（光学工程专业论文）拉曼光谱在DNA、蛋白质检测及墨迹鉴定中的应用.pdf

学位论文独创性声明 本人郑重声明： l 、坚持以“求实、创新的科学精神从事研究工作。 2 、本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作和取得的研究成 果。 3 、本论文中除引文外，所有实验、数据和有关材料均是真实的。 4 、本论文中除引文和致谢的内容外，不包含其他人或其它机构已 经发表或撰写过的研究成果。 5 、其他同志对本研究所做的贡献均已在论文中作了声明并表示了 谢意。 作者签名： 日期： 学位论文使用授权声明 本人完全了解南京师范大学有关保留、使用学位论文的规定，学 校有权保留学位论文并向国家毒管部门或其指定机构送交论文的电 子版和纸质版；有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论 文进入学校图书馆被查阅：有权将学位论文的内容编入有关数据库进 行检索；有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在 解密后适用本规定。 作者签名：煎航缝j 他 日 期：呈q q ! 堡垒基婴功7 匆，玛 拉曼光潜在d n a 、蛋白质检测及墨迹鉴定中的应用 摘要 不同p h 值的酸液对生物体会造成不同的影响，医学上曾采用醋酸直接处理 肿瘤并应用于临床，并取得满意的效果。因此研究在不同的酸度条件下处理 d n a 、蛋白质后其分子结构的变化是一件非常有实际意义的工作。本文利用显 徼拉曼光谱研究了不同p h 值的酸性溶液对小牛胸腺d n a 的影响以及在相同酸 度条件下经过不同的时间后的分子结构的变化和不同p h 值的酸性溶液对溶菌酶 溶液构象的影响。此外，运用拉曼光谱技术对签字笔、圆珠笔的墨迹进行了有效 的鉴定并参与了司法鉴定中心的墨迹鉴定工作，对不同书写时间和书写在不同种 类纸张上的墨迹的拉曼光谱进行了初步的数据分析。围绕以上三个方面，主要做 了以下一些工作： 1 测试了p h 6 0 、p h 5 0 、p h 4 0 、p h 3 0 、p h 2 0 、p h l 0 小牛胸腺d n a 的 酸性溶液的拉曼光谱。实验结果表明：d n a 分子内部产生了明显的质子化，其 拉曼特征频率和强度均发生了变化，而且不同的p h 值致使它们的变化程度也不 同。对d n a 分子结构的影响包括磷酸骨架基团、脱氧核糖及碱基。随着酸性的 增强，d n a 的构型也发生了变化。 2 测试了p h 3 0 、p h 2 0 、p h l0 小牛胸腺d n a 的酸性溶液且分别经过l h 、 2 h 、1 2 h 和2 4 h 水合后的拉曼谱图。实验结果显示：d n a 分子内部发生了明显 的质子化作用，其拉曼特征频率和强度均发生了不同程度的变化，而且随着不同 的p h 值和不同时间的酸处理它们的变化程度也不同。从p h 3 0 开始，随着酸性 的增强和时间的延长，d n a 溶液质子化程度逐渐加深，直到p r l l ，0 时其双螺旋 结构遭到严重的修饰和发生变化。 3 测试了p h 5 0 、p h 4 0 、p h 3 ，0 、p h 2 0 、p h i 0 溶菌酶的酸性溶液的拉曼 光谱。由此定性可知：该蛋白质分子的肽链主要由旺一螺旋和无规则卷曲组成。在 酸化的过程中，溶菌酶的构象基本一直保持稳定，但当p h 2 ，0 时，该溶菌酶 开始变性。在p h 5 0 时酸氨酸为“暴露式”。当p h 4 0 p h 2 0 为“埋藏式”，而 到了p h i 0 时酪氨酸的双峰已基本消失了。色氨酸的1 3 6 1c m “的强度随酸性的 增强而减弱，由“埋藏式”逐渐转化为“暴露式”。硫硫桥键的振动谱带按p h 5 0 到p h i 0 的顺序分别在5 0 8c n l 、5 0 8e m l 、5 0 7t i l l 一、5 0 7c m 和5 0 9c m ，且 强度基本不变，表明在酸环境中，硫，硫键部位的几何构型都是扭曲一扭曲扭曲， 拉璺光谱在d n a 、蛋白质检测及墨迹鉴定中的应用 p h 值的改变对几何构型无影响。 4 用可见5 1 4 5 r i m 和紫外3 2 5 n m 的波长激光作激发光源，分别测试了不同品牌 的黑色圆珠笔，蓝色圆珠笔和黑色签字笔墨迹的拉曼谱图。在可见5 1 4 5 r i m 激光 的激发下，黑色和蓝色圆珠笔墨迹都呈现了丰富的拉曼特征峰而黑色签字笔仅出 现了碳峰的信号；此时改换3 2 5 n m 激光来激发，发现黑色签字笔墨迹出现了清 晰的拉曼特征谱峰。通过实验数据对比发现：同一类型且不同品牌笔的墨迹拉曼 特征谱峰存在一定的差异，而同一种品牌墨迹的拉曼峰都保持了相对的稳定。还 用紫外3 2 5 n m 激光作激发光源，测试了经不同书写时间的墨迹的拉曼光谱，通 过谱图分析可知：黑色墨迹的拉曼光谱在最初书写的那段时间是变化最快的，到 第二天以后变化比较缓慢，但总体趋势是本底下移，碳峰的尖锐程度降低。同时 也测试了书写在不同纸张上的墨迹的拉曼光谱，分析可知：不同纸张上书写同一 品牌墨迹，它们的谱线是否一致对签字笔品牌种类具有选择性。 