（生物医学工程专业论文）基于dsp的实时pcr仪温度控制系统的研制.pdf

独创性声明 i i i l l l i i f l l l i i if l l l l f l i l l1 1rl f l i l1111j 111111 y 17 8 8 4 2 9 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得北京工业大学或其它教育机构 的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均 已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 签名：童塑! ! ：壹日期：2 q ! q 生量且 关于论文使用授权的说明 本人完全了解北京工业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部 分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 ( 保密的论文在解密后应遵守此规定) 签名：窒当d ：重导师签名：2 垒落日期：2 q ! q 生三旦 摘要 摘要 聚合酶链式反应( p c r ) 最早由克里穆利斯博士于1 9 8 3 发明。p c r 技术是 生物医学领域中的一次革命，它使生物医学研究从整体水平和细胞水平发展到分 子水平，现已广泛应用于病原体测定、免疫分析、基因表达、突变和多态性等领 域。实时p c r 仪在普通p c r 仪的基础上，利用荧光积累信号来实时监测整个p c r 反应过程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。 本文旨在研发一套用于基于d s p ( 数字信号处理器) 的实时p c r 仪的温度 控制与数据采集系统，该系统包括系统硬件设计和软件开发两部分。 系统硬件的开发主要包括：温度采集电路和荧光信号采集电路、d s p 主控板 电路、u s b 2 0 接口电路以及温度控制电路、实时p c r 仪整体电源的选择与考量。 温度信号的范围是0 1 0 0 ，升降温速率要求在3 ，温度控制精度o 2 ；系 统采用p t l 0 0f p t l 0 0 0 作为温度传感器，温度调理芯片t l 4 3 1 对其施加激励电流， 温度传感器两端的电压信号经过滤波、放大后，其信号幅度调整至0 3 v ，并滤 除信号中的工频干扰和高频干扰，经过d s p 内嵌的a d c 模块送至 t m s 3 2 0 f 2 8 1 2 ，完成一路温度信号的采集；系统采用光电倍增管作为荧光信号探 测器，光电倍增管输出的光电信号经过放大滤波后同样经过d s p 内嵌的a d c 模 块送至t m s 3 2 0 f 2 8 1 2 ，完成一路光电信号的采集；主控板电路包括d s p 2 8 1 2 及 其电源电路、复位电路、外部f l a s h 和s r a m 存储电路、u s b 接口控制电路， j t a g 调试电路；u s b 2 0 接口电路用于d s p 与p c 机之间的通信，u s b 接口芯 片选用c y 7 c 6 8 0 1 3 芯片；温度控制电路包括光电隔离电路和热电模块驱动电路， 光电隔离电路用来隔离d s p 端弱电电路和加热制冷端强电电路，用来保护d s p 芯片，热电模块驱动电路用以驱动加热制冷片工作。 软件开发是d s p 程序开发，主要包括：a d 转换、温度控制p i d 算法， d s p 与p c 机通过u s b 2 0 端口的通讯模块，p w m 波输出以及提高模数转换精 度算法。 最后，对所研制的p c r 仪温度控制与数据采集系统进行测试。实验证明，数 据传输速度达1 2 m b s 、精度大于4 8 ；温控模块中升温速率为3 s 时，温度 精度为0 2 。 本文研制的实时p c r 仪中的温度控制与数据采集系统初步实现了数据采集 以及温度控制的基本功能，为今后系统升级及优化奠定了基础。 关键词：p c r ；温度控制；u s b 2 0 ；d s p ；数据采集 北京丁业大学硕i 二论文 a b s t r a c t p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ( p c r ) i n v e n t e db yd rk a r yb m u l l i si n19 8 3h a sb e e n p r o m o t e dt h em e d i c a ls t u d yf r o mh o l i s t i ca n dc e l l u l a rl e v e lt om o l e c u l a rl e v e l n o w , i t h a sb e e nw i d e l yu s e di n m e a s u r i n gp a t h o g e n , i m m u n ee s s a y , g e n ee x p r e s s i o n , m u t a t i o n ，p o l y m o r p h i s ma n ds oo n r e a lt i m ep c r i n s t r u m e n t sm o n i t o rt h ew h o l e p r o c e s so fp c rm a k i n g u s eo ft h ea c c u m u l a t e ds i g n a lo ff l u