（生物物理学专业论文）固定化德阿昆哈假单胞菌生产l丙氨酸的研究.pdf

摘要 y 4 4 0 3 7 5 本文对具有l 天冬氨酸b 脱羧酶的德阿昆哈假单胞菌( p s e u d o m o n a s d a c u n h a e ) 的培养条件进行了研究，其最佳培养基配方及培养条件为：富马酸 o 5 ，蛋白胨3 ，磷酸二氢钾0 0 5 ，硫酸镁0 0 1 ，p n 7 2 ，3 0 。c 下摇瓶培养 2 4 - 2 6 h 。 本文着重研究了德阿昆哈假单胞菌( p s e u d o m o n a sd a c u n h a e ) 的固定化细胞 技术。结果发现，以k 一卡拉胶作为包埋剂、再经两种硬化剂处理得到的固定化细 f 胞，具有较高的酶稳定性和回收率。( _ 最高回收率达到8 8 6 ，该固定化细胞在4 下保存6 0 天，酶活力只下降3 5 。对固定化细胞性质进行的初步研究发现， 其最适温度为4 0 0 0 ，最适p h 为5 0 ，最适底物浓度范围为6 6 5 1 3 3 9 l 。底物 溶液对固定化细胞具有活化作用j 最佳活化条件为：将固定化细胞浸泡在 5 0 9 l 的底物溶液中，于3 7 0 、1 2 0 r p m 摇床中振荡3 0 h 。 在温度3 7 、底物浓度l o o e d l 的条件下，该固定化细胞在填充床反应器中 连续运行2 0 天，测得其半衰期为7 1 天。转化液经提取，获得l 。丙氨酸结晶。 产品经鉴定，l 丙氨酸含量达到9 8 6 1 。 关键词：德阿昆哈假单胞菌，k - 卡拉胶，l 一丙氨酸，l 一天冬氨酸一1 3 一脱羧酶，固定 化细胞 a b s t r a c t ap r o c e s st oo b t a i n o p t i c a l l yp u r e l a l a n i n eh a db e e n d e v e l o p e du s i n g a l a s p a r t a t eb e t a d e c a r b o x y l a s e ( a d l ) 一p r o d u c i n gb a c t e r i u mp s e u d o m o n a sd a c u n h a e e f f o r t sw e r em a d et oo b t a i nt h eo p t i m a lc u l t u r em e d i u ma n dt h eo p t i m a lc u l t u r e c o n d i t i o n s t h er e s u l t sw e r eg i v e na sf o l l o w s ：f u m a r i ca c i d o 5 ，p e p t o n e 3 ， k h 2 p 0 40 0 5 ，m g s 0 4o 0 1 ，p h 7 2 ，a t 3 0 o fc u l t u r e t e m p e r a t u r e a n d 2 4 - 2 6 一h o u ro f c u l t u r et i m e b a s e do nt h ea b o v e r e s u l t s ，am e t h o d f o r p r o d u c i n g l a l a n i n ef r o m l a s p a r t i ca c i d u s i n gi m m o b i l i z e dp s e u d o m o n a sd a c u n h a ec e l l sw a si n v e s t i g a t e di nt h i st h e s i s t h e c e l l sw e r ei m m o b i l i z e dw i t hk c a r r a g e e n a na n dt r e a t e dw i t ht w ok i n do fh a r d e n i n g a g e n t s 8 8 6 o f y i e l do f a d la c t i v i t yw a so b t a i n e da n do n l y3 5 o f a d la c t i v i t y d e c r e a s e dw i t h i n6 0d a y sa t4 t h eo p t i m a lt e m p e r a t u r e t h eo p t i m a lp hv a l u ea n d t h eo p t i m a ls u b s t r a t e ( l a s p a r t i ca c i d ) c o n c e n t r a t i o nf o rt h ee n z y m a t i cr e a c t i o nb y a d lw e r e4 0 。