5 参与了江苏省公安厅物证鉴定中心和南京师范大学司法鉴定中心的墨迹鉴 定工作，利用拉曼光谱技术对文书、借据上的墨迹进行了横向的不同品牌的辨别， 准确科学的实验数据以及对样品无损的特点得到了相关工作人员的肯定，为法庭 判案提供了充分的科学依据。 关键词：拉曼光谱；质子化；小牛胸腺d n a ；溶菌酶；分子构象； 墨迹；鉴定 拉曼光诺在d n a 、蛋白质榆测发墨迹鉴定中的应用 a b s t r a c t a c i da tv a r i o u sp hh a v ed i f f e r e n te f f e c t0 1 1o r g a n i s m i nm e d i c a ls c i e n c e ， t u n l o r so n c cd i r e c t l yh a v eb e e nt r e a t e db ya c e t i ca c i da n da p p l i e dt oc l i n i c a lp a t i e n t s a l lt h i sh a v eg o t t e nw o n d e r f u la c h i e v e m e n t s s ot h e ya r em e a n i n g f u lw o r k sw h i c h s t u d y , t h em o l e c u l ec o n f o r m a t i o nc h a n g eo f d n a a n dp r o t e i no nt h ec o n d i t i o no f a c i d a tv a r i o u sp h b yr a l n a ns p e c t r o s c o p i ct e c h n i q u e ，w eh a v es t u d i e dt h em o l e c u l e c o n f o r m a t i o nc h a n g eo fd n ao fc a l ft h y m u sw i t ha c i da tv a r i o u sp ha n da tt h es a m e p ha r c rd i f f e r e n tt i m e w ea l s or e s e a r c h e dt h ee f f e c t so fm o l e c u l ec o n f o r m a t i o no f l y s o z y m es o l u t i o nt r e a t e dw i t ha c i da tv a r i o u sp h b e s i d e s ，w eh a v ei d e n t i f i e dt h o t y p e so ft h ei n km a r k so ft h eg e li n kp e na n db l u eb a l lp e n a n dw eh a v ed o n et h i s w o r kf o rt h ed i s c r i m i n a t i o nc e n t e ro fm a t e r i a le v i d e n c e r e v o l v i n ga r o u n dt h r e e a s p e c _ t sa b o v e ，w eh a v ed o n et h ef o l l o w i n gw o r k s ： 1 n i er a m a ns p e c t r ao f d n a i na c i d i cs o l u t i o nd i v i d e di n t op h 6 0 、p h 5 0 、p i - t 4 0 、 o h 3 0 、p h 2 0a n dp h l 0w e r em e a s u r e d ，t h er e s u l t ss h o w e dt h a tp r o t o n a f i o no f d n ao c c u r r e da n dt h er _ a 】t n a nc h a r a c t e r i s t i cs h i f t sa n dt h e s ei n t e n s i t i e sw e t e c h a n g e di l ld i f f e r e md e g r e ef o rv a r i o u sp hv a l u e s w i t ht h ea c i di n c r e a s e d t h e c o n f o r m a t i o no f d n aa l s oc h a n g e d 2 1 kr a l n a ns p e c t r ao f d n ai na c i d i cs o l u t i o na t 蚤h 3 0 、p h 2 0 、p h i 0a f t e rl h 、 2 h 、1 2 h 、2 4 hw e r em e a s u r e d ，t h er e s u l t ss h o w e dt h a t p r o t o n