（农产品加工及贮藏工程专业论文）密花石斛和景洪石斛离体克隆体系建立及稀土元素对根再生作用研究.pdf

摘要 药用石斛是珍稀的中草药资源，具有抗白内障、防止血管硬化、清音利咽和 生津益胃等的药效，药用历史悠久。然而，由于人为因素及环境因素等的破坏。 导致其资源频临灭绝。寻求保存野生资源并实现资源再生的有效途径迫在眉睫， 通过植物离体克隆技术获得再生植株是解决这一问题的理想途径之一。为此，本 文主要对密花石斛、景洪石斛两种药用石斛离体克隆体系进行了研究，并考察了 稀土元素对密花石斛根再生作用的影响。 植物激素是对植物的生长发育产生显著的调节作用的生理活性物质。本实验 以m s 为基本培养基，研究了植物激素t b a 、n a a 、i a a 、b a 和k t 及其组合在 密花石斛、景洪石斛的类原球茎( p l b s ) 诱导、茎再生和根再生的过程中的影响。 结果表明：两种石斛在光照( ( 温度( 2 5 土1 ) 、每天光照1 6 h ，光照强度2 0 0 0 i x ) 和暗培养( 温度( 2 5 士1 ) ) 条件下均能诱导出类原球茎。其中光照培养条件下， 诱导密花石斛茎段外植体形成类原球茎的最佳激素组合是1 0m e , mi b a + 2 0m e d l b a ，诱导率达到8 0 4 ；而景洪石斛在1 0m g li b a + 5 0m g lb a 激素组合下诱 导率达到最高，为8 5 7 。暗培养条件下密花石斛和景洪石斛的最佳激素组合分别 是1 0m g li b a + 2 0m g lb a ，2 0m g li b a + 5 0m g lb a ，诱导率分别为7 6 9 ， 7 9 。4 。 以两种石斛的茎段为外植体，光照条件下，诱导茎的再生，结果表明茎的再 生方式分为直接发生( 外植体上直接诱导成茎) 和间接发生( 外植体上先形成p l b s ， 再由p l b s 再生茎) 两种。直接发生方式中。两种石斛在0 5 m 玑i b a 、2 0 m g 咒b a 和1 0m g l n a a + 2 0m g m b a 的条件下，茎的诱导频率较高，分别为7 0 8 、8 0 o ， 8 4 3 。间接发生方式诱导密花石斛、景洪石斛的茎再生最佳激素组合分别为0 5 m 舡i b a + ( 1 o 2 0 ) m g mb a 、2 0m 叽i b a 、2 0m 扎b a ，0 , 5m g li b a + 20 m 彰l k t 、1 0 m g ，l i b a + 1 0 m g l k t ，再生率均达到1 0 0 o 。 试验发现，添加马铃薯水提液对基本培养基促进根再生的效果不明显，且m s 基本培养基比1 2 m s 更有利于诱导根再生。i b a 对两种石斛根再生的诱导作用效 果优于n a a 、i a a ，当其浓度为5 0m g 几、0 1m g l 时再生率分别为6 6 4 ( 密 花石斛) 、6 6 0 ( 景洪石斛) 。试验结果亦表明，0 5 的活性炭对两种石斛根再生 均有利，当其与植物激素的共同作用时对生根的诱导效果更明显。 稀土元素不是生物体的必需元素，但是它在植物体内表现出的生物效应具有 重要的应用价值。本试验对其促进密花石斛试管苗根再生的生物效应进行了研究。 结果表明，与稀土元素镧( l a ”) 、铈( c e 3 + ) 比较，钕( n d 3 + ) 最有利于密花石 斛试管苗的根再生( 4 0m 班的n d 3 + 对应的再生率为1 0 0 0 ，每苗根数达到2 3 9 ) 。 稀土元素与激素的组合比单独使用稀土元素的效果差。 关键词：密花石斛景洪石斛类原球茎茎再生根再生植物激素稀土元素 a b s t r a c t m e d i c i n a ld e n d r o b i u mi sak i n do fr a r ep r e c i o u sc h i n e s eh e r bw i t hl o n gh i s t o r y , w h i c hi sa c t i v ea g a i n s tm a n yd i s e a s e s ，e s p e c i a l l yc a t a r a c t ，t h r o a ti n f l a m m a t i o n , p e n 。p h e r a lv a s c u l a ro b s t r u c t i o na n dc h r o n i cs u p e r f i c i a lg a s t r i t i s h o w e v e r ，i th a sf a l l e n i n t os e r i o u sd a n g e ro fe x t i n c t i o nb e c a u s eo fi t se x c e s s i v ec o l l e c t i o nf o rg r o w i n g m e d i c i n a ld e m a n d s t e c h n o l o g yo fc l o n a lp r o p a g a t i o ni nv i t r oi so n eo ft h em o