o r e s c e n c ei nr e a lt i m ea n d c o n s e q u e n t l ya n a l y z eu n k n o w nt e m p l a t eb yc o m p a r i n g 、析t l lt h es t a n d a r dc h i v e i nt h i sp a p e r , w eh a v ed e v e l o p p e dat e m p e r a t u r ec o n t r o la n dd a t aa c q u i s i t i o n s y s t e mf o rar e a lt i m ep c ri n s t r u m e n t t h em a j o rw o r k sa r eh a r d w a r ed e s i g na n d s o f t w a r ed e v e l o p m e n t t h es y s t e mh a r d w a r ed e v e l o p m e n ti n c l u d e st e m p e r a t u r ea c q u i s i t i o nc i r c u i t ， f l u o r e s c e n c es i g n a la c q u i s i t i o nc i r c u i t ，d s p ( d i g i t a ls i g n a lp r o c e s s o r ) c o r ec i r c u i t ， u s b 2 0i n t e r f a c ec i r c u i t ，t e m p e r a t u r ec o n t r o lc i r c u i ta sw e l la st h ec h o i c eo ft h ew h o l e p o w e r 1 1 1 et e m p e r a t u r es i g n a lr a n g e sf r o m0 * ct o10 0 。c a n dt e m p e r a t u r er i s i n gr a t e i s 士3 0 c sw i t hp r e c i s i o n0 2 0 c ：p t l0 0 p t l0 0 0i st h et e m p e r a t u r es e n s o rf o rt h es y s t e m t h et e m p e r a t u r er e c u p e r a t i o nc h i pt l 4 31e x e r t st h ee x c i t i n gc u r r e n tt op t10 0 p t10 0 0 t h ep h o t om u l t i p l i e rt u b e ( p m t ) i su s e da st h ef l u o r e s c e n c ed e t e c t o rf o rt h es y s t e m t h et e m p e r a t u r es i g n a la sw e l la st h ef l u o r e s c e n c es i g n a la r ef i l t e r e do u tt h ep o w e r l i n ei n t e r f e r e n c ea n dh i g hf r e q u e n c yi n t e r f e r e n c ea n da m p l i f i e dt or a n g ef r o m0vt o 3 v t h ep r o c e s s e ds i g n a lp a s s i n gt h r o u g ht h ea d cm o d u l eg o i n gi n t ot h ec o r em o d u l e e m b e d d e di nd s pt m s 3 2 0 f 2 812i si n t e n d e dt os a m p l et h et e m p e r a t u r es i g n a la n d f l u o r e s c e n c es i g n a l t h ec o r ec i r c u i ti sc o m p o s e do fp o w e rc i r c u i t ，r e s e tc i r c u i t ， e x t e r n a lf l a s ha n ds r a mc i r c u i t ，u s bi n t e r f a c ec i r c u i ta n dj t a gi n t e r f a c ec i r c u i t t h eu s bi n t e r f a c ec i r c u i ti su s e df o rc o m m u n i c a t i o nw i t hl o c a lp c t h eu s b i n t e r f a c ec h i pi sc y 7 c 6 8 013 t h et e m p e r a t u r ec o n t r o lc i r c u i tc o n s i s t so fo p t o i s o l a t o r c i r c u i ta n dt h e r