a t i o no fd n a o c c u r r e da n dt h er a n l a nc h a r a c t e r i s t i cs h i f ta n di n t e n s i t yw e r ec h a n g e di n d i f f e r e r t td e g r e ea tv a r i o u sp ha n da f t e rd i f f e r e n tt i m e t h ep r o t o n a t i o no fd n a c h a n g e dg r a d u a l l yd e e p e rf r o mp h 3 0t op h l 0 u pt op h l 0 ，t h ec o n f o r m a t i o no f o r i g i n a ld o u b l eh e l i xw a sm o d i f l e da n dc h a n g e d 3 1 kr a l i l a ns p e c t r ao fl y s o z y m es o l u t i o nt r e a t e dw i t hv a r i o u sp h ( f r o mp h 5 0t o p h l 0 ) h a v eb e e nm e a s u r e d t h u sa l lt h ec h a r a c t e r i s t i c r a m a nb a n d so ft h e p r o t e i n p r o v e dt h a tt h e i rs t r u c t u r ec o n s i s to ft h ea - h e l i xa n dr a n d o mc o i l i nt h e p r o c e d u r eo fa c i d i t y , t h ec o n f o r m a t i o no fl y s o z y m cw o u l dk e e ps t a b l e ，b u ta tp h 2 ，0 ，t h el y s o z y m eb e g i nt od e n a t u r e a tp h 5 0 ，t h et y r o s i n er e s i d u ea r e e x p o s e d ，a tp h 4 0 p i - 1 2 0t h et y r o s i n er e s i d u ea l e b u r i e d ”，a tp h i 0 ，t h e 5 拉曼光谱在d n a ，蛋白质检测及墨迹鉴定中的应用 r a l l a nb a n d so ft h et y r o s i n er e s i d u ea l m o s th a v ev a n i s h e d n l ei n t e n s i t yo ft h e 1 3 6 1c m ，p e a ki nt r y p t o p h a nd e c r e a s e sw i t hi n c r e a s ei na c i d i t ya n ds l o w l y c h a n g ef r o m “b u r i e d t o “e x p o s e d ”t h er a m a nb a n d so ft h ed i s u l f i d eb r i d g e c c - s s c - ca p p e a ra t5 0 8 ，5 0 8 ，5 0 7 ，5 0 7a n d5 0 9c r n 1 ，a n dt h e i ri n t e n s i t i e s a l m o s td on o tc h a n g e a sc a nt h e yi n d i c a t e 也i nt h ee n v i r o n m e n to fa c i d ，t h e c o n f o r m a t i o no f t h ed i s u l f i d eb r i d g es - sa l w a y si sg a u c h e g a u c h e g a u c h e 4 n 地r a m a ns p c c l l 甚o fd i f f e r e n tb r a n d s i n km a r k sb ys p e c t r o s c o p i ct e c h n i q u e w e r em e a s r t e x t a l lr a m a ns p e c t r aw e r ee x c i t e dw i t l l3 2 5 n ma n d5 1 4 5 n m r a d i a t i o n w i m5 1 4 5 r i mr a d i a t i o n , t h ei n km a r k so f b l a c ka n db l u eb a l lp e nh a v ea l o to fr a m a ns p e