（食品科学专业论文）对辣根中硫代葡萄糖甙的纯化与鉴定及水解条件的研究.pdf

摘要 硫代葡莓糖甙是存在于十字花科楂物中韵次生代谢产物，可作为杀虫剂、抗微，生物制 剂和天然熏蒸消毒剂，其降解产物异硫氰酸酯除具有强烈的辛辣气味可作为调味品外，具 有抑菌、抗病毒和抗癌活性，它能够有效的防止饮食中的多种致癌物如多坏芳烃、杂环胺 和亚硝胺所引起的d n a 损伤和癌症。硫甙的研究吸引了众多食品化学、医药、生物学家 的研究兴趣。 本文介绍了硫甙的结构和化学性质，探讨了辣根中提取硫甙的影响因素，从而得出 硫甙最佳提取条件为样液比、提取温度和提取时间分别为7 0m l g ，9 0 和2 0r a i n 。测 定条件显色温度和显色时剃分别为2 7 2 9 和4h 。然后通过对1 2 种大孑l 树脂对硫 代葡萄糖甙的吸附和脱附能力的比较研究，发现大孔强碱性阴离子交换树脂d 2 0 1 g f 选择 性吸附硫甙的能力最强，且硫甙容易被洗脱。可用于从水溶液中提取分离硫甙。当利用 d 2 0 1 g f 提取硫甙时，探讨了提取液体积、p h 、提取温度、吸附时b j 等因素对d 2 0 1 g f 吸附硫甙的影响以及洗脱莉的种类、最小使用量、洗脱时间等因素对硫甙脱附的影响。研 究结果表明，d 2 0 1 g f 树脂的最大饱和吸附垂为2 3 9 4p m o l t g 、吸附率9 6 2 9 ；p h 值对 d 2 0 1 g f 吸附硫甙几乎没有影响，不需要在吸附前对提取液进行口h 值的调整，最佳提取 温度5 0 、振摇时例为1 5r a i n ：最佳的洗脱剂是1m o l l 的n a c i ，振摇3 0r a i n 即可达 到9 9 的脱附效果。得到硫甙提纯液后，用反相离子对色谱确定分离条件，分离鉴定辣 根中的硫甙。对辣根茎叶粉从温度、时间、p h 值以及抗坏血酸的浓度等主要影响因素对 硫代葡萄糖甙的水解条件进行了币交试验研究，提出了硫甙水解的最佳条件：3 0 、2 0 r a i n 、p h4 0 、抗坏血酸的添加量为0 2m g g 。 关键词：硫甙；大孔树脂；吸附；解吸；永解 a b s t r a c t g l u e o s i n o l a t e sa r ea b u n d a n tp l a n ts e c o n d a r ym e t a b o l i t e st h a ta r gf o u n di nc r u c i f e r o u sp l a n t s t h e yh a v em u c he f f e c t i v e n e s s 鹳ap e s t i c i d e a n t i - m i c r o b i a lr e a g e n ta n dn a t u r a lf u m i g a t e d d i s i n f e c t o r i s o t h i o c y a n a t e sa r et h e i rd e g r a d a t i o np r o d u c t s ，w h i c hh a v es h o w nas e r i e so f b i o l o g i c a la n dc h e m i c a lc h a r a c t e r i s t i c s b e s i d e st h e i rs p e c i a lf l a v o rf o rc o n d i m e n t s ，t h e yh a v e m a n yb i o l o g i c a lp r o p e r t i e ss u c ha sa n t i - b a c t e r i a l a n t i - c a r c i n o g e n i cp o t e n t i a l i t c sc a np r o t e c t d n a d a m a g ea n dc a n c e rc a u s e db ym a n yd i e t a r yc a r c i n o g e n ss u c ha sp o l y c y c l i ca r o m a t i c h y d r o c a r b o n s ，h e t e r o c y c l i ca m i n e sa n dn i t r o s a m i n e s t h e s ep r o p e r t i e s h a v ea t t r a c t e dt h e i n t e r e s t i n go f m a n yf o o dc h e m i s t s ，m e d i c i n a ls c i e n t i s t sa n db i o l o g i s t s i nt h ep r e s e n ta r t i c l e ，w eg i v es t u d i e so nt h ef o r m a t i o n , c h e m i c a lp r o p e r t i e sa n dd i s c u s s e x t r a c t i o nc o n d i t i o n s t h eo p t i m a lc o n d i t i o n sw e r et h a tp r o p o r t i o no fw a t e ra n dh o r s e r a d i s h t e m p e r a t u r ea n dt i m eo fe x t r a c t i o nw e r e7 0m l g 9 0 a n d2 0r a i nr e s p e c t i v e l y 。