（发酵工程专业论文）谷胱甘肽高产酵母菌的选育及其产物的分离纯化.pdf

关于硕士学位论文使用授权的说明 论文题目：釜胱苴肽直主醛堡的选直拯墓亡物的公离缍化。 本学位论文作者完全了解大连工业大学有关保留、使用学位论文的规 定，大连工业大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和 磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有 关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学 位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 是否保密( 是) ，保密期至2 0 1 0 年3 月1 5 日为止。 学生签名：樾导师签名： 砂9 男年多月，日 摘要 摘要 谷胱甘肽( g l u t a t h i o n e ，g s h ) 是一种具有重要生理功能的活性三肽，它是由谷氨酸、 半胱氨酸和甘氨酸经肽键缩合而成。g s h 在食品、医学、保健、抗衰老等方面具有广泛 的应用。 本文对高产g s h 酵母菌的选育、培养条件优化及g s h 的分离纯化进行了研究。 从3 0 株不同种属的酵母中确定德国果酒酵母为诱变出发菌株，其菌体干重为 4 6 7 9 l 、胞内g s h 含量为6 5 1 m g g 和g s h 产量为3 0 4 0 9 l 。并对其原生质体制备的 最佳条件进行了研究。 利用u v - h n 0 2 复合诱变处理g s h 生产菌株的原生质体，筛选得到s c e r e g i s i a e y z m 1 4 ( z n c l 2 r , c y g ) ，其g s h 产量( 8 4 7 2 m g l ) 、菌体干重( 7 6 3 9 l ) 及胞内g s h 含量 ( 1 1 1 0 m g g ) 分别比出发菌株提高了1 7 8 、6 3 3 8 和7 0 5 1 ，且性状稳定。s c e r e v i s i a e y z m 1 4 与出发菌株相比p p 途径代谢通量增加8 1 ，g s h 前体合成途径通量增加，且 诱变菌株的琥珀酸分泌通量减少，提高了细胞的碳源利用效率，增加了g s h 的生成。 运用响应面分析法对s c e r e v i s i a ey z m 1 4 合成g s h 的摇瓶发酵培养基和培养条件 进行了优化，结果为：葡萄糖浓度为2 5 4 4 ，酵母膏浓度为1 0 3 3 、初始p h 为5 8 8 、 ( n h 4 ) 2 s 0 4 浓度为0 5 、装液量为5 0 m 1 2 5 0 m l 、发酵温度为2 8 1 2 、m g s 0 4 7 h 2 0 浓度 为0 1 、k i - 1 2 p 0 4 浓度0 1 、发酵时间3 6 h ，g s h 产量为1 2 5 4 2 m g l 比无机发酵培养 基g s h 产量提高了7 5 3 7 。半胱氨酸为关键前体氨基酸，确定了添加浓度为0 4 ，胞 内g s h 含量和g s h 产量分别提高到1 6 0 6m g g 和1 6 1 2 3 m g l 。 乙醇提取胞内g s h 的条件为乙醇浓度4 0 、提取时间1 2 0 r a i n 、料水比2 0 m l ( 水) g ( 干 细胞) 。g s h 水溶液的合适保存p h 为3 0 。运用0 0 1 7 ( 7 3 2 ) 强酸型阳离子交换树脂对酵 母细胞提取液进行梯度分离提纯g s h ，此方法减少了洗脱体积和提高了g s h 的纯度， 经分离提纯后g s h 的回收率为6 1 1 5 ，纯度为8 4 7 1 。 关键词：谷胱甘肽，酵母，选育，培养条件，分离纯化 a b s t r a c t a b s t r a c t g l u t a t h i o n e ( g s h ) i sak i n do fa c t i v et r i p e p t i d e ，w h i c hi sc o m p o s e do fg l u t a m i n e ， c y s t e i n ea n dg l y c i n e g l u t a t h i o n ea r ee x t e n s i v e l yu s e di nf o o d s ，m e d i c i n e ，h e a l t hm a i n t e n a n c e ， a n t i - a g i n ga g e n t sb e c a u s eo fi t si m p o r t a n tp h y s i o l o g i c a lf u n c t i o n t h es e l e c t i o no f & c e r e v i s i a ey z m - 14 ，t h eo p t i m i z a t i o no fc u l t u r a lc o n d i t i o n , a n dt h e i s o l a t i o na n dp u r i f i c a t i o no fg l u t a t h i o n ew e r ei n v e s t i g a t e di nt h i sp a p e r t h e & c e r e v i s i aw a sd e t e r m i n e d 弱a ni n i t i a lm u t a n ts t r a i na m o n gt h e3 0d i f f e r e n tk i n d s o fy e a s t t h ed r yc e l lw e i g h t ( d c w ) ，t h ei n t r a c e l l u l a rg s hc o n t e n ta n dt h eg s hp r o d u c t i o n w e r er e s p e c t i v e l yu pt o4 6 7 9 l ，6 51m g ga n d3 0 4 0 9 l a n dt h eo p t i m u mc o n d i t i o no ft h e p r e p a r a t i o na n dr e g e n e r a t i o no f t h ep r o t o p l a s t 、陀s t u d i e d sc e r e v i s i a ey z m - 1 4 ( z n c l 2 r , c y s r ) w a ss c r e e n e dw i t ht h em u t a n tp r o c e s s i n go f c e r e v i s i ap r o t o p l a s tb yc o m b i n a t i v em u t a g e n so fu l t r a v i o l e ta n dn i t r i t e t h eg l u t a t h i o n e ( g s h ) p r o d u c t i o n ( 8 4 7 2m g l ) ，d r yc e l lw e i g h t ( 7 6 3g l ) a n dt h ei n t r a c e l l u l a rg s hc o n t e n t ( 1 1 10 m g g ) i n c r e a s e db y17 8 ，6 3 3 8 a n d7 0 51 r e s p e c t i v e l y , c o m p a r e dw i t l lt h a to ft h ei n i t i a l s w a i n , a n dt h ep r o d u c t i v ec h a r a c t e r i s t i co ft h em u t a n ts t r a i ni ss t a b l e t h em e t a b o l i cf l u xo ft h e p e n t o s ep h o s p h a t ep a t h w a ya n dt h eg s hp r e c u r s o r sb i o s y n t h e t i cp a t h w a yo fs c e r e v i s i a e y z m 14i n c r e a s e db y8 1 ，c o m p a r e dw i t ht h a to ft h ei n i t i a ls t r a i n f u r t h e r m o r e ，t h e m e t a b o l i cf l u xo ft h es u c c i n i ca c i d ss e c r e t i o no ft h em u t a n ts t r a i nd e c r e a s e d t