述的酚标准贮存液用蒸馏水稀释25倍，即得到0.4 mmolL酚标准应用液。5操作检查试管是否干燥、洁净；若否，将其洗净并置于干燥箱内120烘干。51加样与酶促反应：取试管12支，按0到11的顺序逐管编号，空白为0号。各管加0.5mL 5mmolL磷酸苯二钠溶液，在35恒温水浴锅中预热2min后，在111管内各加入0.5 mL预热的酶液。酶液一加入立即精确计时井摇匀，按时间3、5、7、10、12、1 5、20、25、30、40和50min在35恒温下进行定时酶促反应(酶液加入时为起始时间，碳酸钠溶液加人时为终止时间)。当酶促反应进行到上述相应的时间时，加入1 mol/L碳酸钠溶液5mL终止反应，时间控制详见表。管号1234567891011酶液加入时刻（min 11号试管最先加样）109876543210碳酸钠加入时刻（min）131415171820242832415052显色：加完1 molL碳酸钠溶液5 rnL后再向试管中加入0.5mL Folin一酚稀溶液，混匀，保温约10 min即可显色。空白管所加试剂相同，但酶液最后加入。 53测定：冷却后以0号管作空白，在可见光分光光度计上680 nnl波长处测定各管的吸光度A680。以上1、2、3步操作请参见表。 5.4画图：以反应时间为横坐标，A680为纵坐标绘制进程曲线，并将其贴在实验报告上，由进程曲线求出酸性磷酸酯酶反应初速度的时间范围(直线部分涵盖的时间)。 5.5清洁：将用过的玻璃仪器和取样器套头洗净，清洁分光光度计(尤其是比色槽内)、清洗比色皿，整理好桌面上的仪器和试剂，并注意清洁自己的操作台，请老师验收，实验报告当场交给老师。6计算7注意事项 1）酶促反应应保持温和条件，反应液要避免剧烈搅拌或震荡。 2）实验前要设计好每支试管的加样顺序，确保反应时间的准确性。 3酶促反应的加样顺序不得搞错，否则无法显色。 4）参见实验六注意事项之2、3、4。8思考题 1）随着反应时间的延长，曲线的斜率不断下降，说明反应速度逐渐降低，这是为什么？ 2）如果酶促反应在一个较大的体系中，如在烧杯中进行，每隔一定的时间从烧杯中取样测定该体系中产物的生成量，并绘制酶促反应进程曲线，该方法和本书采用的方法结果会一致吗?哪个更好一些？实验三 酸性磷酸酯酶的酶活力测定 1、目的 通过对酶促反应速度的测定，计算出酶的活力，掌握可见分光光度计的使用。 2、原理 请参见实验一 3、实验器材 请参见实验二 4、实验试剂 请参见实验二。 5、操作 检查试管内是否干燥、洁净；若否，将其洗净并置于干燥箱内120烘干。 5.1标准曲线的制作取试管6支，按0到5的顺序逐管编号，空白为0号。按照表，向各试管中依次加入0.4mmolL酚标准应用液、0.2 molL的pH5.6的乙酸盐缓冲液、1 molL碳酸钠溶液和Folin一酚试剂，注意加样顺序不得搞错，否则显不了色。摇匀，在35保温10min以上(先用烧杯盛35的水，置于水浴锅中，再将试管放人烧杯中保温，以防试管滑落人水中)，参见实验二的图。以0号试管为空白，在可见光分光光度计上680 nm波长处读取各管的吸光度A680，以A680为横坐标、酚标准应用液的毫升数为纵坐标作一条标准曲线，它应该是一条直线。保留该数据，以便实验四直接引用。以上操作总结为表5.2酶活力的测定取2支试管，编号1、0，将0号试管作为空白。在2支试管中备加人0.5mL的5 mmolL磷酸苯二钠溶液，35预热2min，再向1号试管中加人35预热过的酶液0.5mL，立即计时，摇匀，35精确反应10min(酶液加入时为起始时间，碳酸钠溶液加入时为终止时间)后立即向2支试管中各加入1 molL碳酸钠溶液5 mL，再各加人Folin-酚稀溶液0.5 mL，混匀，最后向0号试管中加入酶液0.5 mL，2支试管摇匀后在35保温显色约10 min以上，将0号试管作为空白，用可见光分光光度计测1导试管在680 nm处的光吸收值A680，以上详细的加样顺序和操作见表，注意加样顺序不得搞错，否则显不了色。