t h eo p t i m a l c o n d i t i o no fd e t e c t i o nw e r et h a tt e m p e r a t u r ea n dt i m ew e r e 2 7 ( 2 - 2 9 a n d4 h b yc o m p a r i s o n s t u d i e so n1 2m a c r o p o r o u sr e s i n sa d s o r b i n go rd e s o r b e dt h eg l u c o s i n o l a t e si nh o r s e r a d i s h ， d 2 0 1 g ft h a ti st h em o s ts t r o n g l yb a s i ca n i o ne x c h a n g e r - r e s i na m o n g1 2r e s i n s ，s h o w st h eh i g h e r a d s o r p t i o nc a p a c i t ya n de a s i e rd e s o r p t i o nt og l u c o s i n o l a t e st h a no t h e r s t h e na n di tc a l lb eu s e d t oe x t r a c tt h eg l u c o s i n o l a t e sf r o ma q u e o u ss o l u t i o n e f f e c t so ft h ev o l u m eo ft h ee x t r a c t i o n s o l u t i o n ，p hv a l u e ，t e m p e r a t u r ea n dt i m eo fa d s o r p t i o no nt h er e c o v e r yo fg l u c o s i n o l a t e sw e r e s t u d i e d m e a n w h i l e ，t h ei n f l u e n c e so fv a r i e t i e so fe l u t i o n 。t h em i n i m u ma m o u n ta n dt i m eo f d e s o r p t i o no nt h ed e s o r p t i o nm e t h o dw e r ea l s oe v a l u a t e d t h er e s u l t ss h o wt h a tm a x i m u m a d s o r p t i o no fd 2 0 1 g fi s2 3 9 4l a m o l ga n dt h ea d s o r p t i o ny i e l di s9 6 2 6 。t h ee f f e c to fp h v a l u ew a sn os i g n i f i c a n t t h e r e f o r e ，p h a d j u s ti sn o tn e c e s s a r y t h eo p t i m a lc o n d i t i o n sw e r et h a t t e m p e r a t u r ea n dt i m eo fa d s o r p t i o nw e r e5 0 a n d15m i nr e s p e c t i v e l y t h eo p t i m a le l u t i n g s o l v e n tw a slm o l lo fs o d i u mc h l o r i d e t h ed e s o r p t i o ny i e l di se x c e s s9 9 i nt h ea d d i t i o no f t e m p e r a t u r eo f5 0 a n ds h a k i n gt i m eo f15m i n t h ee x t r a c t i n gs o l u t i o no fg l u c o s i n o l a t e sw a s p u r i f i e d ，ar e l i a b l em e t h o dt os e p a r a t ea n di d e n t i f yg l u c o s i n o l a