c ，5 0a n d6 6 5 - 1 3 3 9 l ，r e s p e c t i v e l y a l s o ，t h ea c t i v a t i o no ft h e s u b s t r a t es o l u t i o no na d l a c t i v i t yw a ss t u d i e d a d la c t i v i t ys i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e d b yc u l t u r i n gt h ei m m o b i l i z e dc e l l si n15 0 e e ls u b s t r a t es o l u t i o ni nt h er o t a t o r ys h a k e r a t3 7 f o r3 0 h o u r s ap a c k e db e dr e a c t o rf i l l e dw i t ht h ei m m o b i l i z e dc e l l sw a s d e v e l o p e d t o c o n t i n u o u s l yp r o d u c e l a l a n i n ef r o m l - a s p a r t i c a c i d t h er e a c t o rw i t h10 0 9 l s u b s t r a t es o l u t i o nh a db e e nr u n n i n gf o r2 0d a y sa t3 7 。c t h eh a l f - l i f ew a st h e n d e t e r m i n e da s7 1 d a y sa n dt h ec r y s t a lp o w d e rs a m p l e ，c o n t a i n i n gm o r et h a n9 8 6 1 o fl a l a n i n e w a so b t a i n e d k e y w o r d s ：p s e u d o m o n a s d a c u n h a e ，k c a r r a g e e n a n ，l a l a n i n e ，l a s p a r t a t e b e t a d e c a r b o x y l a s e ，i m m o b i l i z e dc e i l s 浙江大学硕士学位论文 固定化德阿昆哈假单胞茵生产l 一丙氨酸的研究 第一章l 一丙氨酸概述 自从1 8 2 0 年首先发现甘氨酸和亮氨酸，一百多年来，从各种生物体中发现的 氨基酸已经有i8 0 多种，人类对氨基酸已经有了非常深入的认识。如今氨基酸已 广泛应用于食品、医药、化妆品、饲料等领域。从五十年代兴起的氨基酸工业经 过数十年的发展已经形成一个多元化的新产业，几乎所有的氨基酸都可以工业化 生产。 1 1l 丙氨酸的理化性质 l 丙氨酸，学名l 氨基丙酸( l a l a n i n e ；l l a c t a m i n e ) ，分子式 c h 3 c h m h 2 ) c o o h ，分子量8 9 0 4 ，外观为无色至白色结晶，无毒无臭，溶于水 ( 1 6 7 2 9 1 0 0 m l ) ，微溶于乙醇，不溶于乙醚和丙酮，密度1 4 0 1 ，理化性质稳定。 具有特殊的甜味，甜度为甘氨酸的1 6 倍，是一种最甜的氨基酸。当温度高于2 0 0 时，可升华；达到2 6 4 2 9 5 时可分解。 1 2l 丙氨酸的用途 1 2 1 生物学功能【j i l 丙氨酸在生物体的代谢中有重要的作用。国外研究报告表明，血液中含有 8 的氨基酸，其中主要是l 丙氨酸。l 丙氨酸具有缓冲作用，能使血液保持适 当的p h 值，进而保护钙和钾等矿物质元素的常量在血液中稳定存在，改善人体 的新陈代谢。l 丙氨酸还可被人体细胞组织直接吸收，起到补脑、保肝的作用。 在转氨反应中，l 一丙氨酸的氨基可用于合成其它氨基酸。l 丙氨酸还可防止含氨 基氮化物的游离氨基酸、蛋白质及其水解物、维生素和氨基维生素等的褐变。 1 2 2 工业用途【1 】【2 】【3 】 1 2 2 1 食品添加剂 l 一丙氨酸是一种低热量、高营养、具有特殊香味和甜味的氨基酸。 浙江大学硕士学位论文 固定化德阿昆哈假单胞茵生产l - 丙氨酸的研究 1 2 2 1 1 提高食品的营养价值 在各类食品及饮料中如面包、奶制品、碳酸饮料等中加入o 1 1 的l - 丙氨 酸可明显提高食品及饮料中的蛋白质利用率，并且由于l 一丙氨酸具有被细胞直 接吸收的特点，饮后能迅速恢复疲劳，振奋精神。 1 2 2 1 2 改善调味剂的味感 l 丙氨酸具有独特的改善风味效果，它与其它氨基酸配合能加强食品、饮料 的风味，尤其是l 丙氨酸与其它氨基酸和糖类以任意比混合以后，对改善食品、 饲料的风味，强化食品的营养更具有特色。与谷氨酸钠复合成混合调味品可调制 并明显改善食品风味，提供甜味而不破坏食品原有风味，因而在日本成了各种食 品和炒菜必不可少的添加剂。 它还可以改善有机酸的酸味，按1 5 的量添加于有机酸的酸味剂如醋酸、柠 檬酸、苹果酸、富马酸、酒石酸等中，可更接近天然果酸的酸味。 