3酶活力的计算 酶活力单位的定义为：在酶促反应的最适条件下每分钟生成1微摩尔(umol)产物所需要的酶量规定为一个活力单位。用1号试管的A680在标准曲线上查出其对应的酚标准应用液的毫升数V，根据公式：20.4V1000/10可计算出l mL酶液中所含有的酶的活力。 4清洁 将用过的玻璃仪器和取样器套头洗净，清洁分光光度计(尤其是比色槽内)、清洗比色皿，整理好桌面上的仪器和试剂，并注意清洁自己的操作台，请老师验收，实验报告当场交给老师。6计算 7注意事项 参见实验二的注意事项。 8思考题 1）用Folin-酚法测定产物酚或用定磷法测定无机磷都可以用来测定酸性磷酸酯酶的活力，你认为哪种方法的适应面更广? 2）测定酶活力为什么要在进程曲线的初速度时间范围内进行?3）空白管中为什么最后才加酶液?你还可以设计出另一种空白管吗? 实验四 酸性磷酸酯酶米氏常数的测定1目的 掌握米氏常数(Km)及最大反应速度(Vm)的测定原理和实验方法，掌握可见分光光度计的使用。2原理 请参见实验一根据酶与底物形成中间配合物的学说，可以得到一个表示酶促反应速度与底物浓度之间相互关系的方程式，这就是酶学上著名的米氏方程：式中S为底物浓度，v为反应速度，Vm为最大反应速度，Km为米氏常数。由米氏方程可以推出，米氏常数Km等于反应速度达到最大反应速度一半时的底物浓度，米氏常数的单位就是浓度单位(molL或mmolL)。 测定Km和V m，特别是测定Km，是酶学工作的基本内容之一。在酶动力学性质的分析中，米氏常数Km是酶的一个基本特性常数，它包含着酶与底物结合和解离的性质。特别是同一种酶能够作用于几种不同的底物时，米氏常数Km往往可以反映出酶与各种底物的亲和力强弱，Km数值越大，说明酶与底物的亲和力越弱；反之，Km值越小，说明酶与底物的亲和力越强，Km值最小的底物就是酶的最适底物。测定Km和Vm，一般通过作图法求得。作图方法很多，其共同特点是先将米氏方程式变换成直线方程，然后通过作图法求得。本实验在测定酸性磷酸酯酶以磷酸苯二钠为底物的Km和Vm时，采用最常用的双倒数作图法(Lineweaver-Burk作图法)。这个方法是先将米氏方程两边同时取倒数，整理后得到：然后以1/v对1/S作图，可得到一条直线。这条直线在横轴上的截距为一1/Km，在纵轴上的截距为1/Vm，由此即可求得Km和Vm 3实验器材 请参见实验二4实验试剂 请参见实验二5操作 检查试管内是否干燥、洁净；若否，将其洗净并置于干燥箱内120烘干。 51酚标准曲线的制作 做过实验三的同学此步可免，直接应用上次的酚标准曲线。未做过实验八(3)的同学，请按实验三中“标准曲线的制作”的操作，先制作酚标准曲线，保留该数据，以便实验八(4)直接引用。 52底物浓度对酶促反应速度的影响一一Km和Vm的测定参见表，取试管7支，按照0至6的顺序逐管编号，空白管为0号。16号管加入不同体积的5 mmolL磷酸苯二钠溶液(pH56)，并分别补充0.2molL的pH56乙酸盐缓冲液至0.5mL。35预热2min(先用烧杯盛35的水，置于水浴锅中，再将试管放入烧杯中保温，以防试管滑落水中，参见实验八(2)的图8-2-4)，逐管加入35预热过的酸性磷酸酯酶酶液0.5 mL，开始计时，摇匀，精确反应10 min(酶液加入时为起始时间，碳酸钠溶液加入时为终止时间)。反应时间到达后立即加入5 mL1molL碳酸钠溶液，再加0.5 mL Folin酚稀溶液，摇匀，35保温显色约10min。 0号管内先加入0.5 mL 5 mmolL磷酸苯二钠溶液(pH 5.6)，再加入5 mL l molL碳酸钠溶液和0.5 mL Folin一酚稀溶液，最后加入0.5 mL酶液，其他操作与16号管相同。冷却后以0号管作空白，在VIS一7220型可见分光光度计680 nm波长处读取各管的吸光度A680。整个操作过程见表 用各管的A680在标准曲线上查出其对应的酚标准应用液的毫升数V，则产物的浓度为0 .4V(mmolL)，这样，各种底物浓度下的速度v=0.4V10(mmol(LmLmin)，取相应的倒数，填表8-4-2内。