t e si nh o r s e r a d i s hw a sd e v e l o p e d b yu s i n gr e v e r s e d p h a s ei o n - p a i rh p l c w i t ht h es h o o t i n go fh o r s e r a d i s h a n d ，e f f e c t so f t e m p e r a t u r e ，t i m e ，p hv a l u e ，c o n c e n t r a t i o no fv i t a m i nc o nh y d r o l y z a t i o no fg l u c o s i n o l a t e sw e r e s t u d i e d d e s i g n i n go r t h o g o n a le x p e r i m e n t a t i o n ，t h eo p t i m a lc o n d i t i o n sw e r et h a tt e m p e r a t u r e ， t i m e ，p hv a l u ea n dc o n c e n t r a t i o no fv i t a m i ncw e r e3 0 ，2 0m i n 。4 0a n d0 2m g g k e yw o r d s ：g l u c o s i n o t a t e sm a e r o p o r o u sr e s i n sa d s o r p t i o nd e s o r p t i o n h y d r o l y z a t i o n 第一章前言 第一章前言 1 1 硫代葡萄糖甙结构 1 7 世纪末。人们在探索荠菜籽特殊的辛辣昧时就发现了硫代葡萄糖甙( g l u c i s i n o l a t e ) 存在，简称为硫甙( 0 s ) 。直到1 9 世纪3 0 年代才从黑芥子和白芥子中分别分离出了2 丙烯基硫甙和白芥子硫甙两种硫甙。1 9 世纪未g a d a m e r 提出硫甙基本结构r n c s 结 构，即g a d a m e r 模式，此模式一直沿用了5 0 多年。1 9 7 0 年，m a r s h 和w a s e ri l l 等对硫甙 晶体的x 射线分析证明了所有的硫甙都具有相同的基本结构( 如图1 1 所示) 。硫甙都是 由b 硫代葡萄糖基、磺酸盐醛肟基团和一个烃基( r ) 所构成的。硫甙在组成上都具有一 个相同的母体，区别在于侧链r 的结构不同，其侧链多种多样，分直碳链或支碳链，含 双键、羟基、羰基或各种氧化态硫。根据其侧链结构，把硫甙分为三类：( 1 ) 含有直链或 支链烷基的脂肪族硫甙；( 2 ) 含有苯环的芳香族硫甙：( 3 ) 含有吲哚坏的吲哚族硫甙。 r e g s o ： 舡，( s i n i g r i n ) ：( g l u c o c i n ) p 。声一2 m o h 3 惭删 圈卜i硫甙的基本结构及不同r 基的二种硫甙 资料来源：g e r h a r db r i n g m a n n l 、i n g ak a j a h n 、c h r i s t l a nn e u s 、m a t t h i a sp e l z i n g a n a l y s i so f t h eg l u c o s i n o l a t e p a t t e r no f a r a b i d o p s i st h a l i a n as e e d sb yc a p i l l a r yz o n ee l e c t r o p h o r e s i sc o u p l e dt oc l e c t r o s p r a yi o n i z a t i o n m a s s s p e c t r o m e t 哆 j e l e c t r o p h o r e s i s2 0 0 5 ( 2 6 ) ：i 第一章前言 1 2 硫代葡萄糖甙的降解 硫甙存在于细胞液泡中，当植物组织受到外界破坏而被损伤时，就会引起硫甙降解。 这是因为植物中存在一种特异糖蛋白酶一黑芥子酶，它能够催化硫甙水解。黑芥子酶存 在于细胞质中并与硫甙之间存在天然物理隔离，当组织受伤时，硫甙与酶之自j 物理隔离被 破坏，从而发生硫甙水解。当硫甙发生酶促降解时，首先是在酶的催化下生成葡萄糖和不 稳定的糖甙配基，糖甙配基继续水解或重排生成相应的降解产物【2 l ( 如图1 2 所示) 。糖甙 配基在中性和弱酸性条件下，通过霍夫曼( h o f f m a n n ) 重排得到异硫氰酸酯( 1 1 s ) ：在 酸性条件下，水解产物则以腈类( n i t r i l e s ) 为主；在有e p s 酶和f e 2 + 存在时，并且当r 的末 端带有不饱和键时，降解产物主要是环硫腈( e p i t h i o n i t r i l e ) r 为吲哚或苯及其衍生物时， 将重排生成硫氰酸酯( t h i o c y a n a t e s ) t 3 1 ：r 含有羟基时则生成的异硫氰酸酯能够自动环化 生成嗯唑烷硫酮( o t z ) 。 