c l r a ；b u tt h er a m a ns p e c t r ao ft h eg e li n kp e n so n l yh a v eb a n d s o fc a r b o n a tt h es a l l l et i m e ，t u n e dt o3 2 5 n ma st h ee x c i t i n gl i n e , l o t so fc l e a r r a m a ns p e c t r aa p p e a r e d i ti si n d i c a t e dt h a tt h ed i s t i n c t i v e n e s so fr a r n a ns p e c t r a o f i n km a r k so f t h es a m ek i n da n dd i f f e r e n tb r a n d sp e n se x i s t e d 5 w et a k ep a r ti nt h ej o bo ni n k b l o td i s c r i m i n a t i o n 、v i 也d i s c r i m i n a t i o nc e n t e ro f p o l i c eb u r e a uo fj i n g s up r o v i n c ea n dd i s c r i m i n a t i o nc e n t e ro fn a n j i n gn o r m a l u n i v e r s i t y w i t ht h et e c h n o l o g yo fr a r n a ns p e c t r o s c o p yw ei d e n t i f yt h ed i f f e r e n t k i n k so fi n k b l o ti nt h et e x t so rn o t e s f o rt h ec h a r a c t e r i s t i c so fa c c u r a t ed a t e so f e x p e r i m e n t sa n dn o n - d e s t r u c t i v et os a m p l e ，t h ej o bh a sb e e na d m i t t e db yt h e w o r k e r si nt h ec e n t e r s ，p r o v i d i n gt h e e b o u g hs c i e n t i f i cp r o o ff o rt h es e n t e n c eo f t h ec o u r t k e yw o r d s r a m a ns p e c t r a ；p r o t o n a f i o n ；d n ao fc a l ft h y m u s ；l y s o z y m e ； m o l e c u l a rc o n f o r m a t i o n ；i n k b l o ld i s c r i m i n a t i o n 6 一 拉曼光谱在d n a 、蛋白质检测及墨迹鉴定中的应用 ( 一) 拉曼光谱简介 第一章绪论 1 光散射现象及拉曼效应的历史渊源 光散射是自然界常见的现象。当一束光照射到介质时，大部分的光被介质 反射或透过介质，另一部分的光被介质向四面八方散射。晴朗的天空呈蓝色，早 晚东西方的空中出现红色霞光，广阔的大海是一幅深蓝色的景象。早在1 8 7 1 年， 这些现象已经用大气和海水对太阳光的瑞利散射予以圆满的解释。另一种光散射 现象是由不均匀的介质或悬浮尘埃颗粒的介质所引起的，称丁铎尔( t y n d a l l ) 散 射( 1 9 0 8 年) 。瑞利散射和丁铎尔散射的频率都与入射光的频率相同【1 】。1 9 2 3 年德国的s m e k a 理论上预言了光的非弹性散射；1 9 2 6 年印度物理学家r a n l a n 在 论文中开始并没有肯定这种散射是非弹性的，以后的许多次实验最终证明了这种 散射的非弹性，他将这种效应称为“一种新辐射”；1 9 2 8 年，r a n l a n 和k i s h n a n 首先在液体苯中观察到了这种散射效应。此后不久，俄国物理学家l a r d s b e r g 和 m a n d e l s t a m 在石英中也发现了同样的光散射现象，他们称之为“联合散射光谱”， 同时，c a b a n u e s 和r o c a r d 在巴黎也证实了r a m a n 的观察结果，p r i n g s h e i m 撰文 总结并指出r a m a n 发现的是一种全新的现象，并建议称之为g a m a n 效应，即在 1 9 2 8 年，有关r a m a n 效应的论文就发表了5 8 篇，第二年就多达1 7 5 篇，这在当 时是数量惊人的。1 9 3 0 年4 2 岁的r a m a n 为此获得了诺贝尔物理学奖，这是亚洲 人获得的第个诺贝尔科学奖。