s t e f f e c t i v em e a n st oi m p r o v ei t i n t h i sp a p e r , e s t a b l i s h m e n to ft h ec l o n es y s t e mo f d e n d r o b i u md e n s i f l o r u ma n dd e n d r o b i u me x i l ei nv i t r oa n de f f e c to f r a r ee a r t he l e m e n t s f r e e ) o nr o o t sr e g e n e r a t i o no fd d e n s 护o r u mh a v eb e e ns t u d i e d p l a n th o r m o n ei sak i n do f p h y s i o l o g i c a la c t i v i t ys u b s t a n c ea d j u s t i n gp l a n tg r o w t h e f f e c t i v e l y e 能c t so fp l a n th o r m o n e s ( i b a ，n a a ，i a a ，b aa n dk t ) o np l b s i n d u c e m e n t s t e m sa n dr o o t sr e g e n e r a t i o no fd d e n s i f l o r u ma n dne x i l ew e r es m d i e d p l b sc o u l db ei n d u c e df r o ms t e m - s e g m e n tb o t hi nl i g h ta n dd a r ka tat e m p e r a t u r eo f 2 5 士1 ，1 6hp h o t o p e r i o d so f2 0 0 0i xi n t e n s i t yo fi l l u m i n a t i o n i nl i g h t ，t h eo p t i m a l h o r m o n ec o m b i n a t i o n so fi n d u c i n gp l b sf r o ms t e m - s e g m e n to fd d e n s i f l o r u mi s1 o m g li b a + 2 0m g ，lb a ，t h em a x i m u mi n d u c e m e n tr a t i oi s8 0 4 ，a n df o rd e x i e ，i s 1 0m g 几i b a + 5 0m g lb a ，r e a c h e d8 5 ，7 i nd a r k ，t h em o s to p t i m a lc o m b i n a t i o n s a r e1 0m 舡i b a + 2 0m g 几b a ( dd e n s 咿o r u m ) ，2 0m 肌m a 十5 0m g lb a ( n e x i l e ) ，a n dt h ei n d u c e m e n tr a t i o sa e7 6 9 a n d7 9 4 ，r e s p e c t i v e l y t w om o d e s ，d i r e c ts t e m sr e g e n e r a t i o nw h i c hm e a n st h es t e m sr e g e n e r a t e df r o m t h es t e m - s e g m e n td i r e c t l ya n di n d i r e c ts t e m sr e g e n e r a t i o nw h i c hm e a n st h es t e m s r e g e n e r a t e dv i ap l b si n d u c e df r o mt h es t e m s e g m e n ti l ll i g h t ，w e r eo b s e r v e di nt h i s r e s e a r c h i nt h ef o r m e rm o d e ，u n d e rt h ec o m b i n a t i o n s ，o 5m 驰i b a 、2 0m g lb aa n d 1 0m g ln a a + 2 0m g 几b a ，t h ec o r r e s p o n d i n gm a x i m u mi n d u c t i o nr a t i oi s7 0 8 、 8 0 o ，8 4 3 i nt h el a t t e ro n e ，t h em o s to p t i m a lc o m b i n a t i o n sa r e0 5m 璺见1 3 3 a + ( 1 o 2 o ) m g l b a 、2 ，o m g 几i b a 、2 0 m g 几b a ；0 5m g 几i b a + 2 m g l k t 、10 m g 兄i b a + i ，o m g lk t , a n da l lo f t h em a x i m u mr e g e n e r a t i o nr a t i oi s1 0 0 o e f f e c to fm so r1 2 m sm e d i u ms u p p l e m e n t e dw i t hp o t a t ow a t e ro nr o o t s r e g e n e r a t i o ni so b v i o u s t h eo p t i m a lb a s i cm e d i u mt y p eo fi n d u c i n gr e g e n e r a t e dr o o t s f r o mdd e n s 猡o r u ma n dd e x i ei sm sm e d i u r n t h eo p t i m a lh o r m o n ei sm a w h i c hi s m o r ee f f e c t i v et h a nn a a 、i a aa n dt h em a x i m u mr e g e n e r a t i o nr a t i oi s6 6 4 r n d e n s i f l o r u m ) a n d6 6 o ( d e x i l e ) a d d i n ga d d i t i o n a lo 5 a c t i v a t e dc h a r c o a l ( a c la n d p l a n th o r m o n ei nm sm e d i u m ，t h er o o tr e g e n e r a t i o nr a t i oi sm u c hh j 【g h e rt h a nt h a to n a cu s e di n d e p e n d e n t l y r a r ee a r t he l e m e n t s ( r e e ) h a v ei m p o r t a n tb i o l o g i c a le f f e c te “v - e nt h o u g ht h e ya r e n o tt h ee s s e n t i a ld e m e n t sf o r 也eo r g a n i s m t h ee f f e c to fl a 誓c e 3 + a n dn d s + o n i n d u c i n gr o o t sr e g e n e r a t i o no ft h et u b ep l a n t sf r o md - d e n s i f l o r u mw a ss t u d i e d t h e r e s u l ts h o w e dt h eo p t i m a lr e eo fi n d u c i n g r o o t r e g e n e r a t i o n i sn d ”，a n dt h e r e g e n e r a t i o nr a t i oo fr o o t si s1 0 0 o a n dt h em e a nn u m b e ro fr e g e n e r a t e dr o o t sf r o m p e rs e e d l i n gi s2 3 9u n d e rn d 3 + o f4 0m g lt h ee f f e c to fc o m b i n a t i o n so fr e ea n d p l a n th o r m o n eo n i n d u c i n gr e g e n a t e d r o o t si sw o r s et h a nt h a to fr e eu s e d i n d e p e n d e n t l y k e y w o r d s ： m e d i c i n a ld e n d r o b i u m ；p l b s i n d u c t i o n ； s t e mr e g e n e r a t i o n ； r o o tr e g e n e r a t i o n ；p l a n th o r m o n e ； r a r ee a r t he l e m e n t ( r e e ) 插图清单 图1 1 植物离体克隆程序示意图 图1 - 2 石斛离体克隆一般程序 图2 - 1 激素组合对密花石斛的茎段形成p l b s 数量上的最佳作用效果 图2 2 激素组合对密花石斛p l b s 诱导率影响的最佳效果 图2 - 3 激素组合对密花石斛的茎段形成p l b s 数量上的最佳作用效果 图2 - 4 激素组合对景洪石斛p l b s 诱导率影响的最佳效果 图版1 图版2 图4 图版3 图版4 密花石斛和景洪石斛的类原球茎诱导及植株再生 密花石斛和景洪石斛的茎再生 