硫甙在高温、高压等情况下，也能够发生一定程度的非酶降解，其降解过程非常复杂， 主要生成产物是腈类、异硫氰酸醅、硫氟酸醅或嗯唑烷硫醌。产物的组成及以何种产物为 主，则与硫甙的r 基团的结构、外界环境及降解条件有关【4 i c 时1 _ c 剽 3 r s c 三一 r c 暑；n r - - n ：c ：s 图1 - 2 硫甙及其降级产物的结构 资料来源；s t e v e nf v a u g h n ，m a r ka b e r h o w g l u c o s l n o | a t eh y d r o l y s i sp r o d u c t s f r o mv a r i o u sp l a n ts o u r c c $ ：p he f r e c t s ，i s o l a t i o n ，a n dp u r i f i c a t i o n j i n d u s t r i a lc r o p sa n dp r o d u c t s 2 0 0 5 ( 2 1 ) ：1 9 4 1 3 硫代葡萄糖甙分析方法 已开发出来的硫甙测定方法很多，早期对硫甙测定只局限于定性分析上，如纸色谱法、 2 降y ； 一。 一 = 州 第一章前言 薄层色谱法、氯化钯目测法等。随着色谱技术和其它相关技术的发展，硫甙的测定方法不 断改进，许多新方法也相继被发展，在某种意义上讲真正地实现了对硫甙定量分析。如气 相色谱法、高效液相色谱法、离子对色谱法、亲水作用液相色谱、毛细管电泳、超临界流 体色谱、高速逆流色谱法以及相关的联用技术等，还有比色法的提出，膜在硫甙测定中的 应用、使用酶联免疫吸附测定硫甙。 1 3 1 定性分析 纸色谱【5 1 已经广泛用于硫脲的分离。硫脲是硫甙酶水解释放出的异硫氰酸盐和氨的反 应产物。纸色谱的应用有助于建立多种种类植物中硫甙的分析方法。 利用高压纸色谱在酸性条件下( 常用的有三种缓冲体系：p h i 9 ，p h 3 6 和p h 6 5 ) 可以 从含有污染物的植物萃取液中提取纯的硫甙，但有一些分解物存在。如果纸带允许在氨气 中干燥的话，这种现象可以避免。 利用等速电泳，可以分离和定量褐芥子、黑芥子中的烯丙基硫甙，分离和定量黄，白 芥子中的4 羟基苄基异硫氰酸盐。 利用薄层色谱也可以分离硫甙。原理是利用硅胶g 薄层，展开剂为正丁醇：正丙醇： 乙酸：水( 3 ：l ：l ：1 ) ，用三氯乙酸的氯仿溶液进行喷雾然后用铁氰比物氯化铁或硝酸 银的碱溶液进行检铡。应该指出，当使用的展开荆中有吡啶时一些硫甙将会发生分解。 1 3 2 半定量分析 试纸比色法，原理是采用m # b 日l 进的t e x t a p e ( 葡萄糖试纸) 来检测，试纸由黄变绿 与标准色和对照样品( 已知低硫甙品种) 比较，即可知其含量。 氯化钯比色法是由西德哥廷根大学t h i e s w 提出，早期的方法简单、快速，但由于硫 甙钯沉淀影响了比色和观察，色阶不明显，定量困难。1 9 8 3 年吴谋成【6 1 等在试验中加入分 散剂羧甲基纤维素钠。使比色液成为溶胶清液，清除了琉甙钯沉淀对比色的影响，进一步改 进硫甙钯的显色反应条件，使氯化钯法从定性，定量法变成为快速、简单的定量分析方法。 其测定原理：硫甙在酸性条件下与四氯钯酸钠生成有色络合物沉淀。当加入一定量的分散 、 第一章前言 剂羧甲基纤维素钠溶液时，沉淀消失，溶液变为清亮，适宜比色测定。然后再测其吸光度， 最后与标准曲线比较就可计算出含量。 氯化钯比色法具有以下优点；一、步骤简单，只需要沸水提取，沉淀蛋白质，抽滤， 显色测定这几步。二、快速适于大批量检验，除显色需要4 个小时以外，其他步骤所需时 间极短。三、廉价，无论是气相色谱法( g c ) 还是高效液相色谱( h p l c ) 。价格比较昂贵， 而氯化钯比色法只需要一些实验室常用的设备即可，如可见光分光光度计、抽真空泵等。 i 3 3 定量分析 1 3 3 1 气相色谱法( g c ) 硫甙的三甲基硅烷衍生物具有挥发性，可用气相色谱进行分离。当硫甙被衍生时，经 过一个脱硫过程，色谱分离的实际上是脱硫硫甙的三甲基硅烷衙生物。脱硫硫甙是硫甙生 物合成中的一个中间产物，所以，脱硫硫甙在植物中伴随着硫甙同时存在。1 9 7 1 年， u n d e r h i l l 和k i r k l a n d t 7 】首次提出利用脱硫硫甙的三甲基硅烷衍生物的气相色谱对硫甙组成 进行鉴定。具体方法是用沸水钝化脱脂菜籽粕中的内源酶同时提取其中的硫甙，加入烯丙 基和苄基硫甙做内标，离心分离，取上清液加入醋酸钡醋酸铅混合溶液，离心分离，上清 液加到d e a es e p b a d c x a - 2 5 柱中，并甩醋酸吡啶洗脱。在柱中加入硫酸酯酶，放置过夜。 脱硫硫甙用水沈脱，加入吡啶及硅烷化试t m c s ，盖严，1 2 0 下保温2 0r a i n 。取一定量 在o v - 7 柱上程序升温色谱分离。此种方法适用于含有大量碳水化合物的样品，测定极限为 1 0p m o 垤粕。因衍生过程中释放出的硫酸根干扰气相色谱分离，所以常在衍生之前进行脱 硫。