以l/v为纵坐标，1/S为横坐标作图，求出Km和Vm。53将用过的玻璃仪器和取样器套头洗净，清洁分光光度计(尤其是比色槽内)、清洗比色皿，整理好桌面上的仪器和试剂，井注意清洁自己的操作台，请老师验收，实验报告当场交给老师。7注意事项 参见实验二之注意事项。8思考题 1）为什么要用双倒数作图法而不是直接用米氏曲线来求米氏常数? 2）还有其他作图法可以准确求出米氏常数吗?试用本实验的数据，通过两种作图法来求米氏常数，并比较差异。实验五 酸性磷酸酯酶的检测SDS-PAGE电泳法1目的 熟悉垂直板型电泳槽的使用，了解SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质相对分子质量以及检测样品中蛋白质组分的一般原理，掌握SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作方法。2原理 聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr)和交联剂N，N一亚甲基双丙烯酰胺(N，N methylene-bisacylamide，简称Bis)在加速剂N，N，N，N四甲基乙二胺(N，N，N，Ntetramethyl ethylenediamine，简称TEMED)和催化剂过硫酸铵(anmonium persulfate(NH4)2S208，简称AP)或核黄素(ribofavin即vitaminB2)的作用下集合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(pelyacrylamide geI elec trephoresls，简称PAGE)。 用普通凝胶电泳分离大分子物质，主要依赖于各大分子所带电荷的多少、相对分子质量的大小及其分子的形状等差异。而要利用凝胶电泳测定大分子的相对分子质量，就必须将大分子所带电荷和分子形状的差异所引起的效应去掉或将其减少到可以忽略不计的程度，从而使大分子的迁移率完全取决于它的相对分子质量。 为了达到上述目的，目前较常用的方法是在电泳体系中加入一定浓度的十二烷基磺酸钠(Sodium dedecylsufate，SDS)。SDS是一种阴离子表面活性剂，它能破坏蛋白质分子的氢键和疏水键，使蛋白质变性为松散的线状，在强还原剂一巯基乙醇或二硫苏糖醇(DTT)的存在下，蛋白质分子内的二硫键被打开并解聚成组成它们的多肽链，解聚后的蛋白质分子与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质SDS复合物。蛋白质SDS复合物所带的SDS负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，这就消除了不同种类蛋白质分子之间原有的电荷差异，而且此复合物在水溶液中的形状像一个长椭圆棒，它的短轴对不同的蛋白质亚基SDS复合物基本上是相同的，约为180A (1.810-8m)，但长轴的长度则与蛋白质亚基相对分子质量的大小成正比，因此这种复合物在SDS聚丙烯酰胺凝胶系统中的电泳迁移率不再受蛋白质原有电荷和分子形状的影响，而主要取决于椭圆棒的长轴长度即蛋白质亚基相对分子质量的大小。当蛋白质的相对分子质量在1 2 000200 000时，电泳迁移率与相对分子质量的对数呈线性关系： lgMw=-b*mR+K 式中Mw相对分子质量； mR相对迁移率； b斜率； K常数。 实验证明，相对分子质量在12 000200000的蛋白质，用此法测得的相对分子质量，与用其他方法测得的相对分子质量相比，误差一般在土l0以内，重复性高。此方法还具有设备简单，样品用量甚微，操作方便等优点，现已成为测定某些蛋白质相对分子质量的常用方法。值得提出的是，此方法虽然适用于大多数蛋白质相对分子质量的测定，但对于一些蛋白质，如带有较大辅基的蛋白质(如某些糖蛋白)、结构蛋白(如胶原蛋白)、电荷异常或构象异常的蛋白质(如组蛋白F1)和一些含二硫键较多的蛋白质(如一些受体蛋白)等是不适用的，因为它们在SDS体系中，电泳的相对迁移率与相对分子质量的对数不呈线性关系。 