i b a 与i a a 的极性运输 密花石斛和景洪石斛根再生的诱导， 密花石斛报再生的诱导 j 侈 加 扒 挖 凹 弘 粥 轮 表格清单 表1 1 中国药用石斛资源的主要品种与分布 表2 - 1密花石斛光照培养和暗培养条件下类原球茎的诱导 表2 - 2景洪石斛光照培养和暗培养条件下类原球茎的诱导 表3 - 1 表3 2 表3 3 表4 1 表4 2 表5 密花石斛和景洪石斛茎再生两种方法的比较 激素对密花石斛和景洪石斛茎段直接诱导茎的再率的影响 激素对密花石斛和景洪石斛类原球茎诱导茎的再生率的影响 密花石斛和景洪石斛根再生的诱导结果 活性炭( a c ) 对密花石斛和景洪石斛根再生的影响 稀土元素与i b a 组合对密花石斛再生根诱导频率的影响 “ 斟 嬲 钉 ” 弘 锯 独创性声明 本人声明所里交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据 我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的 研究成果，也不包含为获得佥目b 王些盔堂或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。 与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：考钨 签字日期：勿衫r 年f 月编 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解盒胆王些太堂有关保留、使用学位论文的规定，有权保留 并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权金 目s 互些盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、 缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名为 签字日期：如彩r 年石月肜日 学位论文作者毕业后去向 工作单位； 通讯地址 导师签名 呵建 签字目期：。0 6 年b 月j 日 电话 邮编 致谢 本论文是在我的导师罗建平教授的悉心指导下完成的，从论文的选题到实验 方案的制定、论文的修改完稿，都得到了罗老师无微不至的关怀和帮助，罗老师 严谨求实的治学作风、对科学的执着追求以及对人生的深刻理解，使我受益匪浅。 在此向罗老师致以最诚挚的谢意和崇高的敬意! 本课题论文的完成是对我三年研究生所学知识和技能的一个大总结，更是对 以前知识的巩固和提升，不仅使我的动手能力得到了很大提高，也使我的创新思 维得到了很好发展。感谢校、院系领导和实验室老师为我们营造了一个的浓厚的 学术氛围和良好的实验环境，为我们今后的工作和学习打下了坚实的基础。 感谢查学强、王瑛老师、潘丽华老师、罗水忠老师、魏明、陈小燕老师给了 我许多指导和帮助。同时还得到了实验室各位同学自始至终的真诚指导和帮助。 他们的帮助和支持使我的论文得以顺利完成，这里谨向他们致以最衷心的感谢! 三年的研究生生活即将结束，这三年将是我人生最宝贵的财富，再次感谢所 有关心和帮助我的领导、师长、同学及朋友们! 作者： 日期 第一章绪论 1 1 石斛的资源现状及市场需求 1 1 1 石斛的生长发育特征及生物环境要求 石斛为兰科( o r c h i d a c e a e ) 石斛属( d e n d r o b i u ms w ) 植物。为多年生附生性草本 植物，常附生于密林树干或岩石上，并与苔藓植物伴生i l j 。石斛的根一部分固着于 附主，起固定和支持作用，同时吸取附主的水分和养料；另一部分根裸露在空气 中，吸取空气中的水分。石斛属植物与附主虽然不是寄生关系，但附主不仅与石 斛属植物的生长发育相关，而且对石斛中所含的化学物质有定影响，如在杏树、 梨树等多种植物上栽植石斛，发现其有效成分石斛碱的含量，均比在石缝间野生 的石斛含量为低。 野生石斛分为种子繁殖和营养繁殖【3 1 。在石斛果实中，含有上万粒细小种子， 随风飞扬，散落在适宜的附主树权上或石缝间，则可萌发成苗。一般生长3 年后 开花。植株不断产生萌蘖，茎的基部或茎节在接触地面时或在适宜的条件下，均 能产生不定根而形成新的个体。植株于花后落叶，但一般不萌发新叶而于茎基萌 发新枝。花于茎顶或侧枝单生或排成总状花序。植株下部的花发育较早而首先开 放。花期2 0 3 0d ，但花序顶端的约有5 1 0 发育不正常，还有许多种石斛只 开花不结果，而仅以营养繁殖。野生石斛繁殖很慢，自然更新能力很差。石斛的 生长发育规律大致为 4 】：每年春末或夏初期间，在2 年生的茎上部的节上抽出花序， 开花后从茎基长出新并发育成新茎，老茎则逐渐皱缩，不再开花。秋季新茎渐趋 成熟，生长减慢，并在凉爽较干燥的气候中进入休眠期，以利于越冬花的形成。 花期4 6 月，果期6 8 月。 石斛喜温暖、湿润及阴凉的环境，生长期年平均温度在1 8 2 l ，1 月份平均 气温在8 c 以上，无霜期2 5 0 3 0 0d ；年降雨量1 0 0 01 1 1 i 以上，生长处的空气相 对湿度以8 0 以上为适宜【3 j 。