脱硫是用硫酸酯酶，而样液中的游离硫酸根抑制硫酸酯酶的活性，在脱硫之前应加入 醋酸铅一醋酸钡混合溶液使之沉淀离心分离除去。 气相色谱一质谱联用( g c - m s ) 适用于植物萃取物和提纯的硫甙混合物，可同时确定硫甙 结构和组成。 第一章前言 1 3 3 2高效液相色谱法( h p l c ) 和反相液相色谱( r p c ) 对于高效液相色谱( h p l c ) ，国际标准化组织( i s o ) 在1 9 8 4 1 9 9 2 年期间【7 1 组织国际多 家机构对几种主要的硫甙测定方法进行研究评价，考察的测定方法有以下几种：携带或不 带程序升温的气一液色谱法、测定脱磺酸基硫甙( d g s ) 的h p l c 法、使用或不使用柱纯化 的葡萄糖释放法、氯化钯法、百里酚法、x 射线荧光分析法、近红外光谱法。最后提出 了测定硫甙的官方方法，即h p l c 法和x 射线荧光分析法。这两种方法可测定单体硫甙 和总硫甙含量，在国际范围内取得了很好的重复性、再现性，1 9 9 1 年经i s o 专家推荐， h p l c 法已经被接受并公布( i s 0 9 1 6 7 - - 1 ) ；1 9 9 3 年欧洲标准委员会也推荐h p l c 法。 高效液相色谱法，避免了高温及酸、碱等可导致硫甙分解的条件，因而这种方法在硫 甙的分离、鉴定和提纯方面具有很大的潜力。具体方法【8 l 是菜籽粕加沸水钝化内源酶并提 取其中的硫甙，加入烯丙基硫甙做内标，加入醋酸钡醋酸铅溶液，摇匀，水浴上加热后 离心分离，上清液加到d e a es e p h a d e xa - 2 5 柱中，柱子流干后用醋酸吡啶溶液洗涤，加 入硫酸酯酶，放置过夜，脱硫硫甙用水沈脱，取样进色谱柱分析，3 乙腈做流动相。此 种方法和气相色谱法相比，前处理步骤较简单，且消除了由于不完全衍生而产生的误差， 且避免了高温条件下的分解，灵敏度高。是测定硫甙分量并能准确定量的方法。 反相色谱法分离时，分配机制是h o r v a t h 等提出的疏溶剂理论，即在r p c 中，固定 相表面有烃基，保留主要是硫甙提取液中的非极性部分受水和极性溶剂甲醇的排斥，而与 非极性固定相缔合。用此法柳来分离，色谱柱为反相c 1 8 柱；流动相a 为醋酸铵溶液( o 0 5 m o l l ) ，b 为乙腈；流速为lm l m i n ：线性梯度洗脱，于3 0r a i n 内流动相a 由1 0 0 降 低到8 0 ：柱温为3 0 ，紫外检测器于2 2 9l i r a 下检测；内标物为烯丙基硫甙。 反相色谱系统简单，分析快速，重现性好，柱平衡时问短，柱寿命一股较长。不足之 处是以硅胶为基质的柱填料能使用的p h 值范围局限在p h - - 2 0 7 5 。在硅胶表面往往留 有一定量来反应的硅醇基，这些活性作用点会吸附溶质，而导致峰形不好。 1 3 3 3 离子对液相色谱( 1 p c ) 及亲水作用液相色谱( h i l i c ) 离子对色谱法( i p c ) 分离硫甙的基本原理是通过加入合适的反离子同提取液中的硫甙 形成离子对，硫甙离子和反离子均易溶于水相，而组成的离子对复合物则易溶于有机相， 第一章前言 离子对在两相之间经过多次分配而得到分离l 嘲。 具体方法是：用沸水钝化芥籽或其它十字花科植物样品中的内源酶，并提取其所含的 硫甙，以烯丙基硫甙做内标，加入醋酸钡醋酸铅溶液摇匀，水浴加热后离心分离，上清 液加到d e a es e p h a d e xa - 2 5 柱中，柱子流干后用醋酸吡啶溶液和水洗涤，最后用硫酸钾 溶液洗脱后，用p v d f 滤膜过滤，滤液供i p c 分析。流动相为四丁基溴化铵( 4 5m m o l l ， p h7 ) ：乙腈= 9 0 ：1 0 ，流速为lm l m i n 。色谱柱为o d s 柱，拄温为3 0 。i p c 法在 用于直接分离硫甙方面是一种重现性好、精密度和准确度较高的方法【il l 。 i p c 分离测定硫甙时，是利用四丁基铵阳离子来中和磺酸基的负电荷，使硫甙呈电中 性。另外。不同的硫甙其侧链是不相同的，i p c 法就是利用不同硫甙这一差异来达到分离 的目的。i p c 法多用于非极性硫甙的分离和分析，对强极性的硫甙分离效果较差。如果利 用i p c 测定极性硫甙则必须使用由多种试剂和不同的离子对所构成的流动相。 而亲水作用液相色谱( h i u c ) 能够弥补i p c 法的这一缺陷，可用来分离极性硫甙类 化合物l i “。h i l i c 用来分析硫甙时，不需要对硫甙预先进行脱磺酸基处理，因此是一种 简便快速的分析方法，并能够用来分离流动性不好的硫甙。 1 3 3 4 超临界流体色谱法( s f c ) b u s k o v 1 3 i 用超临界流体色谱( s f c ) 来分析鉴定白芥子甙( 对羟基苄基硫甙，s i n a l b i n ) 的各种降解产物。在酶作用下，在p h 值为3 5 - 7 5 范围内，白芥子甙生成对羟基苄基异 硫氰酸酯，在较低p h 值条件下生成腈类化合物。i t c s 分子中的n = c = s 中的c 有高度的 亲电性。能够与亲核试剂发生亲核加成反应1 9 】，生成对羟基苄醇、对羟基苄基抗坏血酸原。 