在散射辐射的光谱中，除了含与入射光相同频率 的散射光外，还有更多与入射光频率发生位移( 频移增加和减少) 且强度极弱的 谱线。前者就是已知的瑞利散射。后者是新发现的，是由分子振动所引起的散射。 新发现的谱线称作拉曼线或拉曼带，合起来就说它们构成一个拉曼光谱。绝对波 数小于入射波数的拉曼带称作斯托克斯带，而绝对波数大于入射波数的带称为反 斯托克斯带 2 】。 2 拉曼散射的量子理论 当频率为v o 的单色光作用于分子时，可能发生弹性碰撞或非弹性碰撞。原 来处于基态e 间的分子受到能量为h v 。的入射光子激发而跃迁到一个受激虚态， 拉曼光谱在d n a 、蛋白质榆测及墨迹鉴定中的麻用 把吸收的能量h v 。以光子的形式释放出来，然后回到基态日锄，此过程对应于弹 性碰撞，为瑞利散射线；处于受激虚态的分子也可以辐射跃迁到某激发态e v 。 这种过程对应于非弹性碰撞，光子的部分能量1 1 、，传递给分子，辐射跃迁的频率 为v o v ，为拉曼散射的斯托克斯线。类似的过程也可能发生在处于激发态e v = l 的分子受到能量为l l v 0 的入射光子激发而跃迁到受激虚态，而后辐射跃迁回到激 发态e v - l ，此过程对应于弹性碰撞，辐射跃迁的频率为v o ，为瑞利散射线；处于 虚态的分子也可跃迁到基态e 间，这种过程对应于非弹性碰撞，光子从分子振动 或转动中得到能量，辐射跃迁的频率为v 押，为拉曼散射的反斯托克斯线。在瑞 利散射中光子仅改变动量，而不改变能量；在拉曼散射中，光予不仅改变其动量， 还同时发生光子能量与分子振动转动能量之间的交换。不难看出，斯托克斯线和 反斯托克斯线与瑞利线之间的能量差分别为如和h v ，即二者对称地分布于瑞利 线两侧 1 】。如图1 1 所示。 ev = i ev = 0 一 、 虚卷 。一 - l 一 、hv o hvo h ( vo _ ( vo v ) l h v 。 h vo 、l， 、 ， 摄动自 r 、， 、 ， 红外吸收瑞利散射 拉曼散射 反斯托克斯钱 图1 1 拉曼和瑞利散射的能级图 从图1 1 我们不难看出，对于斯托克斯线，是从基态到高能态跃迁：而反斯 托克斯散射是从高能态跃迁到基态。在常温下，处于基态的分子占绝大部分，所 以观察到的斯托克斯线的强度远远大于反斯托克斯线的强度【2 】。 3 拉曼效应的特点 ( 1 ) 每一种物质( 分子) 有自己的特征拉曼光谱，因此可以表征这一物质。 ( 2 ) 每一种物质的拉曼频率位移( 即入射频率与散射频率之差) 与入射光的频 率无关。拉曼散射是瞬时的，即入射光消失时，拉曼散射在l o 。1 1 0 。2 s 后消失。 拉曼光谱在d n a 、蛋白质检测及墨迹鉴定中的麻用 ( 8 ) 4 ( 1 ) ( 2 ) ( 3 ) ( 4 ) 拉曼谱线的线宽一般较窄，并且成对出现，即具有数值相同的正负频率差。 在短于入射光波长一边的称为反斯托克斯线，在长于入射光波长一边的称 为斯托克斯线。 拉曼频率位移的数值可从几个波数( e r a 1 ) 到4 0 0 0 个波数。 一般的拉曼频移是分子内部振动或转动频率，有时与红外吸收光谱所得的 部分频移重合，波数范围也是相同的。 拉曼谱线的强度和偏振性质，对于各条谱线是不同的。 量子论说明拉曼效应为光子与分子发生非弹性碰撞而发生的，在分子做拉 曼散射的同时，还有比拉曼散射强几个数量级的瑞利散射，其波长与入射 光的波长相同。 拉曼效应普遍存在于一切分子中，无论是气体、液体或固体。 拉曼光谱的技术特点 对所测试的样品没有选择性，即可以是固体、气体或液体。对样品的量也 没有严格的要求，适于微量和痕量的研究。 对样品进行无损分析，尤其是稀有或是珍贵的样品，也适用于包裹体的测 量。 在可见光区域拉曼散射光不会被玻璃吸收，所以散射样品可以放置在玻璃 制成的样品池中。 由于水是拉曼散射很弱的物质，因此可以直接测量水溶液样品的拉曼光 谱，而无需考虑水分予振动对样品的影响。 ) i ) o “ o 拉曼光谱在d n a 、蛋白质检测及墨迹鉴定中的应用 ( 二) 拉曼光谱仪器简介 激光拉曼光谱仪主要由光源、外光路系统、样品池、单色器、信号处理及输 出系统五部分组成，示意图如1 2 1 所示。它又可以分为色散型激光拉曼光谱仪、 傅立叶变换拉曼光谱仪和共焦显微拉曼光谱仪 图1 2 1激光拉曼光谱仪示意图 进入9 0 年代，拉曼光谱仪的研制获得了重要进展。研制出新代激光共焦 显微拉曼光谱仪，下面就简单介绍一下它的组成和基本原理。 1 主要组成 激光器作为单色光源，有可见光和近红外激光器，以及紫外激光器可选择； 有能抑制瑞利散射，可高效透过拉曼信号的全息滤光片；有二维c c d 探测器， 能够在可见和近红外区进行有限噪声关闭检测；有计算机数据处理系统和探头 等。 2 共焦显微拉曼光谱仪基本原理 ( 1 ) 激光可经由物镜聚焦成单一的光点来照射样品特定深度的某一点( 光斑半 径约为l 岫) 。 ( 2 ) 拉曼散射光经由物镜聚焦成单一的光束，完全通过c c d 前的狭缝。 ( 3 ) 其他在焦点之上或之下的非焦点所产生的背景散射在狭缝周围被阻挡下 来。 垫星垄堕堡型垒：笙璺堕叁塑垄里丝整塞! 堕壁旦 图1 2 2 共焦显微拉曼光谱仪基本原理 拉曼光谱在d n a 、蛋自质检测及墨迹鉴定中的应用 ( 三) 拉曼光谱在d n a 、蛋白质及墨迹鉴定研究中的应用 1 d n a 是生物遗传信息的载体，是生物遗传的物质基础。