1 2 2 1 3 防腐抗氧化 l - 丙氨酸对密封包装的食品可延长保存期达1 8 个月。在油脂类食品和蛋黄酱 中加入o 0 1 1 o 的l 一丙氨酸能有效防止其氧化，并改善味道。 1 2 2 1 4 饲料添加剂 在配合饲料中添加少量的l 丙氨酸能显著提高饲料的营养，使蛋白质含量提 高，可多生产动物蛋白质，且可作为饲料开口诱食剂。日本已将l 一丙氨酸列入 饲料添加剂氨基酸类。 另外，l 一丙氨酸还可提高腌制品的腌制效果并改善风味，提高含醇饮料的质 量等。在酒中加入l 丙氨酸可使酒味淳和，可防止啤酒及其它发泡酒类中的氨 基酸褐变，增强葡萄酒的甜度，特别是l 丙氨酸具有促进酒精代谢和醛类的解 毒作用，所以被广泛用于制取低度酒。 1 2 2 2 医药 l 一丙氨酸在医药上用途广泛，主要用于生化试剂、组织培养基的配置、肝功 浙江大学硕士学位论文 固定化德阿昆哈假单胞菌生产l 一丙氨酸的研究 能的测定等方面，同时也是营养剂补糖氨基酸营养输液的主要成分。可用于治疗 肝功能不强引起的氨基酸代谢紊乱，使肝昏迷病人苏醒，并是一种良好的利尿剂； 还可用来制造抗癌药物。另外，l 一丙氨酸还具有减肥功效，是血液保存剂的主要 成分。 1 2 2 3 化学合成中的应用 1 、合成抗癌物4 一羟基水杨醛丙氨酸合锌。 2 、合成v b 6 ： 3 、合成阿力甜( a l i t a m e ，l 天门冬酰一d 一丙氨酰胺) 4 、合成多巴。 1 3l 丙氨酸的生产方法 1 3 1 提取法 由绢丝、明胶、玉米蛋白之类l 一丙氨酸含量较高的蛋白质水解或酶解后分离 而得4 1 。由于众所周知的原因，提取法难以在工业生产中占据优势。 1 3 2 化学合成法 在许多文献报道中，化学工程师们采用各种不同的化学合成路线来获得l 丙 氨酸纯品。但是，由于化学合成法收率低，成本高，产品质量差，并且存在一定 的污染性，国外已基本淘汰，国内的几家小厂也处于半停产状态。以下就列举一 些化学合成路线。 ( 1 ) 在1 0 5 。c 条件下，以丙酸为原料、3 赤磷为催化剂，通入液氯进行氯化， 生成l 一氯代丙酸。然后，通入氨水溶液，以乌洛托品为催化剂，在6 0 。c 下进行 氨化，即生成l 一氨基丙酸。最后，将反应产物送入甲醇溶液中进行结晶，经离 心、干燥制得成品【：；】。合成步骤如下流程图所示： 乌洛托品甲醇 ii 霎萎二i 垂二至卜由巨垂茎亘卜一 三三二三乎。一丙氨酸 浙江大学硕士学位论文 固定化德阿昆哈假单胞茵生产l 一丙氨酸的研究 ( 2 ) 苏桂发等人6 j 采用双不对称合成路线，在手性相转移催化条件下，邻苯 二甲酰亚胺钾与手性溴代丙酸龙脑酯的g a b r i e l 反应制取光学活性丙氨酸。合 成路线图如下： n k + 甲 ! 垡二! 旦二竺塑墨：查查! ! 手性p t c ，7 0 摄氏度下反应4 h 型学ch，一弦coor2h + 回流 3 丫 n h 2 c h l n c h c 0 0 r + 3 一c h c o o h ( r 2 c 2 h 5 ) n h 2 c i h c o o h ( r = b o m y l ) n h 2 2 ( 邻苯二甲酰亚胺基) 丙酸酯的合成是决定产物光学产率的关键步骤。此 反应为手性识别反应，手性催化剂和手性酯的构型决定产物的优势构型。若只用 n 一溴代丙酸龙脑酯或者( - ) - n 苄基氯化奎宁作手性源，得到右旋体( l 型) 过量 的丙氨酸；若用( + ) - n 一苄基氯化辛可宁作催化剂，得到左旋体( d 型) 过量的丙 氨酸。结果最好的一组试验获得了光学纯度5 2 1 的丙氨酸( l 型稍占优势) 。 1 3 3 拆分法 大量研究表明，拆分相应的消旋体是一种很常用、很有效的获得光学异构体 的方法。 以前，生产d l 丙氨酸的方法主要是1 7 佣乙醛和氢氰酸为原料得到成品d l 丙氨酸；也可以用乙醚、氯化铵和氰化钠等原料合成d l 丙氨酸；还可用氯化法 生产丙氨酸。但是这些方法均存在严重的“三废”问题，以及收率低，成本高等 缺点。1 9 9 9 年张维刚等人8 1 采用乙醛为原料，用相转移法合成d l 丙氨酸，较好 地解决了“三废”问题，提高了收率，降低了成本。 随着生产方法的日益成熟，d l 丙氨酸的市场价格也日渐下跌，这就为拆分 法制取l 丙氨酸解决了原料成本的问题。 目前，拆分法制取l 一丙氨酸有可以分为两种类型。 浙江大学硕士学住论文 固定化德阿昆哈假单胞茵生产l 一丙氨酸的研究 1 3 3 1 诱导拆分 这种方法的思路源于消旋体中l 型和d 型异构体在某一溶剂中的溶解度差 异。利用这一差异，在该特定溶液中适时适量地加入l - 型或d 一型的异构体作为 晶种，控制温度和搅拌条件，使某一种光学异构体逐步结晶析出，达到一定条件 后迅速过滤，可得到该光学异构体的粗品。然后经过一系列相应的后提取，从而 得到纯品。2 0 0 0 年河北大学庞秀言等人1 9 懈d l c 【丙氨酸在乙醇水饱和溶液中加 入l 丙氨酸晶种，通过冷却恒温结晶，最终得到了l 一丙氨酸晶体。具体的试验 操作条件是：在盛有1 0 0 m l 水的烧杯中加入约0 2 9 表面活性剂，搅拌，逐步升 温至6 0 ( 2 ，并不断加入d i 廿丙氨酸，得其饱和溶液。