h r o u g ht h e s e m e c h a n i s m s ，t h eu t i l i z a t i o ne f f i c i e n c yo ft h e c a r b o ns o u r c e sw a se n h a n c e da n dh i g h p r o d u c t i o no fg s hw a s o b t a i n e d 1 1 1 em e d i u mc o m p o s i t i o nf o rp r o d u c t i o no fg s hb ys h a k i n gf l a s kc u l t i v a t i o nw a s o p t i m i z e db yu s i n gt h er e s p o n s es u r f a c em e t h o d o l o g y t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h eo p t i m u m c o n d i t i o n so fg s hp r o d u c t i o nw e r e2 5 4 4 o fg l u c o s e ，1 0 3 3 o fy e a s te x t r a c t ，0 5 o f a m m o n i as u l f a t e ，5 8 8o fi n i t i a lp h ，w i t hl o a d i n gv o l u m eo f5 0m li na2 5 0m lf l a s k 。 f e r m e n t a t i o nt e m p e r a t u r ea t2 8 、0 1 o fm g s 0 4 7 h 2 0 ，1 o fk h 2 p 0 4 ，f e r m e n t a t i o nt i m e 3 6 h t h ep r o d u c t i o no fg l u t a t h i o n ei s12 5 4 2 m g l ，w h i c hw a si n c r e a s e db y7 5 3 7 ， c o m p a r e dw i t ht h a to fi n o r g a n i cf e r m e n t a t i o nm e d i u m c y s t e i n ew a sd e t e r m i n e d 嬲ak e yk i n d o l o fp r e c u r s o ra m i n oa c i d si n t h i se x p e r i m e n t a t i o n ，a n dt h ea d d i t i o nc o n c e n t r a t i o nw a s0 4 ， t h ei n t r a c e l l u l a rg s hc o n t e n ta n dg s hp r o d u c t i o nw e r ei n c r e a s e d t o16 0 6 m e g g a n dl61 2 3 m g lr e s p e c t i v e l y t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h eo p t i m u mc o n d i t i o n so fg s he x t r a c t i o nw e r e4 0 o fa l c o h 0 1 12 0m i no fe x t r a c t i o nt i m ea n d2 0m l ( w a t e r ) g ( d c w ) o fl i q u i d - m a t e r i a lr a t i o t h eo p t i m a l w a t e r - s o l u t i o np r e s e r v e dc o n d i t i o nw a sp h3 0 g s hw a si s o l a t e da n dp u r i f i e df r o mt h e & c e r e v i s i a ee x t r a c t s 晰t l lt h e s t e p w i s e e l u t i o n s t r a t e g yb yu s i n g t h