d n a 分子由磷酸、 戊糖( 脱氧核糖核) 和碱基组成。碱基包括腺嘌呤( a d e n i n e ，a ) 、鸟嘌呤 ( g u a n i n e ，g ) 、胞嘧啶( c y t o s i n e ，c ) 、胸腺嘧啶( t h y m i n e ，d 。 目前公认的d n a 双螺旋结构，包含有a 、b 、c 、z 等空间构型。随着细胞 研究工作的深入，许多问题更需要在分子水平上去研究。比如，药物、温度、 紫外线、酸度、丫射线、高能质子对d n a 的损伤和影响，通过对作用前后的d n a 的拉曼光谱分析，可以获知d n a 的a 、g 、c 、t 、脱氧核糖和整个d n a 骨架 的转动和振动以及空间构型变化的很多重要信息。 对d n a 拉曼光谱研究已被许多学者所重视，诲以明【3 】、李尉【4 】、王杰芳 5 7 】 等都对d n a 受不同刺激因子影响所产生的影响方面进行了细致深入的研究，也 有人对d n a 的温度效应 8 9 】进行了报道，但到迄今为止，未曾有人对经过不同 p h 值的酸处理后的d n a 溶液以及经过不同p h 值不同时间酸处理的d n a 溶液的拉 曼光谱进行过研究。为此，我们通过拉曼光谱技术研究了不同p h 值的酸对d n a 的损伤和影响，并在某些p h 值点分析了它随时间纵向变化的特点。 2 蛋白质是生命的物质基础，它与其外部自然界不断的新陈代谢。蛋白质分子 是由氨基酸首尾相连而成的共价多肽链( p o l y p e p t i d ec h a i n ) 从蛋白质( 包括酶) 的拉曼光谱可以同时得到许多可贵的信息，不但能够得到有关它的芳香族基团组 成氨基酸的信息，如苯丙氨酸的单基取代苯基环，色氨酸的吲哚环和酪氨酸的对 羟基环的信息，以及后二者存在形式( “埋藏的”或“暴露的”) 随其微环境而 变化的信息。还能进一步得到二级结构的信息，例如，a 螺旋，p 折迭，p 回折， 无规则卷曲方面的信息。 柯惟中对溶菌酶溶液进行了拉曼光谱测试，分析了它的氨基酸信息、肽链结 构组成，侧链环境和构型，得出其二级结构【1 0 】；许以明通过拉曼光谱研究了光 敏类药物对蛋白质的损伤【1 1 1 2 】；也有人用p h 诱导来进行光谱分析芳香氨基酸 残基微环境的变化【1 3 】。我们进一步用不同p h 值的酸去处理溶菌酶溶液，进行 拉曼光谱测试，进而分析酸对蛋白质的二级结构和环境所产生的影响。 3 近年来，随着经济犯罪和民事纠纷案件的日益增多，针对合同、票据、文件 拉曼光请在d n a 、蛋臼质擒测及墨迹箍定中的应用 中的伪造内容、签名和日期给公安，法院部门工作者造成了一定的麻烦，如何快 速、准确、无损的检验墨迹的真伪显得尤为关键。拉曼光谱在墨迹鉴定方面也有 着广泛的应用，利用拉曼光谱技术可以测量那些痕量的样品，分析速度快，对样 品无需进行任何处理就可直接进行无损检测。我们利用显微拉曼光谱技术，系统 地对市面上常用的黑色签字笔，黑色圆珠笔和蓝色圆珠笔的墨迹分别进行了测 试，在实验中发现：三种不同类型的笔的墨迹有着明显区别的拉曼谱峰，而同一 类型但不同品牌笔的墨迹有着各自不同的稳定的特征拉曼谱峰，从各种类型和品 牌所对应的峰位就可简单、快速的辨别出它所属的类型和品牌。 拉曼光谱在d n a 、蛋白质检测及墨逊咎定中的麻用 第二章不同p h 的酸液对d n a 和蛋白质的损伤 ( 一) 不同p h 值的酸处理d n a 溶液的拉曼光谱分析 1 引言 研究生物大分子构象 1 0 】在不同的酸度处理下分子结构的变化是件非 常有意义的工作。医学上采用酸直接处理肿瘤并应用于l 临床，已取得较为满意的 成果 1 8 1 ，同时在细胞水平对其作用机理进行了一些研究。随着细胞研究工作的 深入，许多问题更需要在分子水平了解不同酸度处理对生物体分子的影响。d n a 是生物遗传信息的载体，是生物遗传的物质基础，也是一个很好的受体。曾有多 篇文献研究过酸化对d n a 的影响，比如文献【1 8 】报道过乙酸对鲱鱼精d n a 空间 结构损伤的拉曼光谱研究，同时也对乙酸对d n a 损伤的作用机理进行了探讨， 文献 1 9 ，2 0 也报道了对鲱鱼精d n a 纤维用p h l 8 5 酸溶液处理不同时间后的拉 曼光谱分析。 d n a 分子的构型有a 、b 、c 、z 等多种，在正常的生理环境里，d n a 构 型为b 型。c y t o l o g i c a l 的研究表明：d n a 分子在低p h 酸化作用时，会发生d n a 构型由b z 的转变，在p h 3 6 酸化的条件下，d n a 分子开始发生质子化作 用，a t 碱基对和g c 碱基对发生氢键分离，当p h i 2 2 酸化时完全分离( 不可 逆) 【2 1 。t a j m i r - r i a h i 研究小组用三价的铝和钙离子药物及阿司匹林与小牛胸腺 d n a 相互作用，也观察到a 、b 构型之间的转变 2 2 , 2 3 。我们也曾研究过在紫 外照射条件下，d n a 分子的构型不稳定，可在b 、a 之间转化 2 4 1 。