继续升温i o 。c ，恒温l o m i n ， 加入5 1 0 m l 乙醇，搅拌，缓慢降温至6 0 。c ，恒温2 0 m i n 。然后加入l m g l - 一丙 氨酸晶种，缓慢降至培养晶体的水浴温度，将烧杯放在封闭的恒温器中，培养得 到l 一丙氨酸晶体。结果得到o 1 9 5 1 9 l - 丙氨酸晶体，其旋光度为【 ：= + 1 9 8 ( 与 分析纯试剂相同) ，一次结晶旋光纯度大于9 9 7 。 1 3 3 2 生物拆分 这一方法的基本原理是利用米曲霉( a s p e r g i l l u sa r y z a e ) 的氨基酰化酶( e c 3 5 1 1 4 ) 能专一地催化以下水解反应： 。l r - - c ih - - c 0 0 h + h 2 0 a m i n o a c y l a s e l c h - - c o o h + c h 3 c o o h + d - r - - c l h c 。h n hn h c = o i c h 3 c ：o l c h 3 大量研究表明，用米曲霉的氨基酰化酶拆分d l 氨基酸是当前生产某些l 一氨 基酸最经济有效的方法。据报道，这种氨基酰化酶对n 一乙酰- l 一丙氨酸和n 一乙酰 d 丙氨酸的拆分比率高达2 9 0 0 ：1 i l ”。 1 9 6 9 年日本以d e a f - , , s e p h a d e x 作载体，将该酶固定化实现了由氨基酸消旋 体制备某些l 型氨基酸的工业化生产，从此极大地促进了氨基酰化酶催化剂的研 究工作。这些研究工作主要集中在对固定化酶法和包埋酶法的研究，而对固定化 细胞法的研究却很少。固定化细胞法可以避开酶法工艺过程过长( 可省去提取、 精制酶和制备载体及固定化等工序) 、酶的有效利用率低、催化剂成本昂贵等缺 浙江大学硕士学位论文 固定化德阿昆哈假单胞茵生产l - 丙氨酸的研究 点，但是固定化细胞法存在的最主要的困难是所制备的催化剂酶活力较低。 1 9 9 7 年，天津大学宋正孝等人娃l 将原来米曲霉的固相培养改为液体培养，使 之生长成含氨基酰化酶浓度较高、直径约1 2 m m 的菌球，并用明胶戊二醛一乙 二胺为交联剂固定。在以下固定化条件下：每克湿菌体所用的8 m l 固定液中， 含2 明胶、o 5 甲醛，固定化时间1 5 h 。制备出的固定化菌体细胞酶活力约为 7 0 0 u g ，酶活保留率约为7 1 。 在* 1 0 m m 1 0 0 m m 柱内装入总酶活为4 6 0 0 u 的固定化菌体细胞，在3 7 。c 下 将0 i m o l l 的n a c d l a l a 溶液以2 0 m l h 的流速通入酶柱，定期测定流出液的 拆分率。连续拆分2 0 d 后酶活存留率为7 8 。收集流出产物进行浓缩和精制，测 得其产品旋光度为j a i l ；= + 1 4 0 6 。在此基础上，他们还描述了该催化反应的某些 动力学特性【1 3 1 。 19 9 8 年，国外有报道称利用l 一氨基酰化酶产生菌p s e u d o m o n a ss p b a 2 将n 一 乙酰一d l 一丙氨酸转化成l 丙氨酸。该方法采用卡拉胶固定菌体细胞，加入适量 的c o c l 2 以提高酶的活性。在底物浓度为2 0 2 0 0 m m o l l 范围内。其最高转化率 可达到1 0 0 。反应器的生产率为o 7 4 m o l l h g c e l l 。 1 3 4 发酵法 细菌、放线菌、酵母菌、霉菌等许多微生物都能够发酵生产l 一丙氨酸【“j 。1 9 6 5 年以前，对于以葡萄糖等碳源为原料的直接发酵生产法，研究的较多。 发酵法主要是以降解葡萄糖等碳源生成的丙酮酸为基质，经过两种途径生成 l 丙氨酸： ( 1 ) 氨基转移反应 方程式如下： 丙酮酸+ 氨基酸；= = 兰l 丙氨酸+ 0 l - 酮酸 1 9 6 1 年，北井等用胶状棒杆菌n o 7 1 8 3 ( c o r y n e b a c t e r i u mg e l a t i n o s u m n o 7 1 8 3 ) ，在由葡萄糖1 3 ，k h 2 p 0 4 0 1 ，m g s 0 4 7 h 2 00 0 4 ，酵母膏o 1 ， 玉米浆o 4 ，尿素1 8 ，( p h 7 6 7 8 ) 组成的培养基中，于3 0 。c 培养6 0 h ，生 成d l 一丙氨酸达4 0 9 l 。用嗜氨小杆菌的精氨酸氧肟酸抗性菌株( m a h 2 2 2 ) ， 可在加有0 0 0 1 z n s 0 4 7 h 2 0 的葡萄糖培养基中生成d l - 丙氨酸达4 7 9 l ，如 浙江大学硕士学位论文固定化德阿昆哈假单胞菌生产l 一丙氨酸的研究 果在1 0 葡萄糖加1 0 乳酸铵的培养基中培养，则产量达6 0g l 。山田分离了一 株耐高温( 可在5 5 。c 培养) 、可避免污染的凝结芽孢杆菌，培养4 3 h ，生成d l 一 丙氨酸达2 9 5 9 l 。 后来经北井等人研究发现，胶状棒杆菌n o 7 1 8 3 是通过丙酮酸与l 谷氨酸之 间的转氨作用生成丙氨酸的。