m o e l e c t r i cc o o l e r ( t e c ) m o d u l ed r i v e rc i r c u i t o p t o i s o l a t o rc i r c u i t p r o t e c t sd s e t e c m o d u l ed r i v e rc i r c u i td r i v e st h ep e l t i e r s o f t w a r ed e v e l o p m e n ti nd s pi sc o m p o s e do fa dc o n v e r s i o np r o g r a m ，p i d a l g o r i t h mf o rt e m p e r a t u r ec o n t r o l ，t h ec o m m u n i c a t i o np r o g r a mb e t w e e nl o c a lp ca n d d s pw i t hu s b 2 0p r o t o c a l ，p w mo u t p u tp r o g r a ma n dt h ea l g o r i t h mf o ri m p r o v i n g a d c a c c u r a c y f i n a l l y , t h ep e r f o r m a n c et e s to ft h et e m p e r a t u r ec o n t r o la n dd a t aa c q u i s i t i o n s y s t e mi sc a r r i e do u t t h ee x p e r i m e n t a lr e s u l t ss h o w t h a tt h ed a t at r a n s f e rr a t ei su pt o 摘要 12 m b sw i t hp r e c i s i o n4 8 a n dt e m p e r a t u r er i s i n gr a t ei s3 0 c sw i t hp r e c i s i o n 0 2 0 c i nt h i sp a p e r , w eh a v ed e v e l o p p e dat e m p e r a t u r ec o n t r o la n dd a t aa c q u i s i t i o n s y s t e m ，c o m p l e t e dt h es y s t e mb a s i cf u n c t i o np r e l i m i n a r i l yi nr e a lt i m ep c r i n s t r u m e n t i tw o u l de s t a b l i s ht h ef o u n d a t i o nf o ru st ou p g r a d ea n do p t i m i z et h e t e m p e r a t u r ec o n t r o la n dd a t aa c q u i s i t i o ns y s t e mi no u rr e a l - t i m ep c ri n s t r u m e n t k e y w o r d s ：p c t lt e m p e r a t u r ec o n t r o l ，u s b 2 0 ，d s p , d a t aa c q u i s i t i o n v a b s t r a c t i i 第1 章绪论1 1 1 课题研究的背景与意义：1 1 2 国内外发展及应用现状。2 1 3 实时p c r 仪的原理和方法2 1 3 1p c r 技术介绍：4 1 3 2 实时p c r 仪的原理及应用7 1 4 论文的主要研究内容7 1 5 论文各章安排8 第2 章p c r 仪中电子系统硬件电路设计9 2 1 系统整体设计9 2 2 测温电路- 。1 1 2 2 1 温度传感器的选择1 l 2 2 2 测温电路设计1 2 2 2 3 信号调理电路1 4 2 3 光电信号采集1 7 2 3 1 激光器驱动电路1 7 2 3 2 信号调理电路1 7 2 4d s p 中央控制单元设计18 2 4 1 数字信号处理简介1 9 2 4 2d s pt m s 3 2 0 f 2 8 1 2 的基本结构1 9 2 4 3 主板电路2 l 2 5u s b 2 0 数据传输3 4 2 5 1u s b 主芯片选择3 4 2 5 2u s b 2 0 接口硬件电路设计3 6 2 6 热电模块及驱动电路3 8 v 北京丁业人学硕f j 论文 2 6 1 热电模块3 8 2 7p c r 整体电源的选择4 5 2 8 本章小结4 5 第3 章p c r 仪中底层软件开发4 7 3 1a d 采集4 8 3 1 1a d 转换步骤4 8 3 1 2a d 校正4 9 3 2 温度控制子程设计5 2 3 1 1p i d 控制算法设计5 3 3 1 2p i d 参数的选择5 7 3 1 3p w m 波输出5 9 3 3d s p 与u s b 通讯程序设计。