但迄今为止， 未见有对d n a 分子酸化过程中逐点检测d n a 分子构型变化的报道。 我们利用拉曼光谱技术研究小牛胸腺d n a 的酸溶液( p h 6 0 、p h 5 0 、p h 4 0 、 p h 3 0 、p h 2 0 、p h l 0 ) ，逐点测试得到了各个p h 值点的d n a 分子拉曼谱图并 进行分析。通过实验发现，在酸化的过程中确实存在着d n a 构型由b c z 的转变，并分析了该过程中d n a 分子拉曼特征峰的峰位和强度变化的情况，进 而得到d n a 的磷酸骨架、脱氧核糖、碱基等组分随p h 值变化的重要的信息。 拉曼光潜在d n a 筮出质榆测及墨迹鉴定中的应用 2 实验 小牛胸腺d n a 为购自于美国s i g m a 公司的白色固体纤维，将其称取各为1 0 m g 的6 份。同样称取各为3 2m g 的6 份n a 2 s 0 4 粉末，用p h 6 0 、p h 5 0 、p h 4 0 、 p h 3 0 、p h 2 0 、p h l 0 的磷缓溶液分别将其溶解，配制成0 0 4 5t o o l l 的溶液， 再分别用针管抽取1 9 0g l 的p h 6 0 p h l 0 的n a 2 s 0 4 酸溶液，用其将6 份d n a 纤维溶解，这样便制得6 份5 d n a 酸溶液样品，其p h 值分别为6 0 、5 0 、4 0 、 3 0 、2 0 和1 0 。将其放置在4 c 冰箱中，经2 4 小时以达到充分水合，再取出分 别测其拉曼谱图，以硫酸根s 0 2 - 4 的9 8 1c l n 1 为内标，以此作为各拉曼峰强度变 化的依据。在实验前先测试了6 份磷缓溶液的拉曼谱图，均未见明显拉曼峰。 样品的拉曼测试均在室温( 2 2 ) 下进行。实验在法国j o b i ny v o n 公司 l a b r a mh r 8 0 0 型激光共焦显微拉曼谱仪上完成。由c c d 进行信号接受和光 电转换。由光谱物理公司的1 6 3 型氩离子激光器作光源，激发线波长5 1 4 5n m ， 出射功率1 0m w 。狭缝宽2 0 0i x m ，每个样品都重复扫描3 次以上，各样品的拉 曼谱图都由计算机作信号累加平均并绘图输出，峰位误差小于3c m l 。 3 结果与讨论 测试的p h 6 0 、p h 5 0 、p h 4 0 的5 d n a 溶液拉曼谱图见图2 1 1 ，p m 0 、 p h 2 0 、p h l 0 的5 d n a 溶液拉曼谱图见图2 1 2 ，有关的拉曼特征频率和指认 列于表2 1 1 。a ，g ，c ，t 分别代表碱基腺嘌呤，鸟嘌呤，胞嘧啶和胸腺嘧啶 的振动特征。在表中按照它们对谱线的贡献大小排列。谱线中9 8 1 c m 。作为内标， 各谱中以它的强度作为l ，在此基础上计算了不同p h 值的d n a 溶液中各个基 团的谱线强度的变化率。谱线强度的变化率为负值时，说明它所属的基团的化学 键受到了损伤，当基团和化学键被修饰时谱线的位移是明显的 2 5 1 。 ( 1 ) p h 值对骨架磷酸基团、d n a 构象的影响 在拉曼光谱里，d n a 主链结构里表征磷酸二脂键伸缩振动的8 0 5 8 1 6 c m 4 谱线被看作是a 型双螺旋规则结构的标志，而b 式构型的拉曼峰出现在8 3 5 c m d 左右，c 式构型的拉曼峰出现在8 6 5 8 8 0c r l l 以1 1 8 1 。因此从测得的拉曼光谱就可 以方便地判断出d n a 是属于哪种构型。在p h 6 0 、p h 5 0 的拉曼谱图里，在8 0 5 8 1 6 c m “范围内始终未见有明显的拉曼谱峰，而在p h 6 0 、p h 5 0 、p h 4 0 、p h 3 0 和p h 2 ，0 的拉曼谱图里都有8 3 5 e m 。左右的拉曼谱峰，但在p h i 0 时8 3 5 c m - 1 左 拉曼光谱存d n a 、蛋白质检测及墨迹答定中的应用 右拉曼谱峰消失了。这表明从p h 6 0 到p h 2 0 酸溶液环境中的d n a 分子一直以 b 型结构形式存在着，但在p h l 0 酸溶液的环境下d n a 己不再是b 型结构了。 曾有文献报道过，经p h 2 6 酸处理后的d n a ，会出现8 7 7a m 。左右的拉曼谱峰， 表2 ，1 1 经2 4 小时酸处理后的拉曼光谱及指认 r a t l l a l ls k i f f ( c m 1 ) t e n t a t i v e i na q u e o u s p h a s s i g n m e n t s s o l u t i o n 6 o 5 o4 03 02 01 o 6 4 86 4 86 4 86 4 8c 6 7 36 7 1 6 7 26 6 9tg 6 8 l 6 8 1 6 7 96 8 16 8 2g 7 3 07 2 87 2 97 2 87 2 97 2 0a 7 5 27 5 i7 5 57 5 17 4 97 5 0t 7 8 97 8 67 8 67 8 77 8 77 8 6t c 7 ( o - p 0 1 8 1 5 7 ( o - p - o ) a t y p e 8 3 68 3 08 3 28 3 88 3 5 8 2 5 