e s t r o n g l ya c i d i c c a t i o n - e x c h a n g er e s i n0 0 1x 7 ( 7 3 2 ) t h el e s sr e t e n t i o nv o l u m ea n dt h ee n h a n c e dg s h p u r i t y w e r eo b t a i n e d a f t e ri s o l a t i o na n dp u r i f i c a t i o n , t h er e c o v e r yr a t ea n dt h ep u r i t yf o rt h ei s o l a t e d g s hw e r eu pt o6 1 1 5 a n d8 4 7 1 r e s p e c t i v e l y k e y w o r d s ：g iu t a t hio f l e s a c c h a r o m y c e sc e r o v i s i a o , s e ie c tio n c uit u r aic o n ditio n i s o i a t i o na n dp u ri f i c a t i 0 1 1 目录 目录 1 1 谷胱甘肽的结构与性质l 1 1 1 谷胱甘肽的结构l 1 1 2 谷胱甘肽的性质l 1 2 谷胱甘肽的生物合成2 1 3 谷胱甘肽的生理功能与应用”3 1 3 1 谷胱甘肽的生理功能”3 1 3 2 谷胱甘肽的应用3 1 4 国内外谷胱甘肽的生产方法及研究现状4 1 5 发酵法生产谷胱甘肽6 1 5 1 谷胱甘肽高产菌株选育6 1 5 2 发酵培养基及培养条件优化一9 1 6 谷胱甘肽的提取及分离纯化1 0 1 6 1 胞内谷胱甘肽的提取”1 0 1 6 2 谷胱甘肽的分离纯化ll 1 6 3 离子交换法分离纯化谷胱甘肽l l 1 6 4 离子交换法纯化谷胱甘肽存在的问题l2 1 7 代谢通量分析”l2 1 7 1 代谢工程l2 1 7 2 代谢通量分析计算方法l 3 1 8 本课题的主要研究内容1 3 第二章高产谷胱甘肽酵母菌的初筛及其原生质体制备l5 2 1 实验材料l5 2 1 1 菌株l5 2 1 2 培养基”l5 2 1 3 缓冲液、预处理剂和酶液l6 2 1 4 药品与试剂l7 l v 2 3 结果与讨论2 l 2 3 1 谷胱甘肽检测方法”2 l 2 3 2 高产谷胱甘肽酵母菌的初筛2 l 2 3 3 德国果酒酵母的原生质体制备与再生2 2 2 4 ，j 、结2 6 第三章复合诱变筛选高产选谷胱甘肽酵母菌及其代谢通量分析2 7 3 1 实验材料“2 7 3 1 1 菌株2 7 3 1 2 培养基2 7 3 1 3 缓冲液、预处理剂和酶液2 8 3 1 4 药品与试剂2 8 3 1 5 仪器与设备”2 8 3 2 实验方法2 9 3 2 1 分析方法2 9 3 2 2 培养方法”2 9 3 2 3 u v - h n 0 2 复合诱变筛选高产谷胱甘肽酵母菌3 0 3 2 4 谷胱甘肽生产菌株的代谢通量分析”3l 3 3 结果与讨论3 3 3 3 1 u v - h n 0 2 复合诱变筛选高产谷胱甘肽酵母茵3 3 3 - 3 2 谷胱甘肽生产菌株代谢通量分析3 7 3 4 ，j 、结4 1 第四章高产谷胱甘肽酵母菌的发酵条件优化4 2 4 1 实验材料4 2 4 1 1 菌株4 2 4 1 2 培养基4 2 v 目录 4 1 3 药品与试剂4 2 4 1 4 仪器与设备“4 3 4 2 实验方法4 3 4 2 1 分析方法4 3 4 2 2 高产谷胱甘肽酵母菌的培养基和培养条件优化4 3 4 2 3 前体氨基酸对谷胱甘肽生物合成的影响4 5 4 3 结果与讨论4 5 4 3 1 培养基和培养条件的单因素试验4 5 4 3 2 p l a c k e t t b u r r n a n 试验设计法筛选重要因素4 9 4 3 3 最陡爬坡试验”5 2 4 3 4 响应面分析法优化发酵条件5 2 4 3 6 前体氨基酸对谷胱甘肽生物合成的影响5 6 4 4 ，j 、结5 8 第五章胞内谷胱甘肽的提取及其分离纯化5 9 5 1 实验材料5 9 5 1 1 菌株”5 9 5 1 2 药品与试剂：”5 9 5 1 3 仪器与设备5 9 5 2 实验方法6 0 5 2 1 谷胱甘肽的测定方法6 0 5 2 2 乙醇提取酵母胞内谷胱甘肽6 0 5 2 3p h 的水溶液对谷胱甘肽稳定性影响”6 