以在半阴半阳的地方，附生于布满苔藓植物的山岩石 缝或多槽皮松的树上的石斛质量为佳。例如f 5 7 】，石斛主产区重庆合江县的石斛， 主要产于海拔4 0 0 8 0 0i i l 范围内，年平均气温1 8 。2 ，年降雨量1 0 5 0m m ，相对 湿度8 2 ，其生长地的地势，一般都是在比较低限落槽处，大多比较阴湿郁热， 附生树以黄桷树并生有苔藓植物者为好；贵州赤水、兴义、安龙、罗甸等地的石 斛，主要产于海拔6 0 0 1 3 0 0 m 范围内，年平均气温1 4 1 9 c ，年降雨量1 1 0 0 1 5 0 0m i i l ，相对湿度8 0 8 5 ，其多生长在温暖、阴湿、富含疏松肥沃的沙砾土 壤或腐殖质土的石灰岩缝中，以及黄桷、青杠、香樟及槲栎等树上。在光照太强 或过弱、气温过高或太低、土质贫瘠或保水性差的环境下生长不良。 1 1 2 石斛的资源现状 全世界兰科约有5 0 0 属，1 5 0 0 0 多种；石斛属是兰科中最大的属之一哆j 。我国兰 科约有1 5 0 属，1 0 0 0 种，主要分布于秦岭和长江流域及其以南各省区。石斛属植物大 多数种类都集中分布在北纬1 5 。3 0 2 5 。1 2 ，且越向北延伸而种类则逐渐减少。其最 北界不超过北纬3 4 。2 4 ，现仅发现1 种石斛( d e n d r o b i u mh a n c o c k i i ) 的分布北界，达 到了陕西省的宁陕、山阳县和甘肃省的徽县 9 】。我国药用石斛的原植物主要来源 于兰科石斛属植物，其次有的地区尚将金石斛属( e p h e r n e r a n t h a ) 、石仙桃属 ( p h o l i d o t al i n d l ) 、石豆兰属( b u l b o p h y l l u mt h o u ) 的部分植物作石斛用川。 全国石斛属植物有7 4 种2 变种，包雪声【12 】主编的中国药用石斛彩色图谱报道 了药用石斛5 1 种。周荣汉【5 1 在其主编的中药资源学称：“石斛属植物以云南所 有的种为最多，共计3 9 种，其次为贵州和广东，各有2 8 种，再次是广西，有2 4 种，台湾省虽然面积较小，但由于它具有复杂的地形和气候，使本属植物能得到 适宜的环境，产1 5 种。”药用石斛的品种和分布非常复杂，表1 1 对我国常见的石 斛药用资源的分类、主要品种与分布作了总结【l 。1 ”。 1 2 石斛的药用价值 l - 2 1 石斛的药用历史 石斛药用始载于神农本草经( 1 ”，列为上品，称其“主伤中，除痹，下气，补五脏， 虚劳赢瘦，强阴。久服厚肠胃，轻身，延年。生山谷、水旁石上”。其后，历代诸家本 草均予录述。例如，本草纲目云：石斛“逐皮肤邪热瘴气，腰膝冷痛痹弱”。陶 弘景谓：“今用石斛出始兴，生石上，细实，桑灰汤沃之，色如金，形似蚱蜢髀者 为佳。近道亦有，次于宣城俗方最以补虚，疗脚膝。今荆襄及汉中江左又 有二种：一者似大麦( 即指麦斛) ，累累相连，头生一叶而性冷：一种大如雀髀， 名雀髀斛，生酒渍服，乃言胜干者，亦如麦斛叶在茎端，其余斛如竹，节间生叶 也。”由此可见，石斛在古代应用时则种类复杂，自唐代或唐代以前就有如麦斛与 雀髀之类混用品m2 9 】。在应用上，唐代甄权的药性论进一步指出：石斛能 “益气除热，主治男子腰肢软弱，健阳，逐皮肌风痹，骨中久冷虚损，补肾，积精， 腰痛，养肾气，益力”。 自宋代开始，石斛的临床应用则逐渐扩大，除广泛应用于肾阴虚诸症外，还 广泛用于胃中有热诸症的治疗。宋代寇宗爽【1 6 ) 的本草衍义则对石斛的形态、 真伪、辨识及新的功用作了明确论述：石斛“细若小草，长三四寸，柔韧，折之如 肉而实。今人多以木斛浑行，医工亦不能明辨。世又谓之金钗石斛，盖后人取象 而言之，然甚不经。将木斛折之，中虚如禾苗，长尺余，但色深黄光泽而已。真 石斛治胃中虚热有功，用除脾胃之火，去嘈杂善饥及营中蕴热，其性轻清和缓， 有从容分解之妙，故能退火，养阴，除烦，清肺下气，亦止消渴热汗”。更加明确 地概括了石斛的功效特点。李时珍1 1 4 的本草纲目对石斛的功效也有其识见：“石 斛气平，味甘、淡、微咸，阴中之阳，降也。乃足太阴脾、足少阴右肾之药。深 师云：囊湿精少，小便余沥者，宜加之。法：每以二钱入生姜一片，水煎代茶 饮，甚清肺补脾也。”清代赵学敏【1 7 】的本草纲目拾遗也谓其“清胃除虚热，生 津，已劳损，以之代茶，开胃健脾”。至今，石斛仍为中医常用的滋阴清肺、生津 止渴、养胃除烦要药，并认为鲜石斛清热之力过于滋阴，干石斛滋阴之力过于清 热之力。 1 2 2 石斛的药理作用 石斛中主要含有多种生物碱和多糖眦1 9 】。生物碱约0 3 ，已鉴定结构的有： 石斛碱( d e n d r o b i n e ) ，石斛胺( 6 一羟基石斛碱，d e n d r a m i n e ) ，石斛次碱( n o b i l o n i n e ) ， 石斛星碱( 石斛醚碱，d e n d r o x i n e ) ，石斛因碱( d e n d r i n ) ，6 羟基石斛星碱 ( 6 - h y d r o x y d e n d r o x i n e ) ，石斛宁碱( s h i h u n i n ) ，石斛宁定( s h i h u n i d i n e ) ，以及季胺盐 n 一甲基石斛碱( n - m e t h y l d e n d r o b i u m ) ，8 - 表石斛碱( 8 一e p i d e n d r o b i n e ) 等。