丫( o - p o )b t y p e 8 8 l 8 8 48 8 28 7 9 8 7 78 7 88 9 1 d e o x y r i b o s e 9 2 29 2 09 1 99 2 09 2 5 9 1 9 d e o x y r i b o s e 9 4 59 5 09 4 39 3 6 d e o x y r i b o s e 9 7 5 9 5 9 9 5 4 d e o x y r i b o s e 1 0 0 11 0 0 01 0 0 3 d e o x y r i b o s e 1 0 9 4 1 0 9 3 1 0 8 51 0 9 21 0 9 21 0 9 11 0 7 5 t ( p o 2 ) 1 1 4 6 1 1 4 51 1 4 7 1 1 4 1 1 1 4 51 1 4 9 d e o x y r i b o s e 1 1 5 31 1 4 91 1 5 11 1 5 91 1 4 61 1 4 9 d e o x y r i b o s e - p h o s p h a t e 1 1 8 0 1 1 7 81 1 8 71 1 8 5 tc 1 3 0 2 1 3 0 31 3 0 21 3 0 31 3 0 4a 1 3 4 31 3 4 1i 3 4 21 3 4 i1 3 3 91 3 3 5a 1 3 7 6 1 3 7 51 3 7 31 3 7 6 1 3 7 31 3 7 5tag 1 4 2 41 4 2 11 4 1 9 1 4 2 21 4 2 31 4 1 2ag 1 4 5 51 4 5 21 4 5 91 4 6 21 4 6 41 4 6 0 d e o x y r i b o s e - p h o s p h a t e 1 4 8 7 1 4 8 81 4 9 11 4 9 i1 4 8 91 4 8 8 ga 1 5 1 91 5 1 51 5 1 91 5 1 41 5 l o1 5 l la 1 5 8 2 1 5 7 8 1 5 7 91 5 7 71 5 7 8ga 1 6 7 2 1 6 6 91 6 6 31 6 6 81 6 6 8 i 6 6 7 “c 2 0 ) ，r s t r e t c h i n gv i b r a t i o n 拉曼光蒋在d n a 、蛋白质检铡及墨迹鉴定中的应用 。 卑 三 各 是 蛊 鼍 2 0 0l 伽01 2 0 01 , 0 f l1 6 0 0 r a m a i ls h i r ( c m 一1 ) p h 4 0 口h 5 d p i f 6 0 图2 1 1 分别经过酸( p h 4 0 ，p h 5 0 ，p h 6 0 ) 处理后d n a 的拉曼光谱 6 锄l 01 2 0 01 4 0 0 r a r l l a ns h i i t ( c m 1 ) 口h 1 d d 0 p h 3 d 图2 1 2 分别经过酸( p i l l 0 ，p h 2 0 ，p h 3 0 ) 处理后d n a 的拉曼光谱 这是d n a 分子c 构型的特征峰【2 1 】。实验中，在p h 4 0 、p h 3 0 、p h 2 0 的拉曼 谱图中开始分别出现了8 7 9c m ，8 7 7 c m 一，8 7 8c r n 1 的拉曼峰位，这表明从p h 4 0 的酸溶液起已有c 构型的d n a 出现，随着酸度的增加，在p h 3 0 和p h 2 0 的条 拉曼光谱在d n a 、蛋自质检测及墨迹鉴定中的应用 件下，c 构型的d n a 都继续稳定地存在并有所增强。而此时表征b 型结构8 3 5 e m 左右的拉曼谱蜂的强度却在下降，这说明8 7 7c m “峰位是伴随着b 型结构特征 峰的减弱而出现的，由此造成了d n a 骨架结构的无序化。p u p p e l s 等曾指出， d n a 磷酸骨架基团的质子化在p h l 0 左右，经p r i1 8 或4 5 的醋酸处理后的 d n a ，极有可能出现z 的构型 2 1 1 。我们的实验证实了这个结论。在实验中的一 系列图谱里，仅在p h l ，0 的谱图中出现了8 9 1c m 。这一强峰。而p h 2 0 以上谱图 里则不出现这峰，而这一强峰的出现说明在p i l l 0 的条件下d n a 溶液出现了z 型d n a ( 也称左旋d n a ) 。 ( 2 )对碱基的影响 d n a 的碱基在低波数对质子化是不敏感的，而在高波数段对质子化和去堆 积却是敏感的。我们的实验证实了这个现象，如低波数段的鸟嘌岭( 6 8 1e l l a j ) ， 腺嘌呤( 7 3 0c m q ) ，胸腺嘧啶( 7 5 2 c m 1 ) ，胞嘧啶( 7 8 9 c m 以) 的环呼吸振动的峰 强对质子化是不敏感的，它们与碱基的去堆积相对应，鸟嘌呤随着去堆积而峰强 减小，腺嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶则是增加。鸟嘌呤在图2 1 1 中p h 6 0 、p h 5 0 、 p h 4 0 的谱图中峰位分别出现在6 8 1c l r l - 1 、6 7 9e r a