l 5 2 4 树脂的预处理6 l 5 2 5 静态吸附试验6 l 5 2 6 谷胱甘肽的吸附和洗脱6 l 5 3 结果与讨论6 2 5 3 1 乙醇提取胞内谷胱甘肽6 2 5 3 2p h 的水溶液对谷胱甘肽稳定性影响6 4 5 3 3 静态吸附试验6 4 5 3 4 洗脱流速对洗脱效果的影响“6 5 5 3 4n h 4 c i 浓度对谷胱甘肽分离纯化的影响”6 5 v i 一 一一 目录 5 3 5 梯度洗脱分离纯化谷胱甘肽6 7 5 3 6 谷胱甘肽分离纯化效果h p l c 检测6 8 5 4 小结6 9 第六章结论7 0 参考文献一7l 附录7 4 硕士期间研究成果7 5 致谢7 6 v 1 1 谷胱甘肽的结构与性质 1 1 1 谷胱甘肽的结构 第一章文献综述 谷胱甘肽( g l u t a t h i o n e ，g s h ) 是- - 种具有重要生理功能的活性三肽，它是由谷氨酸、 半胱氨酸和甘氨酸经肽键缩合而成，化学名称为y l 谷氨酰l 半胱氨酰甘氨酸 t l ，结构 式如图1 1 所示。 图1 - 1g 洲的化学结构 f i g i - ic h e m c i a lc o n s t i t u t i o no fg s h g s h 的结构与其他肽和蛋白质有所不同，它的分子中有一特殊肽键，是由谷氨酸的 y 羧基( c o o h ) 与半胱氨酸的小氨基( 一n h d 缩合而成的丫- 谷氨酰胺键，g s h 的许多特殊性 质与此肽键有关。 1 1 2 谷胱甘肽的性质 g s h 的分子量：为3 0 7 3 3 ，熔点1 8 9 ( 2 1 9 3 c ( 分解) ，晶体呈无色透明细长柱状，等电 点为5 9 3 。它溶于水、稀醇和液氨，不溶于醇、醚和丙酮。g s h 广泛存在于面包酵母、 酿酒酵母、小麦胚芽和动物肝脏中，达1 0 0 1 0 0 0 m g l o o g ，在人和动物的血液中含量也比 佩o 一* _ n h 。一。 一 ： 钮i 跚i 强 一 hx 叶j1 一 m -一电 一 嘣 小 u 一 疆 第一章文献综述 较丰富，许多蔬菜、薯类和谷物中也含有g s h t 2 训。 g s h 固体较为稳定，将水分活性控制在0 3 以下能够长期稳定保存，水溶液在空气中 易被氧化生成氧化型谷胱甘肽( g s s g ) ，g s s g 是由两分子还原型谷胱甘肽( g s h ) 的巯基 氧化缩合为二硫键而得到，结构式如图1 2 所示。生物体内的g s s g 需在谷胱甘肽还原酶 ( g l u t a t h i o n er e d u c t a s e ) 作用下还原成g s h 后才能发挥其重要的生理功能 5 , 6 1 。 1 2 谷胱甘肽的生物合成 g l u e y s g 1 y i 。 g l u c y s g 1 y 图i - 2g 胬g 的化学结构 f i g 1 - 2c h e m c i a lc o n s t i t u t i o no f g s s g 在生物体i 勾g s h 是由两个酶催化作用经过以下两步反应合成的【7 l ： 谷氨酸( l - g l u 卜半胱氨酸( l - c y s ) + a t p 鱼墨丛：! ，丫一谷氨酰半胱氨酸+ a d p + p i t 谷氨酰半胱氨酸+ 甘氨酸( g l y ) + a t p ：q s h ：1 0 g s h + a d p + p i 式中：g s h - i - y - 谷氨酰半胱氨酸合成酶( e c 6 3 2 2 ) ； g s h - i i ：g s h 合成酶( e c 6 3 2 3 ) 。 每一步反应需要一分子a t p ，合成一分子g s h 需要两分子a t p 。g s h 的合成受到反 馈抑制，使g s h 的浓度仅保持在生理水平。 2 =_、i：bi 的自由基结合转化成易代谢的酸性物质，加速自由基的排泄，对细胞起到强有力的保护 作用： ( 2 ) 解除外源有毒物质的毒性：g s h 能与进入机体的有毒化合物、重金属离子等直接 结合，并促其排出体外，起到中和解毒的作用； ( 3 ) 促进细胞合成蛋白质：g s h 可通斟谷氨酰基转运酶直接进入细胞内，并通龇 谷氨酰基循环参与众多氨基酸向细胞内转运，进而促进蛋白质的合成； ( 4 ) 参与转甲基、转丙氨基反应，维持肝细胞正常功能：g s h 能加强转甲基和转丙氨 基反应，促进a t p 和凝血因子的合成，并能促进氨基酸及脂肪代谢： ( 5 ) 参与胆红素代谢：g s h 可以在谷胱甘肽硫转移酶的作用下，将未结合胆红素载 入微粒体，使其与葡萄糖醛酸结合成结合型胆红素排出体外； ( 6 ) 参与体内三梭酸循环及糖代谢。 