已检出特异于丙酮酸、l 谷氨酸的氨基移转酶的强 大活性。最初由氨基转移反应生成的是l 一丙氨酸，但是经丙氨酸消旋酶的作用， 转化成d 丙氨酸，因此该菌株的产物是d l 一丙氨酸。 1 9 5 9 年坂口等由振荡培养法，利用链霉素和假单胞菌生产l 丙氨酸，其产量 分别达到了5 o m g m l 、2 2 m g m l 。前苏联埃斯米克格沃考夫那阿目简 也已经实现以黄色短杆菌，用多种碳源和氮源发酵生产l 一丙氨酸，发酵后的培 养液中l 丙氨酸的积累达到5 1 虮。 ( 2 ) 还原氨基化反应 方程式如下： 丙酮酸+ n h 4 + + n a d h = = 二兰l 丙氨酸+ n a d + + h 2 0 该反应是在丙氨酸脱氢酶的作用下，自丙酮酸生成l 一丙氨酸。 w i a m e 于1 9 5 5 年、g o l d m a n n 于1 9 5 9 年分别报道了枯草杆菌和肺结核小杆菌 ( m y e o b a c t e r i u mt u b e r c u l o s i s ) 存在这一反应。此后，鲛岛等人在假单胞菌n o 4 8 3 的无细胞抽出液中检出了丙氨酸脱氢酶的活性。该酶以n a d h 为辅酶，最适p h 值为9 8 ，产生的丙氨酸是l 一丙氨酸。 1 9 9 7 年，有报道【l6 】称采用纳滤膜反应器以丙酮酸为原料连续生产l ，丙氨酸。 该系统将丙氨酸脱氢酶与葡萄糖脱氢酶( 用于n a d h 再生) 共固定于纳滤膜生 物反应器上，实验结果如下：最大转化率、反应器生产率和n a d h 再生数目分 别为1 0 0 、3 2 0 9 l d 和2 0 0 0 0 。由于丙酮酸不太稳定，该文在纳滤膜反应器上 共固定了丙氨酸脱氢酶和乳酸脱氢酶，后者可以在再生n a d h 的同时将乳酸转 化成丙酮酸，所以丙酮酸一旦生成立即被转化成为l 一丙氨酸。实验结果为：最 大转化率、反应器生产率和n a d h 再生数目分别为1 0 0 、1 6 0 9 l d 和2 0 0 0 0 。 浙江大学硕士学住论文 固定化德阿昆哈假单胞茵生产l 一丙氨酸的研究 1 3 5 生物酶转化法 ( 1 ) 第一种方法就是由l 天冬氨酸为原料经l 天冬氨酸- p 脱羧酶 ( e c 4 1 1 1 2 ) 转化而得l 一丙氨酸。反应方程式如下： c o o h h ，n c h 。 i c h ， i c o o h l 天冬氨酸 c o o h 主墅竺墅壁旦骂h ：n 一 h + c 。：f c h 3 l 一丙氨酸 1 9 5 1 年，m e i s t e r 首先报告了韦尔奇梭菌( c l o s t r i d i u mw e l c h i i ) 有这种反应。 1 9 6 5 年，渡边用2 5 l 罐培养米黄胞菌，用从菌体制得的酶液，定量的从l 一天冬 氨酸生产l 丙氨酸。该酶液作用最适p h 为5 3 ，最适温度为4 0 。c 。同时，干烟 一郎等以o 5 延胡索酸铵和1 o 的延胡索酸钠为碳源培养德阿昆哈假单胞菌 ( p s e u d o m o n a sd a c u n h a e ) ，然后向培养液中加入l 一天冬氨酸达4 0 ，于3 7 。c 反 应7 2 h ，获得收率为9 0 的l 一丙氨酸。此种单步转化反应生成的l 一丙氨酸浓度 高，纯度高，不再发生分解反应及消旋化反应。国内外许多研究机构都对以这种 方法生产l 丙氨酸进行了进一步的研究。 1 9 8 1 年日本的s a t o r ut a k a m a t s u 等人 1 7 1 对固定化细胞中l 天冬氨酸1 3 脱羧酶 的稳定性进行了研究，发现，以k 卡拉胶为包埋剂、在环六亚甲基二胺或者l - 赖氨酸存在的条件下，固定化细胞经0 1 m 戊二醛交联处理后，在p h 5 9 的范 围内，酶比活力基本上保持不变，而半衰期有了比较显著的延长。优化的结果是， 在o 4 - - 0 5 ml 赖氨酸存在的条件下，固定化细胞经o 4 m 戊二醛处理后，3 7 。c 时酶的半衰期可以达到l o o d 。次年，作者所在的t a n a b es e i y a k u 株式会社将l 一 丙氨酸投入生产，他们把固定化e c o l i 细胞柱与固定化pd a c u n h a e 细胞柱串 连起来，以富马酸铵为底物，连续转化，得到最终的产品l 一丙氨酸。他们还在 研究中发现 1 9 ，上述两种固定化细胞混合装在同一柱子，其转化效果要好于两种 固定化细胞分别装柱并串连。他们通过建立酶反应动力学模型【2 0 ，寻求最佳的生 产条件，以期降低生产成本，并获得尽量高的底物转化率和尽量长的半衰期。随 后，他们设计了循环生物反应分离系统，在生物转化的同时不断地分离出l 一 浙江大学硕士学位论文固定化德阿昆哈假单胞茵生产l 一丙氨酸的研究 丙氨酸，获得了较好的效果。 在固定化细胞生产l 丙氨酸过程中，由于c 0 2 的不断释放，反应液的p h 值 将逐渐升高从而偏离转化反应的最佳p h 值，导致反应趋缓。