用s f c 分析以上这些硫甙降解产物时，所用的流动相为不同比例的c 0 2 - 甲酵，色谱柱为 硅胶柱( 2 0 0 x 4 6m i l l ，5 1 a m ) 。整个实验中用微处理机控制系统，用高压泵在超临界下输 送流动相并控制流速为2m l m i n ，柱温保持4 0 ，柱压控制在2 0m p a 。采用梯度程序 来控制流动相中c 0 2 与甲醇的配比。甲醇作为极性改性剂可以减少吸附效应，使之较纯 c 0 2 在相同时间内可洗脱出更多的组分，改善分离效果提高柱效。流动相中加入的l 三 氟乙酸能够与硅胶表面的羟基形成氢键。从而改善硅羟基与抗坏血酸原的相互作用，从而 得到好的分离效果。 s f c 与l c 比较。柱效比l c 高很多。这是由于s f c 的扩散系数和黏度接近于气体， 传质阻力小，线速度大，分析时问短，而l c 的液体则较慢，而且s f c 柱子可直接插入 质谱检测器中与之联用。 6 第一章前言 1 3 3 5 高速逆流色谱法( h s c c c ) f a h e y t 1 提出一种新的测定硫甙的方法一高速逆流色谱法( h s c c c ) ，它是一种不用 固态支撑体或载体的液液分配色谱技术，它建立在单向性流体动力平衡体系上。主要原理 是在内径约1 1 61 1 1 1 1 1 左右的细管绕成的螺旋管柱里，互不相溶的两相溶剂能在重力场的作 用下形成分段状态。在螺旋管的高速转动下，两相就会沿螺旋管纵向完全分开，并且两相各 自占据一端。如果从尾端送入首端相，它将穿过尾端相而移向首端，同样，如果从首端送入 尾端相，它会穿过首端相而移向螺旋管的尾端。分离时，在螺旋管内首先注入其中的一相 ( 固定相) ，然后从合适的一端注入移动相，让它载着样品在螺旋管中进行无限次的分配。 由于不同的物质在两相中具有不同的分配系数，其在柱中的移动速度也不一样，因此一个 复杂的样品通过这样一个过程，就能达到我们需要的分离效果i 嘲。 具体方法是以丙醇：乙腈：饱和硫酸铵溶液：水( 1 ：o 5 ：1 2 ：1 ) 的混合液作为固定 相，以有机相作流动相，由于硫甙在水相和有机相之间分配系数不同，从而达到有效地分 离硫甙的目的。该法的优点是，h s c c c 法能够很好地消除传统h p l c 固定相基质由于吸 附少量样品而使测定结果偏低的现象。 1 3 3 6 利用色质联用测定硫甙 色质联用技术是分离和鉴定复杂样品组成比较有用的技术。但其中气相色谱一质谱联 用技术( g c m s ) 用于硫甙的分析有很多局限性，因为g c 要求样品具有一定的蒸气压， 样品需要经过适当的预处理和衍生化，成为易汽化的样品才能进行g c m s 分析。因为有 些硫甙难挥发或具有热敏性，所以广泛使用的是液相色谱一质谱联用技术( l c m s ) 。 l c m s 联机具有高分离能力，高灵敏度，应用范围更广和具有极强的专属性等特点，越 来越受到人们的重视。 分离鉴定硫甙，早期报道过l c m s 联用技术有热喷雾电离( t s p ) 接口与快原子轰击 ( f a b ) 接口。t s p 的不足之处在于其重现性较差，检测限较低；而f a b 面临的很大一个 问题是混合物样液中共存物质的干扰，它们常常会抑制分析物的离子化，造成灵敏度下降 1 6 1 。 近几年，这两种接口逐渐被电喷雾( e s i ) 接口和大气压化学离子化( a p c i ) 接口技术取 代。e s i 适合于中等极性及强极性硫甙的测定：a p c i 则适合测定非极性硫甙。c a i 等用 第一章前言 e s i q t o f m s 技术分离鉴定硫甙【 】，不仅能对色谱流出组分进行高灵敏度检测，而且能 进行准确的分子量测定，从而可以直接给出硫甙的化学式。但e s i 的主要缺点是它只能接 受非常小的液体流量( 1 - l o 皿肺i n ) 。a p c i 技术是一种大气压雾化技术，采用电晕放电方 式使流动相离子化，能大大增加离子与样品分子的碰撞频率。a p c i 形成的是单电荷的准 分子离子。不会发生e s i 过程中形成多电荷离子而发生信号重叠。a p c i 的出现使l c m s 成为种灵敏度商( 1 0 9g ) 、分析速度快的联用技术，被广泛应用于硫甙的鉴定【噶l 。 此外，鉴定硫甙的方法还有液相色谱一核磁共振波谱联用技术( l c n m r ) 。但因为n m r 波谱灵敏度低，徽质子谱时需用氘代溶剂，使分析成本大大提高，导致该联用技术在运用 上进展缓慢i l 1 3 3 7 毛细管电泳( c e ) 及胶柬电动毛细管色谱法( m c c ) k a r e h e r l 2 0 1 报道了利用毛细管电泳( c e ) 法测定硫甙。其所用的检测器是激光诱导荧光 检测器( l i f ) ，该检测器的工作原理是：葡萄糖( 在黑芥子酶酶解作用下硫甙降解释放出) 被葡萄糖氧化酶作用转化为葡糖酸( g a ) ，g a 在h 2 0 2 存在下与a n d s a ( 1 , 3 二磺酸基- 7 胺基萘) 结合，形成一种强荧光的衍生物g a - a n d s a 。所以利用l i f 作为检测器，可以 通过c e 法来测定硫甙含量。 