1 3 2 谷胱甘肽的应用 随着对g s h 的生理、生化等方面研究的深入，g s h 在食品、医学、保健、抗衰老等 方面的应用正引起人们日益广泛的注意。 ( 1 ) 临床应用生化药物 1z j ：a 、治疗丙烯睛、氟化物、c o 、重金属、有机溶剂等中 毒现象均有解毒作用；b 、对放射治疗、放射药物及抗肿瘤药物所引起的白血球减少症 及骨髓炎，均可改善其症状；c 、保护肝脏，抑制脂肪肝的形成；d 、保护细胞膜而防止 溶血，减少高铁血红蛋白的损失：e 、防止皮肤色素沉积和黑色素的形成，减少其氧化， 3 一 第一章文献综述 改善皮肤光泽，延缓衰老；f 、抑制白内障、角膜以及视网膜疾病的发展；g 、治疗糖尿 病及肾病：h 、最近发现g s h 可能具有抑制爱滋病病毒的功效。 ( 2 ) 组成复合治疗与保健药品：a 、与赖氦酸或鸟氨酸形成盐，治疗肝病；b 、与维生 素b l ，形成二硫化和物，易于吸收；c 、形成g s h 亚铁盐，用于治疗缺铁贫血症。 ( 3 ) 功能性食品【1 3 , 1 4 1 ：在面制品和奶制品中作为添加剂可提高其品质，在肉类、禽类、 鱼类和海鲜食品中添力n o s h 可延长保鲜期，在保健性食品中由于g s h 的排毒和泻毒功 能，使它成为功能性食品的重要功能因子。 ( 4 ) 用于体育锻炼i l5 j ：在体育锻炼过程中如果体内的g s h 含量增力n 5 0 能提高提高体 内血红蛋白的含量及抗氧化的能力。 1 4 国内外谷胱甘肽的生产方法及研究现状 1 8 8 8 年，g s h 首先从酵母中分离出来。1 9 8 3 年日本进行了g s h 含量较高的酵母生产， 其后又研究了g s h 提取、分离技术及分析检测方法。目前国外已实现g s h 大规模生产 世界主要的氨基酸制造商k y o w a ，a j i - n o m o t o 和d e g u s s a 等都相继投巨资于氨基酸的研究 与开发，仅k y o w a l 9 9 8 年氨基酸的研究与开发就耗资达1 9 亿美元，而谷胱甘肽是其重点 之一，k y o w a 目前是谷胱甘肽主要的供应商【1 6 】。 谷胱甘肽的生产方法主要有萃取法、化学合成法、发酵法、固定化细胞( 或酶) 法 等。 ( 1 ) 萃取法【1 7 l 萃取法是生产谷胱甘肽的经典方法，也是发酵法生活流程中下游工程的基础。它主 要是从动植物组织中将g s h 提取出来的一种方法如从鼠血、鼠肝、鸡血、植物种子胚 芽、酵母中提取g s h 。其基本工艺如下： 动植物原料_ 提取- 分离- - , g s h - - * 沉淀_ 水洗_ 脱盐- + 浓缩_ 干燥_ 成品 但由于萃取法的原料不易获得且g s h 在组织中的含量极低，制取的g s h 纯度和收率 不高，因此该法的实际应用价值不大。 ( 2 ) 化学合成法1 1 8 1 化学合成法较早应用于g s h 的生产，是将谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸经过一系列化 4 一 第一章文献综述 学反应缩合成g s h ，目前该生产工艺虽然较为成熟，但反应步骤多、反应时间长、操作 过程复杂、得到的g s h 消旋体( 左旋体和右旋体的混合物) 需要进行光学拆分，分离十分 困难且易造成环境污染，因此，获得的g s h 产品纯度不高，生物效价很难保持一致。虽 然利用以上方法来生产g s h 在2 0 世纪五十年代左右就已经实现了工业化，但居高不下的 原材料价格及操作费用制约了这些方法的进一步发展。 ( 3 ) 生物合成法 f 1 2 0 世纪六十年代起，采用生物法进行g s h 的合成就日益引起广泛的关注。日本早 在七十年代就开始对生物法合成g s h 进行了大量研究，并公布了一系列相关专利。一些 大公司( 如协和发酵) 利用酵母发酵生产的g s h 更是早在八十年代年就取得了中国卫生部 的原料药进口许可文号，基本垄断了中国市场。我国对g s h 的生产研究还不够深入，虽 然从八十年代末期至今，曾开展过从酵母中提取g s h 的研究，但由于生产菌株中g s h 含 量较低，提取困难，成本造价高，故一直未能实现工业化生产 a 、发酵法 目前，发酵法是生产g s h 最为普遍的方法，其工艺及方法不断改进，其中以诱变处 理获得g s h 含量的酵母变异菌株来生产g s h 最为常见也可通过选育( 或构建) g s h 合成 能力强和胞内含量高的微生物，筛选和优化培养基配方，建立和优化发酵控制策略，改 进和提高下游工程技术等，最终提高谷胱甘肽的产率和质量。