近年来对 2 5 种石斛3 6 个样品的多糖含量测定结果表明【2 0 1 ，传统认为质重、嚼之粘牙、昧甘、 无渣者优品，其多糖含量较高，加工品“枫斗”的多糖含量最高。从铁皮石斛分离到 3 种多糖【1 8 】：黑节草多糖i ，它们为一类0 乙酰葡萄甘露聚糖，从兜唇石斛 的茎中提取分离到了3 种多糖：a p l a p 3 ，a p 为类含d 葡萄甘露糖，具有免 疫增强作用。其它石斛中也含有一定的多糖，其多糖含量与它的生理活性的强弱 有一定的关系，多糖可以调节免疫功能，防治动脉粥样硬化作用，抗肿瘤，降血 糖，降血脂，抗衰老等等。此外，尚含氨基酸、黏液质及淀粉等，鲜石斛茎含挥发 油，其中二萜化合物外诺醇( m a n 0 0 1 ) 占5 0 以上【z “。 石斛的药理作用可以总结如下： 1 解热作用：金钗石斛合剂对于某些炎症，如唇疔、疗疮等具有明显疗效】。 2 对消化系统的作用：石斛煎剂口服，能促进胃液的分泌而助消化，对正常 人的胃排空无增强或减弱作用，但至肠道则使其蠕动亢进而通便l 。 3 扩张血管作用：石斛具有明显的拮抗由苯肾上腺素和5 羟色胺所致的大鼠 肠系膜动脉血管的收缩作用【2 4 】。 4 对免疫功能的影响：石斛能促进小鼠溶血空斑数增加，并能促使环磷酰胺 所致白细胞减少的回升，具有一定增强免疫功能的作用田1 。 5 对白内障的作用：石斛对大鼠半乳糖性白内障有预防和治疗作用，发现石 斛对半乳糖性白内障不仅有延缓作用，其保持透明晶状体的百分率达3 6 8 0 1 2 4 1 。 6 其他作用：石斛碱可引起豚鼠及家兔的中度血糖升高。大剂量可抑制家兔 心脏，降低血压，抑制呼吸，并引起离体豚鼠子宫收缩。对猫血压有类似毒蕈碱 样作用及烟碱样兴奋作用。石斛煎剂对孤儿病毒e c h d l1 所致的细胞病变有延缓 作用。石斛还能明显改善甲亢阴虚小鼠的虚弱症状，能保护阴虚小鼠免于死亡【2 。 1 2 3 石斛的市场需求 目前石斛商品仍然主要来源于野生资源1 7 】。所以石斛的市场收购量一直受自然 灾害等因素的影响，曾出现过几次大的起伏。例如，石斛主产区广西1 9 5 7 年收购 4 1 7 万k g ，而1 9 6 0 年降为仅o 5 万k g ：以后逐年回升1 9 6 6 年高达8 0 万蚝，其 后又下降，1 9 6 8 年则降为约5 万k g ；1 9 7 5 年又回升到3 4 - 3 万k g ，但到1 9 7 9 年却 降到建国后石斛收购的最低点o 3 9 万k g 【l “。其后，由于石斛资源不仅受到自然 灾害的破坏，还遭到人为滥采滥挖，野生资源急剧减少，而其用药需求量却日益 增大【9 】。石斛不但在国内中医临床配方用药量上不断增加，而且在出1 ：3 外销和中成 药工业原料等需求上更是大有缺口。如霍山石斛、金钗石斛、铁皮石斛、黄草石 斛早在国际市场享有盛誉；广西的“石斛精”，贵州的“口香液”，特别是江苏南京金 陵制药的“脉络宁”注射液，以及传统中成药如石斛夜光丸等都需大量的石斛。据全 国中药资源普查统计，石斛年需量为8 0 万1 0 0 万蚝，现在其需求量还在不断地 上升1 1 髓“】。但是石斛野生后备资源已临濒危：因此不断改进和提高药用石斛离体 克隆技术更进一步提高其质量与增加产量已迫在眉睫。 1 3 离体克隆体系的理论基础 克隆( c l o n e ) 源于希腊文k l o n ，原意是指幼苗或嫩枝以无性繁殖或者营养繁 殖方式培养的植物。随着时间的推移，克隆的内涵已经扩大，只要是由1 个细胞 获得2 个以上的细胞、细胞群或生物体，由一个亲本序列产生的d n a 序列，就是 克隆；由此分化所得到的细胞、生物体就是克隆细胞、克隆体。准确地说，克隆 是指生物体通过体细胞进行无性繁殖，以及由无性繁殖形成基因型完全相同的后 代个体组成的种群。 植物离体克隆的理论基础建立在植物细胞全能性的概念上。植物细胞全能性 是指植物细胞具有该植物全部遗传的可能性，在一定的条件下如同受精卵一样， 具有发育成为完整植物体的潜在能力。植物细胞的全能性包括两方面的含义：一 是植物细胞，无论是体细胞还是生殖细胞，都具有该物种全部的遗传信息；另外 一层含义是每个植物细胞具有发育成完整植株的潜在能力。早在1 8 3 9 年，细胞学 家施旺( s c h w a r m ) 在他发表的细胞学说中，就曾这样说过口6 1 ：“每个细胞应该可 以独立生活和发展，假如具有的条件正如它存在于有机体内一样。”1 9 0 2 年，德 国著名植物学家哈伯兰特( h a b e f l a n d t ) 根据这个学说的理论，预言离体细胞在生 理上、发育上具有潜在的“全能性”【25 1 。他这一预言阐明了一个理论：植物体内所 4 有活的细胞都有在离体条件下，可以逐步失去原有的分化状态，转变为具有分化 能力的胚胎细胞，增殖而分化成完整植株的潜在能力。 1 9 3 7 年美国科学家怀特( w h i t e ) 首先研制出了化学成分为已知化合物的培养 基配方，该培养基能促使细胞全能性体现i 2 ”。