1 9 8 3 年，日本的 m a s a k a t s uf u r u i 等2 2 1 设计了加压式反应器，使酶反应在高于大气压的条件下进 行，一方面可以抑制c 0 2 的释放，保持反应液的p h 值始终保持在最适值：另一 方面可以获得比常压下更高的反应速率。 还有文献f 2 3 1 报道以卡拉胶为固定化材料，以d l 天冬氨酸为底物，通过 p s e u d o m o n a s s p 将其中的l 天冬氨酸转化为l 一丙氨酸，从而实现l - 丙氨酸和d 一 天冬氨酸的同时生产。 9 0 年代，南京化工大学的徐虹等人1 2 4 i 通过诱变育种获得了一株具有高活性 l 一天冬氨酸一b 一脱羧酶的p s e u d o m o n a sn x 1 ，并对该菌株的酶形成和酶反应的条 件进行了详细研究，发现该菌株可以高效的转化l 天冬氨酸生成l 丙氨酸，转 化4 5 天，每升培养液可转化l 一天冬氨酸量高达1 4 0 0 克左右，生成l - 丙氨酸 浓度高达9 0 以上，摩尔转化率近1 0 0 。进一步的研究1 25 】表明，在8 0 0 升气升 式发酵罐培养假单胞菌p s e d o m o n a sn x 1 ，获得高l 一天冬氨酸一0 一脱羧酶酶活， 以l 一天冬氨酸为底物游离细胞法转化生产l 丙氨酸，每升培养液可转化l 天冬 氨酸2 k g ，最高达2 5 k g ，提取得到l 一丙氨酸1 2 k g ，平均收率9 0 ，产品质量达 到美国药典x x l i i 版标准和日本昧之素9 0 版标准。 19 9 4 年，中国药科大学的储瑞蔼等人1 2 6 魄用p s e u d o m o n a sd a c u n h a ec p u 9 0 0 1 菌株作为l 丙氨酸产生菌，进行了发酵条件的优化。研究发现，p s e u d o m o n a s d a c u n h a e 菌体中的l 天冬氨酸b 脱羧酶可能不是诱导酶，而是结构酶。因为 酶的活力不因为底物l 一天冬氨酸的存在而提高，而且在一般情况下只要菌体生 长得好，酶活力就高。菌体放置第6 天后，酶活力达到最高，说明该酶的合成滞 后于菌体生长，该酶的基因表达与翻译比较缓慢。该酶的活性中心为l 谷氨酸 的y 羧基，在培养液中加入适量的l 一谷氨酸钠有利于酶的合成。试验得出该菌的 生长和产酶的最佳培养条件为：1 5 谷氨酸钠，0 5 富马酸铵，1 o 富马酸钠， 3 n 米浆，2 蛋白胨，o 0 5 k h 2 p 0 4 ，0 0 1 m g s 0 4 7 h 2 0 ，p h 7 7 5 ，3 0 c ， 1 8 0 r p m 振荡培养2 8 小时。 1 9 9 6 年，他们2 7 1 进行了从固定化细胞连续生产l 丙氨酸的中试工艺研究。其 9 浙江大学硕士学位论文 固定化德阿昆哈假单胞茵生产l 一丙氨酸的研究 固定化方法为：用生理盐水加热溶解卡拉胶，使其终浓度为3 2 ，湿细胞终浓 度为1 6 ，于4 5 c 均匀混合，置4 c 冰箱，加入o 3 m o l l k c l 浸泡2 h ，切成1 l l c m 的小块，经戊二醛交联，用0 1 m o l l 甘氨酸充分洗涤，于3 t c 活化 2 4 h 。将5 0 k g 的固定化细胞装于m 3 0 0 c m 2 0 0 0 c m 的酶柱，底物溶液为5 5 k g l a s p ，加去离子水3 5 0 l ，加氨水( 2 8 ) 使溶液p h 6 0 ，加去离子水至4 0 0 l ， 加入p l p 0 1 m m o l l ，3 7 ，上行法通过酶柱。研究发现循环液流速以3 0 l h 最 佳，每蚝固定化细胞可转化2 k g 底物，转化率大于9 8 ，产物收率大于8 5 ， 固定化细胞酶活力半衰期大于8 0 d 。成品经分析，纯度大于9 8 5 。 1 9 9 7 年大连轻工业学院的余斐等【2 8 1 提出，在酶法合成中，产物l 丙氨酸对酶 有抑制作用，并选用p f r 型填充床式反应器，以k 一卡拉胶为包埋材料，包埋 p s e u d o m o n a sd a c u n h a e d q p l ，在底物为l m o l ll 一天冬氨酸、3 7 、p h 6 0 条件 下，连续生产l 丙氨酸。在转化率达到9 5 时，计算出固定化细胞和反应器的 效率分别为o 0 1 5 9l 丙氨酸儋固定化细胞h 、o 0 1 3gl - 丙氨酸m l 反应器h 。还 建立了填充床反应器停留时间与转化率的数学模型进行系统仿真。同时，连接 e s c h e r i c h i ac o l is f d 4 和p s e u d o m o n a sd a c u n h a e d q p l 的固定化细胞柱式反应 器，试验了从石油裂解副产物产品反丁烯二酸连续生产l - 丙氨酸。这些试验都 是一些初步的研究，并没有获得理想的效果。三年后他们【2 9 1 提出采用加电固定化 膜式反应器可以在一定程度上消除产物l 丙氨酸对l 一天冬氨酸一b 一脱羧酶的竞 争性抑制，指出当所加静电压为3 6 v 时，底物转化率至少提高1 8 倍。 1 4 小结 l 丙氨酸在食品、医药和化工领域均具有广泛的应用，并有日益增长的趋势。 