发酵法生产g s h 所采用的 微生物一般是酵母，从酵母细胞中提取谷胱甘肽的的工艺流程如下： 酵母_ 高产酵母_ 热水抽提_ 离心一调p h 一树脂吸附一酸洗脱_ 新鲜c 0 2 沉淀一 离心沉淀物_ h 2 s 置换一离心过滤一浓缩- + 脱色_ 喷雾干燥_ 成品 由于g s h 是胞内产物，所以在提高菌株g s h 合成能力的同时，发酵培养时还应设法 提高细胞浓度。提高发酵最终的酵母细胞浓度和胞内g s h 含量可用不同方法：优化培养 基合培养条件，是酵母细胞生产g s h 和生物量都达到最大；由酵母发酵活力与比生长速 率的关联式，结合指数流加培养模式等，实现酵母培养过程的高产率和高发酵活力的统 一：研究添加前体氨基酸和酵母膏对g s h 合成的影响。 b 、固定化细胞( 或酶) 法i 阿挪j 利用生物体内的天然g s h 合成酶，以谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸为底物，并添加少 量a t p 可合成g s h 。其工艺流程如下? 5 第一章文献综述 含有g s h 合成酶的生物体 谷氨酸+ 半胱氨酸+ 甘氨酸x 而歹弋x 两g s h 含有体一树脂吸 附一水洗一酸溶出一精制_ 成品 酶合成反应需要a t p 的参与，从经济上考虑，高效、低成本的g s h 合成首先必须有 一个廉价的a t p 再生方法。以乙酰磷酸为磷酸供体，用乙酸激酶再生a d p 为a t p ，但因 乙酰磷酸昂贵、易分解而并不实用，也可先采用酵母的糖酵解途径再生a t p ，然后由e c o l i 利用a t p 合成谷胱甘肽的方法。但因为糖酵解再生a t p 和g s h 合成酶反应的最佳条件差 别太大，a t p 在两种细胞间的传质效率不高，效果也不好。因此，对以a t p 为能源的酶 催化合成反应，a t p 的高效、低成本供给问题是能否实现这些酶合成反应工业化的关键 和限制因素之一。 1 5 发酵法生产谷胱甘肽 1 5 1 谷胱甘肽高产菌株选育 菌种选育是发酵工程的核心根据微生物的代谢特点来设计适当的筛选程序，可以 使菌株的分离筛选工作经济有效。发酵g s h 所用菌种中最为常见的是酿酒酵母和假丝酵 母属中的某些种，由于普通酵母g s h 含量不高，一般仅有0 5 左右，如果直接应用于生 产，存在酵母用量大、效率低等缺点，对于发酵法生产g s h 而言，将不利于后提取工作， 而且经济效益不高。从发酵经济学的观点出发，选育出优良的生产菌株，并在此基础上 进行发酵工艺的研究，不仅可以提高菌种的生产能力，还可以改进产品的质量、扩大品 种、简化生产工艺，其方法简便，收益显著。 1 5 1 1 基因重组育种 利用酵母细胞自身的g s h 合成酶和糖酵解途径产生的a t p 合成g s h ，虽然产量不是 很高，但为利用基因工程酵母细胞大量合成g s h 提供了借鉴。即最好克隆表达e c o l i 菌 种的谷胱甘肽合成酶基因，因为a t p 对它的抵制作用比酵母弱，能实现高效率、低成本 的生产g s h 更进一步，也可以将其他需要a t p 才能进行反应的酶基因克隆表达在酶母 细胞中，利用廉价的腺苷转化生成的大量a t p 进行反应因此，利用含g s h 合成酶基因 6 第一章文献综述 的工程菌生物合成谷胱甘肽是最有前途的方法睇。 1 5 1 2 诱变育种 诱变育种就是利用物理或化学因素处理微生物细胞群体，促使其中少数细胞中的遗 传物质( 主要是d n a ) 结构发生变化，从而引起微生物遗传性状发生变化，然后设法从群 体中筛选出少量优良突变菌株的过程。诱变育种的步骤和方法包括：出发菌株的选择， 诱变剂及诱变剂量的选择，诱变处理的方式方法，以及突变株的分离和筛选等瞄】。 ( 1 ) 出发菌株的选择 一般微生物工业中，对某一特定物质的产生菌进行诱变育种，所以出发菌株的选择 余地通常是很有限的。如果有多株不同菌种，或同一菌种有多个菌株可供抉择，这就值 得认真研究。选择出发菌种一般考虑如下方面： a 、尽量选择纯系菌株；b 、选择对诱变剂敏感的菌株作为出发菌种：c 、采用多出 发菌株；d 、菌株的生理状态( 如休眠抱子或萌发饱子) 和不同的生长发育阶段培养物诱变 效应不同，需要结合使用的诱变剂的作用机理综合考虑。 ( 2 ) 诱变剂及诱变剂量的选择 a 、诱变剂的选择 决定于诱变剂对基因作用的特异性，同时也取决于出发菌株的特性。