b r i n g m a n n 2 1 l 擐道了利用胶束电动毛细管色谱法( m e c c ) 分离硫甙。m e c c 是在电泳 缓冲液中加入表面活性剂，如s d s 、c 1 a b ，这些分子之间的疏水基团聚集在一起形成胶 束，电荷朝外，烷基藏于内部。其作用类似于色谱固定相，即所谓的准固定相。不同的硫 甙类化合物不仅可以由于淌度差异而分离，又可以基于在水相和胶束相之间的分配系数不 同而得到分离。同时，因为c t a b 分子易吸附在石英毛细管壁上，它的加入能减少s o 。2 。 与硅羟基的相互作用。 p a u g a m 2 2 惆m e c c 技术分离鉴定了四种硫甙。该实验中，在硼酸盐缓冲溶液中加入 s d s 、四甲基羟铵( t m a h ) 和甲醇。反离子t m a h 可以减少s d s 胶束与硫甙之间的电离 排斥，甲醇作为流动相添加到缓冲液中能降低电渗能力、延长迁移时间，正交实验通过改 交s d s 、t m a h 、甲醇的浓度来确定分离的最佳优化条件。 1 3 3 8 比色法 比色法原理是菜籽中的硫甙和四氯钯酸钠反应形成一种有色络合物，可采用比色法测 定。具体方法是菜籽饼粕在沸水浴中干蒸钝化其中的内源酶，加入沸水提取其中的硫甙： 8 第一章前言 分离出上清液，加入羧甲基纤维素钠和氯化钯溶液，放置四小时后，在5 4 0n n l 处测其吸 收值，与标准曲线比较即得出硫甙的含量。这种方法简单、快速而且灵敏度较高，应用比 较广泛圆。 1 3 3 9 膜在硫甙测定中的应用 l e o n i t 2 4 1 研究了一种生物传感器，是将芥子酶固定在尼龙6 6 膜上而制成的。利用此 膜制成一种p h 对偶电极，从油菜籽等其他原料的萃取液中直接测定硫甙，测定原理是每 个硫甙分子水解产生一个h + ：硫甙+ h 2 0 + 芥子酶一i t c + 葡萄糖+ s 0 4 2 + 圹，由p h 测定值 得到硫甙的含量。线性回归的相关系数为o 9 9 8 9 ，表明此法已经足够精确，此法测定结果 与h p l c 法的结果很接近。 s z m i g i e l s k a t 2 5 1 使用离子交换膜从种子悬浮液中吸附硫甙，再用洗脱剂洗脱。用黑芥子 甙为标准样，用h p l c 法测定。此法是一种快速、简单、可靠的方法，对脂肪族硫甙， 变异系数在1 9 - 7 6 之间，表明此法的重复性很好。同时s z m i g i e l s k a 研究了膜萃取 h p l c 法中膜的最佳实验条件，包括萃取时间、膜面积大小、样品量和硫甙回收率最大 时的优化条件等。结果显示，用此法测定黑芥子甙的回收率达到8 0 。分析测定黄芥子、 褐芥子、东方芥子及印度芥子的硫甙含量，均得到很好的重复性。 i 3 3 1 0 使用酶联免疫吸附( e l i s a ) 测定硫甙 v a n i 弘i 使用e l i s a 测定硫甙，适合分析大批量硫甙样品。先用磷酸溶液从样品中萃取 硫甙，其中黑芥子甙和2 羟基3 丁烯基硫甙在此过程中是稳定的。使用抗浆液防止丁二酸 赫与硫甙聚合，它再e l i s a 分析中是特殊的反应物。e l i s a 淤 定结果显示了与其他脂肪族 硫甙的交叉反应率最大为7 4 ，并且硫甙含量在n m o l l 至l j u m o l l 的范围内对数值呈线性。 1 3 3 1 1 分析方法的局限性 硫甙分析方法经过几十年的研发和完善，已经形成各具特色的多种方法。在硫甙的分 9 第一章前言 析中发挥了非常重要的作用。但遗憾的是这些方法往往都需要硫甙的标准品，而这些标准 品在国内外市场上很难得到( 黑芥子甙除外) ，因此使这些方法的普及带来了一定的困难。 而这些方法与质谱的联用技术能够弥补硫甙标准品不容易获得的不足，或许是硫甙定性定 量分析的最理想的方法。硫甙的分析技术在不停地发展和提高，新的方法还会出现，使分 析测定更为简便和准确。 1 4 部分十字花科中硫甙含量 通常一种十字花科植物中含有一种以上的硫甙，这些硫甙在根、叶、种子中含量各异， 除吲哚3 甲基硫甙、n 一甲氧基吲哚3 甲基硫甙外，一般硫甙在种子中含量最高口- q 。一种 植物中常含有类型相同的数种硫甙，在这些硫甙中又有3 、4 种含量较为丰富。 产于英国的白色甘蓝总硫甙含量比美国报导的含量高，黑芥子甙( s i n i g r i n ) 和3 一甲基硫 氧丙基硫甙( g l u c o i b e m ) 以及吲哚类硫甙的含量也高于美国同类甘蓝。原因可能是品种、 栽培季节、取样时问不一致。不同品种优势硫甙种类也有很大不同。g l u c o i b e r i n 和黑芥 子甙在一些甘蓝中占优势，紫甘蓝中4 一甲基硫氧丁基硫甙( g l u c o r a p h a n i n ) 含量较丰富，羽 衣甘蓝( k a l e ) 中优势硫甙为芸薹葡糖硫甙( g l u c o b r a s s i c i n ) 、黑芥子甙。羽衣甘蓝中硫甙含量 比散叶甘蓝( c o l l a r d ) 含量高，特别是2 羟基一3 一丁烯基硫甙( p r o g o i t r i n ) 。g l u c o b r a s s i c i n 和s i n i g r i n 是饲料用羽衣甘蓝中的优势硫甙。