它的技术开发较晚，8 0 年代初才在日本工业化生产。我国在8 0 年代末有小批量 生产，由于应用开发的滞后，产品内销不畅，工业化生产举步维艰。 l 一丙氨酸制备经历了由蛋白水解提取法、发酵法到酶法的过程。提取法由于 原料来源的限制和成本的居高不下，无法大规模生产：发酵法工艺不稳定，后提 取困难，产率低，生产成本高。现在工业化生产的方法就是酶法转化，其中还分 为固定化细胞法和游离细胞法。 l 一丙氨酸生产菌种有很多( 如下表所示) ，但是目前用的最多的还是 浙江大学硕士学位论文固定化德阿昆哈假单胞菌生产l 一丙氨酸的研究 p s e u d o m o n a sd a c u n h a e ，对它的研究也最多、最成熟。 p s e u d o m o n a sd a c u n h a e德阿昆哈假单胞菌 b r e v i b a c t e r i u mf l a v u m黄色短杆菌 c l o s t r i d i u m p e r f r i n g e n s 产气荚膜梭菌 d e s u l f o v i b r i od e s u l f u r i c a n s脱硫脱硫弧菌 n o r c a r d i a g l o b e r u l a 小球诺卡氏菌 a c e t o b a c t e rs p醋杆菌 a c h r o m o b a c t e rs p 无色杆菌 a l c a l 啦? l e s f a e c a l i s粪产碱菌 a r t h r o b a c t e r节杆菌 p a r a c o c c u sf u r i o s u s副球菌 p s e u d o m o n a s p u t i d a 恶臭假单胞菌 大多数文献报道了固定化户d a c u n h a e 细胞法在转化过程中需要辅酶磷酸吡哆 醛( p l p ) ，而p l p 价格昂贵，因此就生产成本而言，固定化细胞法被认为要高 于游离细胞法。所以，国内厂家基本上采用游离细胞法来生产l 一丙氨酸。 日本从8 0 年代初l 丙氨酸实现工业化生产以来，一直对固定化细胞法情有 独钟，并做了相当多的研究，取得了很多的成果。 国内外的研究情况表明，国内对l 丙氨酸的研究还有很大的想象空间，还没 有充分挖掘出低成本的固定化细胞法来生产l 一丙氨酸。 浙江大学硕士学位论文 固定化德阿昆哈假单胞茵生产l 一丙氨酸的研究 第二章固定化细胞方法简介 2 1 前言 根据1 9 7 1 年首届酶工程学会议对固定化酶的定义，学者们p o l 界定了固定化 细胞的定义，即“自然固定或定位于一定限制性空间，并保持固有的催化活性， 一旦需要和可能，其活性能反复地重复使用的细胞”。 固定化细胞技术在对固定化酶进行广泛研究和应用的基础上，近年来逐渐发 展起来的一系列固定完整细胞的方法，较之以前的固定化方法，有很大的进步。 尽管固定化细胞的出现远远晚于固定化酶，但由于它较后者有着许多无可比拟的 优势，其应用范围要广泛得多。目前固定化细胞已经在工业、医学、化学分析、 环境保护、能源开发以及理论研究等方面得到了广泛的应用。从2 0 世纪7 0 年代 后期起，国内许多单位陆续开展了固定化微生物细胞的制备和应用方面的研究， 取得了丰硕的成果。 2 2 固定化细胞的性质及优点t 3 - ， 2 2 1 固定化酶的优点 与天然酶相比，固定化酶具有以下优点： ( 1 ) 酶的稳定性大大增强。如聚氯杂环丁烷固定化e c o l i 的l 一天冬氨酸酶 连续反应2 年，其活力仍保持9 7 ： ( 2 ) 反应后，酶与产物易于分开，产物易于纯化，从而大大降低生产成本； ( 3 ) 固定化后的酶可长期反复使用； ( 4 ) 酶的利用率高。如每公斤葡萄糖异构酶干粉固定化后可连续生产2 i t 果葡糖，较相同数量的天然酶高2 0 倍； ( 5 ) 可实现转化反应连续化和自动控制。 2 2 2 固定化细胞的优点 细胞固定化技术是酶固定化技术的延伸，因此，固定化细胞除了具有固定化 酶的上述优点外，还具有下列特点： 浙江大学硕士学位论文 固定化德阿昆哈假单胞茵生产l 一丙氨酸的研究 ( 1 ) 无需进行酶的分离和纯化，所需设备简单，操作方便，反应时间短，条 件易于控制； ( 2 ) 固定化过程酶的回收率高： ( 3 ) 固定化细胞内酶的稳定性较固定化酶的稳定性高； ( 3 ) 酶促效率明显增高。与固定化酶不同，菌体细胞在固定化过程中通常不 损伤细胞本身，细胞内的酶系统也最大限度的保持着天然状态，因此有 理由相信固定化菌体细胞具有较高的酶促效率； ( 4 ) 具有多步酶促反应的特点。微生物细胞内具有维持生命活动的完整系统， 经固定化后它相当于一个完整的多酶反应器，能有条件地完成复杂的多 步酶促反应； ( 5 ) 反应时不需添加辅助因子。酶促反应往往需要a t p 、m 9 2 + 、n a d 等辅 助因子参与。