他还发现了b 族维生素对培养离体 根的生长具有重要意义，并认识到吲哚一3 乙酸( i a a ) 在植物生长中的调控作用。 同时，怀特和法国植物学家高斯雷特( g a u t h e r e t ) 等人经过研究，第一次成功地 用烟草的茎段形成层细胞和胡萝b 根的小块组织，在人工培养的条件下，使细胞 增殖和诱导形成愈伤组织【2 ”。1 9 4 8 年，我国植物生理学家崔激和美国科学家斯柯 格( s k o o g ) 合作，利用植物激素处理培养的组织块，诱导培养获得了根、器官， 从此，揭开了离体培养中的细胞能发生器官的奥秘【2 7 1 。1 9 5 8 年，美国植物学家斯 蒂瓦特( s t e w a r d ) 等人用液体悬浮培养法把胡萝b 的体细胞经胚状体( 即体细胞 胚胎发生) 的发育途径，终于得到了完整植株，且能开花结实，使哈伯兰特在5 0 年前的预言，即植物细胞的全能性得到了证实1 2 6 】。 植物的全部细胞，都是从受精卵的分裂分化产生的，受精卵具有某神植物所 持有的全套遗传信息，所以，植物体内每个细胞都具有完整的、完全相同的d n a 序列和一定的细胞环境( 2 “。但植物体内确实存在着各种不同形态、结构和功能的 细胞，这是因为受到所在具体器官或组织环境的束缚，在一定条件下，仅表现一 定的形态、结构和功能而已，实际上，这些细胞的遗传潜力并未丧失，全部遗传 信息仍保持在每一个细胞的d n a 序列中。当一个细胞离开母体而脱离了原来的器 官和组织的约束，并在一定激素和营养条件作用下，经d n a 上基因的活化、翻译、 转录，输出信息，使细胞又恢复遗传全能性，起着类似于受精卵的功能，表达成 完整植株2 7 2 9 】。 1 4 离体克隆的一般方法与程序 1 4 1 植物离体克隆的一般方法与程序 植物离体克隆的一般方法分为：器官培养、组织培养、胚胎培养、细胞培养 以及原生质体培养等【2 引。其一般程序如图1 - 1 。 1 器官培养包括根、茎、叶、花器官及其原基的培养，其中茎尖培养具有 快速繁殖和去除病毒的优点 2 组织培养包括分生组织、形成层组织、愈伤组织和其他组织的培养。愈 伤组织培养是最常见的培养形式，因为除了一部分器官，如茎尖分生组织、类原 球茎外，其他各种培养形式往往都要经过愈伤组织培养与诱导后才产生植株。 表1 1 中国药用石斛资源的主要品种与分布 t a b l e1 1m a i ns p e c i e sa n dd i s t r i b u t i o no f m e d i c i n a ld e n d r o b i u mi nc h i n a 类别 原植物名与主要别名 分布 金钦石 草、金钗石斛) 东、台湾等地 斛类 矩唇石斛d l i n a w i a n u m ( 金石斛)贵州、广硒、广东、台湾等地 霍山石斛d h u o s h a n e n s e ( 米斛米心石安徽霍山 霍山石 黄花霍石斛d t o s a e n s e ( 黄石斛、黄花石安徽、浙江、福建、台湾、江西、湖 斛类 簇石斛d c a n d i d u m ( 铁皮兰、黑节草) 萎蓑警山( 其他省区产铁皮石斛不归铁皮石斛( 铁皮兰、黑节草) 安徽霍山( 其他省区产铁皮石斛小归 此类，归环草石斛类) 粉花石斛dl o d d i g e s i i ( 小黄草、小环草、 细茎石斛d m o n i l i f o r m e 闸皮兰、细草、 尝鬻躲裟嚣专篇嚣 麒蠢耍留州砌“愀一花铜皮石 重唇石斛d h e r c o g l o s s u m ( 鸡爪兰、中 黄草、细霍斛) 串草石斛d f a l c o n e r if 新竹石斛) 束花石斛dc h r y s a n t h u m ( 大黄草、水打 棒、金兰、马鞭草) 罗河石斛d 1 0 h o h e n s e ( 小黄草、黄竹丫、 中黄草) 钩状石斛d a d u n c u m ( 藤蓝、中黄草、 寄生草、黄草) 海南钩石斛d f a u l h a b e r i a n u m ( 黄草) 黄草石齿瓣石斛dd e v o n i a n u m ( 大黄草、水打 斛类棒、旱马棒) 玫瑰石斛d c r e p i d a t u m ( 大黄草、水打 棒) 疏花石斛d h e n r y i ( 黄草石斛) 密花石斛dd e n s i f l o r b l m ( 大黄草、粗黄 革) 兜唇石斛da p h y l l u m ( 金耳环、黄草) 流苏石斛d f i m b r i a t u m ( 马鞭草、旱马棒、 大黄草) 马鞭石迭鞘石斛d d e n n e a n u m ( 大马鞭草、紫 斛类斑金兰、马棒草) 细叶石斛d h a n c o c k i i ( 黑竹丫草、金钗 花、草石斛) r 东、广西、云南、贵州等地 台湾、广东、广西、浙江、江西、湖 南、云南、贵州等地 广西、广东、贵州、云南、西藏等地 广东、广西、湖南、湖北、贵州、四 川等地 广东、广西、湖南、湖北、贵州、台 湾，江西、浙江等地 台湾、广西等地 广西、贵州、云南、西藏等地 广西、贵州、j 东、四川、云南等地 贵州、广西、云南、福建等地 海南、广东等地 广西、贵州、云南、两藏等地 贵州、云南等地 广西、贵卅i 、云南等地 云南、广东、海南、广西、贵州、西 藏等地 广西、贵州、云南等地 广砥、广东、贵卅f 、四川、云南等地 6 广 贵 湾 川 台 四 川 北 四 湖 南 西 云 广 、地、地 州等肃等 贵藏甘南、西、云西、西、 广东陕州 3 胚胎培养包括原胚和成熟胚培养、胚乳培养、胚珠和子房培养，可用于 研究胚胎发生以及影响胚生长的因素，也是研究生殖生理的有用方法。 