羽衣甘蓝中硫甙含量的交化范围比芸薹属其 它植物中硫甙含量的变化范围大，可能是将不同起源的几个栽培种归入羽衣甘蓝的缘故。 c a r l s o n 等对6 个青花菜栽培种硫甙含量进行调查发现，o l u c o r a p h a n i n 和g l u c o i b e r i n 是其 中的优势硫甙，并首次报导了花球中存在4 甲硫基丁基硫甙( g l u c o e r u c i n ) 。同绿花球品种 相比。紫花球品种中g l u e o r a p h a n i n 和s i n i 【g r i n 含量较少。芜菁中主要硫甙为3 丁烯基硫 甙( g l u c o n a p i n ) 芹1 4 - 戊烯基硫甙( g l u c o b r 鹋s i c a n a p i n ) ，总硫甙含量比甘蓝中稍高1 2 8 d 3 1 。 遗传学因素影响单一硫甙和总硫甙含量，不同科之恻硫甙分布有很大差异。含硫甙的 植物在不同发育阶段硫甙含量有很大的变化。尤其是在生长发育的早期，或抽薹阶段硫甙 含量变化更大。抽薹阶段，一般吲哚基硫甙含量增加。在营养生长阶段，从种子发芽到花 1 0 第一章前言 芽出现。硫甙含量逐渐降低，茎中变化幅度比叶中高，花和种子形成过程中，这种变化趋 势更加明显。油菜花中硫甙含量比营养组织含量高。花芽由绿向黄色转变，到最后开花这 一过程中硫甙含量不断增加【3 4 - 3 s l 。 硫甙含量还受其他因素影响。土壤环境差异能够影响油菜种子中硫甙含量，短期低温 或持续低温时小萝卜中s c n 含量增加，栽种于有机土壤小萝卜硫氰酸酯的含量与日平均 气温相关，降水丰富的壤土，小萝卜中硫氰酸酯含量商。气温降低、光照时触短、光照强 度低、空气湿度大、霜冻等都会使硫甙含量降低 3 9 - 4 | l 。 在栽培过程中，植株密度也能影响硫甙含量。采用较小株行距( 4 5 c m x 7 5 c m ) 时，能 够提高甘蓝硫甙含量。但提高栽培密度，对油菜籽中硫甙含量影响并不显著h 2 l 。 病虫害能显著影响硫甙含量。芜菁根形成早期，如果植株感染t u m v ( 芜箐花叶病毒) 则总硫甙吉量增加，p r o g o i t r i n 增加量受根生长及病毒感染时期的综合影响即j 。芜菁甘蓝 受到跳甲危害时，油菜中吲哚类硫甙含量增加。受病虫危害时硫甙含量增加的机制还不清 楚，是否是植株在瘸虫害下一种自我保护反应，还是异常代谢过程中硫甙作为一种副产物 生成还有待研究。 1 5 硫代葡萄糖甙生物功能 辣根、山嵛菜、芝麻菜、萝卜等许多含硫甙植物被用作油料、蔬菜、饲料、调料或药 物，另外，甘蓝和芥菜就被用作伤疮膏和抗癌抗菌剡，海甘蓝和甘蓝型油菜等被用作生产 高价值化学品i “1 等。这些植物的生物功能被广泛地认为与其含有的硫甙组分有关。 1 5 1 风味作用 一些硫甙降解产物具有一定气味，如甲基硫代烷基硫甙降解产生挥发性辛辣味的异硫 氰酸盐。甲基亚硫酰烷基硫甙产生不易挥发性风味温和的异硫氰酸盐。芥菜和山葵的特殊 辛辣味就与烯丙基异硫氰酸赫有关，芽甘蓝以及其它芸薹属蔬菜的苦味与2 烯丙基硫甙 和顺2 羟基3 丁烯基硫甙相关【4 5 1 。 l i 第一章前言 1 5 2 杀菌杀虫作用 硫甙降解产物所具有的特殊气味对石蛾、蜗牛和片脚类动物等具有威慑作用，能抵抗 各种各样草食动物鳓，如油菜田中鼻涕虫和鸽子的数量就很少。硫甙被广泛认为是一种 有效天然杀虫剂。另外，一些硫甙降解产物异硫氰酸酯被发现具有抑制植物性细菌和真菌 的活性【4 7 1 ，其杀线虫活性已被证明。 1 5 3 诱虫作用 硫甙降解产物所具有的特殊气味除了具有杀虫、杀菌作用外，此特殊气味又是一部分 昆虫识别寄住植物的一个工具，是它们摄取食物和产卵的强有力刺激剂，像小菜蛾、种子 象鼻虫、跳甲等不仅喜食十字花科植物，并且在此类植物上进行产卵h 引。 i 5 4 致甲状腺肿和其它抗营养作用 一些研究发现有些硫甙的降解产物对高等动物具有毒性和抗营养作用，像侧链含1 3 一 羟基的脂肪族硫甙( 如顺2 羟基3 丁烯基硫甙和反2 羟基3 丁烯基硫甙) 降解产物硫氰 酸盐和嚷唑烷硫酮有致甲状腺肿作用4 9 】。除了致甲状腺肿的不利影响外，硫甙降解产物 还具有其它毒害作用，包括胚胎中毒、生长发育阻碍，如吲哚族硫甙降解产物吲哚3 甲 醇和吲哚3 乙腈在腈类化合物存在条件下发生硝基化而形成能够诱导有机体突变的含氮 亚硝基化合物。另外。吲哚3 甲醇在胃酸性环境罩自然地形成一种化合物，此化合物结 构、毒性和致癌性类似于2 , 3 ，7 ，8 四氯二苯p 二氧杂芭化合物5 0 1 。 因为硫甙降解产物对家畜有致甲状腺肿作用，所以芸薹属饲料和油菜籽饼的使用就受 到了限制。为避免油菜籽致甲状腺肿的危害，人们做了很多努力，包括2 0 世纪7 0 年代培 育出含低硫甙低芥子酸的油菜品种和饲科中添加碘等措施【s i ) 。现在关于此领域的研究仍 在大量进行。 过去人们怀疑一些硫甙降解产物可能会引起人体癌症发生。理论上讲，硫甙降解产物 也能够诱导人体甲状腺肿作用，但是流行瘸学几乎没有任何相关证据。人体试验表明。志 1 2 第一章前言 愿者每天食用1 5 0 克芽甘蓝后并没有影响他们甲状腺激素水平，推测可能是烹饪使黑芥予 酶失活