聚丙烯酰胺凝胶有下列特性： (1)在一定浓度时，凝胶透明，有弹性机械性能好； (2)化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，在很多溶剂中不溶； (3)对pH和温度变化较稳定； (4)几乎无吸附和电渗作用，只要Acr纯度高，操作条件一致，则样品分离重复性好； (5)样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达610 g； (6)凝胶孔径可调节根据被分离物的相对分子质量选择合适的浓度，通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径； (7)分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体。因而较醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳等有更高的分辨率。凝胶浓度的选择与被分离物质的相对分子质量密切相关，本实验采用垂直平板形式以不连续系统的SDS_聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，凝胶浓度为10。 聚丙烯酰胺凝胶电泳分为连续系统与不连续系统两大类。 不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成，浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH68的TrisHCl。分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.8 TrisHCl。电极缓冲液是pH83 Tris-甘氨酸。2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH使不连续体系形成了凝胶孔径、pH、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素。 SDS_PAGE电泳不仅能测定未知蛋白质的相对分子质量，也能检测样品中蛋白质的组成情况，根据电泳图谱中区带的存在与否、色泽深浅以及所处的相对分子质量范围，可以判断样品中是否含有某种蛋白质，有哪些杂蛋白组分，各蛋白质组分的相对含量等信息。本实验采用SDS不连续系统垂直板型电泳检测从绿豆芽中提取的粗酶溶液中酸性磷酸酯酶以及杂蛋白的组成情况。酸性磷酸酯酶的相对分子质量为55000土5 0003实验器材 1 ）DYY-4型常压电泳仪：北京市六一仪器厂生产，参见图85一13，请观看光盘中的视频凝胶电泳仪的使用，l套组。 2） DYCZ-24E电泳槽：参见图859图8510，请观看光盘中的视频凝胶电泳仪的使用，l套组。 3 ）DYCZ-24E制胶装置；参见图853图854，1套组。4 ）HH2型数显恒温水浴锅：参见实验一，公用。5）取样器：请参见实验一，1 mL、5 mL各1支组。6 ）PHS-3C型pH计；上海雷磁仪器厂生产，配试剂时教师使用7 ）100mL小烧杯：2只组。 8）电炉：公用。 9） 500mL烧杯：公用。 10）泡沫架(3孔)：1个组。 11）不锈钢镊子：公用。 12 ）100uL微量注射器：1支组。 13）透明塑料饭盒：1只组。 14） Eppendorf管：公用。 15）洗瓶(内装重蒸馏水)：1只组。 16）药勺：1支组。 17）刀片：1片组， 18）脸盆：1个组。4实验试剂 1） 0 .5 mgmL的Marker标准蛋白质溶液：称取低相对分子质量的标准蛋白质Marker样品0.5 mg放人洁净的1.5 mL的Eppendorf管中，加入1mL“1样品稀释液”(即“2样品稀释液”再稀释1倍的产物)，使之溶解，再按每管100uL分装，贮存于-20冰箱中备用。