由于细胞内已经具有这些物质，固定化后它们一般能保留 下来甚至再生，因此反应时不需要再添加； 2 3 固定化细胞的种类f 3 2 1 依细胞的生理状态，固定化细胞可分为： r 增殖细胞 r 固定化活细胞 静止细胞 i【饥饿细胞 固定化细胞1f 完整细胞 fi 兀细月巴 l 固定化死细胞 细胞碎片 l 细胞器 固定死细胞常需经过物理或化学方法的处理，如加热、匀浆、干燥、冷冻、 酸及表面活性剂等处理，目的在于增加菌体细胞膜的渗透性或抑制副反应，所以 比较适于单酶催化的反应。 固定化静止细胞和饥饿细胞在固定化之后，细胞是活的，但是由于采取了控 制措施，细胞并不生长繁殖，而是处于休眠状态或饥饿状态。 固定化增殖细胞是将活细胞固定在载体上并使其在连续反应过程中保持旺盛 的生长、繁殖能力的一种固定化方法。与固定化酶和固定化死细胞相比，由于细 胞能够不断繁殖、不断更新，反应所需的酶也就可以不断更新，而且反应酶处于 浙江大学硕士学位论文 固定化德阿昆哈假单胞茵生产l 一丙氨酸的研究 天然环境中，更加稳定。因此，固定化增殖细胞更适宜于连续使用。从理论上讲， 只要载体不解体、不污染，就可以长期使用。固定化细胞保持了细胞原有的全部 酶活性，因此更适合于多酶顺序连续反应。所以说，固定化增殖细胞在发酵工业 中最有发展前途。 2 4 固定化细胞的制备方法 常用的固定化细胞的制备方法有吸附法、包埋法、共价结合法、交联法、多 孔物质包络法、超滤法等几大类。其中以包埋法研究最多，应用最广。 迄今为止已经使用过的固定化方法种类繁多，新的方法也层出不穷。但是， 尚没有一种通用的、理想的方法可供使用。一般认为，理想的固定化细胞的制备 方法应具有如下特点”引： ( 1 ) 固定化细胞应具有良好的热稳定性，高压下亦能保持稳定； ( 2 ) 固定化所使用的原材料应该便宜、易得，固定化成本应尽量低； ( 3 ) 固定化方法应简便易行，固定化过程应尽可能温和，尽量减少细胞损伤； ( 4 ) 应能够人为地控制固定化细胞的大小、形状、孔隙度、网状结构等，使底 物、产物及其它代谢产物能自由扩散，从而不影响酶促反应和活细胞的新 陈代谢，在所使用的p h 和温度下，不会被破坏； ( 5 ) 在反应器内长时间运转过程中，固定化细胞应具有良好的机械稳定性和化 学稳定性； ( 6 ) 载体对细胞应该是惰性的，不损伤细胞； ( 7 ) 载体应该能增加细胞膜的通透性，使底物、产物和其它代谢产物能够自由 扩散。因为产物和其它代谢产物常常能抑制细胞的酶反应，更需要能尽快 扩散开去； ( 8 ) 载体要具有高的细胞负载量，使单位体积的载体结合尽可能多的细胞。当 使用固定化增殖细胞时，更有此需要。 2 4 1 无载体的固定化方法 顾名思义，无载体的固定化细胞方法是一种以细胞本身为载体，把细胞内的 酶通过热、p h 、有机溶剂、双功能剂等一系列处理，使其固定在细胞内物质上 浙江大学硕士学位论文 固定化德阿昆哈假单胞茵生产l 一丙氨酸的研究 的方法。我们可以通过以下三种基于不同原理的无载体固定化法来窥其一斑。 2 4 1 1 细胞内酶的固定 利用所需要酶与细胞内物质( 蛋白质类) 对热、p h 、有机溶剂、b 射线等的 稳定性不同，以及用双功能剂把酶分子固定于细胞内物质上。 1 9 6 9 年，高崎义幸 = ；4 j 发现白色链霉菌细胞于6 5 。o ；0 n 热处理1 5 m i n 可将葡萄 糖异构酶固定在细胞内。经处理的菌体即使保温于自溶条件下，酶也不释放。用 该法可以固定总酶活性的8 0 9 0 。 用热、p h 和有机溶剂对菌体进行处理还不能使酶在细胞内固定得很牢固。如 果再用双功能剂交联，那么酶的稳定性就增加了。最常用的双功能剂是戊二醛， 它分子量小、毒性低。 2 4 1 2 菌体间的交联 双功能剂还可实现菌体间的交联。这种交联的菌体颗粒小，使用不便，使用 一次后，菌体要从反应液中过滤分离出来再使用。 2 4 1 3 把酶交联到细胞壁上 近年来，有些报道将分离的酶交联到缺少所需要催化活性的其它微生物细胞 壁上，这种微生物细胞可以是有生命的。用这种方法可以使微生物细胞具有二种 ( 或更多) 所需要的酶。如果其中之一是胞内酶，而其它是胞外酶，则可以把胞 外酶结合到含胞内酶的细胞上。这样，可以产生“人造多酶系统的细胞”。 2 4 2 吸附法 吸附法是通过静电吸引或利用载体对细胞的亲和性将细胞直接吸附在水不溶 性载体上的一种固定化方法。 吸附法是一种比较简单的固定化方法，一般只要把载体放在细胞悬浮液中， 搅拌或浸泡，然后洗去没有被吸附的游离细胞，就制成了固定化细胞。 浙江大学硕士学位论文固定化德阿昆哈假单胞茵生产l 一丙氨酸的研究 2 4 2 1 表面吸附法 利用微生物细胞固有的吸附能力制备固定化细胞，供吸附细胞用的载体都是 多孔性物质，如高岭土、硅藻土、多孔硅、活性炭、离子交换树脂、多孔玻璃等。 有时，微生物本身并不具有吸附能力，但是通过改变细胞或固体载体表面的理化 性质可以使微生物细胞以离子引力或借助化学键吸附到载体上。 2 4 2 2 细胞聚集法 某些细胞具有形成聚集体或絮凝颗粒的倾向。在柱式反应器内，这种聚集体 非常稳定。由于细胞浓度很高，所以表现出很高的生物转化速率。 众多研究表明，吸附法具有较多的优越性口”。其一，制备工艺简单，不需要 专门设备，操作温和，对细胞无损伤。因此，用于工业生产可节省能源、人力以 及机械设备；其二，用于固定化的载体来源广泛、价廉、处理方便，可节省资金， 易于推广应