因为不同诱变 剂对不同菌株的诱变效应不同，不同微生物对同一种诱变剂敏感性也有很大区别，这不 仅是细胞透性的差异，也与诱变剂进入细胞后相互之间作用不一致有关。目前，育种专 家还无法做到用诱变剂来达到定向改变某一性状。而且，一个菌株的产物多少并非由单 基因控制，尤其是次生代谢物，其产量是山多基因决定的，诱变后产量提高是多基因效 应的结果。诱变剂进入细胞，菌体为了生存，都具有一套自我修复能力，不同菌株修复 能力不同。所以，选择诱变剂稳定的菌株最好用以往尚未使用过的、突变谱较宽的、诱 变率较高的强诱变剂进行复合处理，使d n a 结构发生严重损伤，造成大的变异，然后再 采用一些作用较缓和的诱变剂处理。 b 、诱变剂量的选择 与菌种的遗传特性、诱变史、诱变剂的种类及处理环境、诱变剂量与突变率之间的 关系有关，实验中要根据实际情况具体分析加以选择。经验认为，经长期诱变处理后的 高产菌株，应采用低剂量处理为好；对遗传性不太稳定的菌株应采用较缓和的诱变剂和 较低剂量的处理；对诱变史短的野生低产菌株开始应用较高的剂量，然后逐步使用较温 和的诱变剂或较低的剂量进行处理。对一个菌株而言，不仅要选择一个有效的诱变因子， 7 第一章文献综述 _ l 一_ _ _ _ _ - _ _ 一 还要确定一个最适的剂量。物理诱变剂是通过控制照射距离、照射时间和照射过程中的 条件( 氧、水、光等) 来达到最佳效果；化学诱变剂是通过控制诱变剂的浓度、处理时间 和处理条件( 温度、p h ) 。 ( 3 ) 诱变的处理方式和方法 a 、诱变的处理方式分为单因子处理和复合因子处理：复合因子处理是指两种以上 诱变因子诱发菌体突变，这种方法可以取长补短，动摇d n a 分子上多种基因的遗传稳定 性，以弥补某种不亲和性或热点饱和现象，容易得到更多的突变类型。 b 、诱变的处理方法，常用的有直接处理方法和生长过程处理：直接处理方法是将 菌悬液用物理、化学诱变因子直接处理，然后分离。生长过程处理多适用于某些诱变作 用力较强的而杀菌率较低的或只对分裂中的d n a 起作用的诱变剂，如n t g 、l i c i 、秋水 仙碱等。 c 、原生质体诱变处理：酵母菌有较厚的细胞壁保护使其对一般的诱交剂不敏感， 将出发菌株原生质体化后进行诱变，可以使酵母菌对诱变剂的敏感度增加，这样不但可 以用一些条件温和无毒害的诱变剂进行诱变，而且可以提高诱变率。 ( 4 ) 突变株的分离和筛选 在诱变育种中，高产突变株出现的频率很低，采用随机筛选法，工作量将会很大而 且效果也不是很好。因此人们在不断寻找新的筛选方法。现某些特殊类型的突变株筛选 方法应用于实践，很有成效。特殊类型的突变株主要有：营养缺陷型突变株、抗性突变 株、回复突变株、细胞透性改变突变株和形态突变株。 1 5 1 3 谷胱甘肽高产菌株选育的研究现状 目前cu t i l i s 和s c e r e r i s i a e 是工业生产常用的菌种，因此针对这两种酵母进行的菌 种选育研究工作也最为广泛贾学杰【2 3 l 等对7 5 株酵母菌经初筛、复筛和单倍体分离，得 到胞内g s h 含量较高的单倍体酵母菌株s l ( a ) ，并进行遗传标记。经硫酸二乙酯诱变、紫 外诱变及两者的复合诱变，z n c l 2 、乙硫氨酸抗性交替筛选得g s h 含量较高的单倍体 f 4 ( a , a r g r ，z n c l z , e t h ) ，g s h 含量与产量分别比出发单倍体提高t 7 3 5 0 a 和1 1 8 1 。施毕 红【2 4 l 等对一株啤酒酵母进行紫外线和硫酸二乙酯等复合诱变处理，以蛋氨酸缺陷型( m e r ) 为筛选模型，获得的高产g s h 突变株m - 4 5 其胞p 勺g s h 含量达到1 4 4 mg g ，较出发菌株 提高了6 8 4 另外，何俊勇【2 5 l 等通过对藤黄八叠球菌进行紫外诱变处理，筛选到一株 抗乙硫氨酸和氯化锌的抗性菌株，该突变株发酵生产g s h 的产量比出发菌株提高2 6 8 9 。细胞融合技术也应用于g s h 高产菌株的选育工作，刘娟i 2 6 i 等通过初筛、单倍体分离、 8 第一章文献综述 诱变及原生质体融合技术选育到一株g s h 产量明显提高的融合菌株z j f 2 7 l ，其g s h 产量 分别为亲株的1 5 9 和1 4 2 倍。 1 5 2 发酵培养基及培养条件优化 1 5 2 1 发酵培养基优化 ( 1 ) 碳源有葡萄糖、蔗糖、果糖、淀粉、淀粉水解物及其他碳氢化合物丙三醇、甘露 醇、乙醉等，g s h