4 细胞培养包括单细胞、多细胞和细胞的遗传转化体的培养。它培养单离 的细胞，可诱导再分化，用于取得单细胞无性系，进行突变体的选育。 5 原生质体培养包括原生质体、原生质融合体和原生质体的遗传转化体的 培养。将去壁后裸露的原生质体进行培养，它易于摄取外来的遗传物质、细胞器 以及病毒、细菌等，常应用于体细胞杂交和转基因的研究。 1 4 2 药用石斛离体克隆的一般方法与程序 药用石斛离体克隆可分为种子离体培养萌发试管苗、外植体经器官发生再生 试管苗和诱导形成类原球茎( p r o t o c o r m l i k eb o d i e s ，p l b s ) 再生试管苗等三种途径。 因为类原球茎( p l b s ) 实质上是体细胞胚胎，具有克隆遗传稳定和结构完整的再 生植株的形态发生能力，所以，本实验以类原球茎( p l b s ) 无性繁殖的方法建立 药用石斛离体克隆体系。其一般程序见图1 - 2 1 4 3 影响离体克隆的因素 影响植物离体克隆的因素很多，主要包括( 1 ) 外植体( 2 ) 培养基( 3 ) 植物 生长调节剂( 4 ) 有机添加物( 5 ) 环境因素( 6 ) 稀土元素等。 图1 - 1 植物离体克隆程序示意图 f i g 1 1p r o g r a ms c h e m a t i cp l a no f i nv i t r oc l o n eo f p l a n t s ( 1 ) 外植体用于离体克隆进行无性繁殖的各种植物材料称为外植体 ( e x p l a i n ) 有些外植体需要机械隔离和生理隔离。整株植物中的每个细胞、组织 和器官均受其周围的细胞、相邻的组织、器官的制约。一般情况下，它们只能执 行着自己特定的功能，这种相互制约的关系才使植物体成为一个协调的机体。根 据细胞“全能性”观点，植物体的任何一个已分化的细胞，都保持着发育成完整植物 体的潜在能力，换句话说，保持着分生组织状态的潜势。它之所以不能恢复分裂 能力，回复到分生组织状态，是因为它们处于被制约、被抑制的状态。那么，设 法消除某些抑制物质，势必就能恢复植物细胞的分裂、分化能力j 。植物离体克 隆时的切割，也就是把器官、缎织或细胞从整体植物分离下来，实际上是一种人 为的机械和生理隔离，这种切割使它们脱离整体，消除了制约，也可以说是植物 细胞“全能性”实现的重要措施1 2 9 1 。 娄厘壁茎直隆链丕 试筻苴壹隆住丕 图1 - 2石斛离体克隆一般程序 f i b i - 2 g e n e r a lp r o c e d u r eo f i nv i t r oc l o n eo f d e n d r o b i u m ( 2 ) 培养基培养基是植物离体克隆的基本介质，是细胞生存的环境。培养 基的成分及各成分的含量对植物的生长有很大的影响。培养基的成分大致分为五 类：水、无机营养、有机营养、天然附加物、植物生长物质。目前在植物离体克 隆中有一些广泛使用的标准培养基( 如：m s 、b 5 、n 6 、w 、s h 、k c 等) ，这些 培养基在使用时也需要根据具体情况添加或去除某些有机的或无机的补充物。此 外，还有大量的为了达到某些特定目的而配制的特殊培养基。 ( 3 ) 植物生长调节剂植物生长调节剂在植物离体克隆的实验中起着非常 重要的作用。在许多的实际情况中，仅仅是所使用的植物生长调节剂的数量、浓 度、种类以及它们之间的平衡就使不同的实验设计得以区分开来【3 。j 。常用的植物 生长调节剂包括生长素类。1 一萘乙酸( n a a ) 、吲哚一3 乙酸( i a a ) 、吲哚丁酸 ( i b a ) 、2 ，4 - 二氯苯氧乙酸( 2 , 4 d ) 分裂素类。激动素( k t ) 、6 苄基嘌呤( b a ) 、 玉米素( z t ) 、2 异戊烯基腺嘌呤( z i p ) 其他类。赤霉索( g a ) 、脱落酸( a b a ) 、 乙烯等。 ( 4 ) 有机添加物有机添加物主要包括糖、氨基酸、维生素和一些天然的有 机物( 如：椰子乳、马铃薯提取物、酵母提取物、玉米胚乳、麦浸出物或番茄汁 等) 。 ( 5 ) 环境因素植物离体克隆的环境因素主要有温度条件、湿度条件、光照 条件等。离体培养条件下，培养温度与植物细胞的脱分化、细胞分裂和再分化有 着密切的关系。温度控制主要依据植物种的起源和生态类型来决定。喜温性植物 培养温度一般控制在2 4 2 8 。c ，冷凉性植物培养温度一般控制在1 8 。c 2 2 c 。 一般培养温度低予1 5 或高于3 5 对植物细胞的分裂、分化十分不利。离体培养 过程中对湿度的要求并不十分严格，因为在培养植物周围的环境中( 三角瓶) 相 对湿度常达到1 1 0 。培养瓶以外的环境的相对湿度，对培养植物没有直接影响。 植物离体培养条件下，光是相当重要的环境因子，光的影响包含光周期、光量和