6 0 3 4 本章小结6 0 第4 章系统集成及调试6 3 4 1d s p 调试前期工作6 3 4 1 1 系统设计的硬件平台介绍6 3 4 1 2 硬件仿真器及u s b 2 0 端口6 3 4 1 3d s p 编译环境c c s 6 4 4 2d s p 主程调试6 7 4 2 1a d 采集子程调试6 7 4 2 2d s p 与u s b 通讯子程调试6 9 4 2 3p i d 算法输出p w m 波子程调试6 9 结论与展望7 3 参考文献7 5 附录1 温度控制系统实物图。7 9 附录2d s p 核心电路板实物图8 0 附录3 总电源实物图8 l 附录4 加热模块实物图8 2 攻读硕士学位期间完成的学位论文8 3 致 射8 5 v 第1 章绪论 第1 章绪论 1 1 课题研究的背景与意义 聚合酶链式反应( p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ，p c r ) 最早由克里穆利斯( k a r y b m u l l i s ) 博士于1 9 8 3 发明，1 9 8 5 年他与s a i k i 等人在( s c i e n c e 上正式发表 了第一篇与p c r 相关的论文【l 】，于1 9 9 3 年m u l l i s 获得诺贝尔化学奖。 p c r 技术是生物医学领域中的一次革命，它使生物医学研究从整体水平和 细胞水平发展到分子水平，现已广泛应用于病原体测定、免疫分析、基因表达、 突变和多态性等许多领域。 近年来，定量p c r 技术取得了很大的发展，实时p c r 技术便是一种新型的可 作定量分析的p c r 技术。所谓实时p c r 是指在p c r 指数扩增期间通过连续监测荧 光信号出现的先后顺序以及信号强弱的变化来即时分析目的基因的拷贝数目，通 过与加入已知量的标准品进行比较，可实现实时定量【2 j 。 从操作上来讲，普通的p c r 扩增仪可完成普通的p c r 反应，反应后产物一般 通过电泳查看结果。实时荧光p c r 贝f j 通过在反应体系中加入目的基因的探针，在 p c r 的反应过程中，根据目标基因的表达量多少，探针可发荧光，实时p c r 仪通 过检测荧光表达量来记录基因表达量，从而达到了同不定量检测基因表达量，不 需要电泳辅助，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。这样，既保持了p c r 技术灵敏、快速的特点，又克服了以往p c r 技术中存在的假阳性污染和不能进行 准确定量的缺点。另外，还有重复性好、省力、低费用等优点。 1 2 国内外发展及应用现状 1 9 9 6 年a b i 公司推出了全球第一款荧光定量p c r 以来，经过1 0 几年的发展， 由于荧光定量p c r 仪的在科研、检测和诊断领域的广泛应用，市场规模也不断扩 大。已有多家国内外生产厂商涉足研发生产。 在国外，比较常用的有b i o r a d 公司生产的i q 系列，s t r a t e g e n e 公司的m x 系列 世 号宇o b i o r a d 公司： 该公司的p c r 产品线比较丰富，目前伯乐的i q 5 荧光定量p c r 仪是一款性价 比较高的产品，采用9 6 孑l p e l t i e r 半导体加热，5 通道，1 2 b i tc c d 检测，而且还带 有梯度功能。 北京t 业大学硕十论文 b i o n e e r 公司： b i o n e e r 公司于2 0 0 6 年底推出了荧光定量p c r 仪e x i c y c l e r t m9 6 ，该产品采用 9 6 孑 , p e l t i e r 半导体加热，5 通道，1 6 b i tc c d 检测，也带有梯度功能。这款产品的 参数几乎与b i o r a d 的i q 5 一模一样，而且检测的c c d 像素还要高于i q 5 ， 理论上 检测灵敏度应该更好一些。产品价格要l l , b i o r a d 更低一些，被评为性价比最高的 荧光定量p c r 仪。 s t r a t a g e n e 公司： s t r a t a g e n e 现在为安捷伦公司的子公司，也是专著于分子生物学研究产品开 发的公司。s t r a t a g e n e 的荧光定量p c r 产品m x 3 0 0 5 p 也采用9 6 孑l p e l t i e r 半导体加 热，5 通道，p m t 检测器，但是没有梯度功能，因此不能在这台仪器上优化反应 条件，但是该产品价格较为低廉。 国内，也有一些自主研发的p c r 仪。但是鉴于我国技术相对落后，因此这些 产品的性能与国外产品相比还是存在一定的差距，但是价格很低，因此适合低端 客户进行使用。 西安天隆公司： 西安天隆的荧光定量p c r 产品t l 9 8 8 是一款真正的依靠国内自主研发而成 多通道荧光定量p c r 仪，t l 9 8 8 设计比较灵活，可选3 6 孔与9 6 孑l j 3 1 1 热模块，但通 道和多通道几种组合模式。最多可达5 通道，但不足之处是还是使用单激发滤光 片，激发光特异性不好，导致检测灵敏度较低。 随着基因科学及分子生物学的发展，实时p c r 仪的应用前景更加广阔。人们 对实时p c r 仪也提出了更高的要求：p c r 反应、荧光检测与数据分析一体化，提 高仪器的性价比；缩短循环时间，减少循环次数，降低荧光检测的阈值，提高检 测的灵敏度，以缩短科研人员的实验时间、提供初始拷贝数的检测极限；较高的 通量和较少的试剂用量；全波长检测和较好的重复性等【2 】。 1 3 实时p c r 仪的原理和方法 1 3 1p c r 技术介绍 p c r 是一项在短时间内体外大量扩增特定的d n a 片段的分子生物学技术： 由一对位于靶序列两端互补的寡核苷酸引物介导，通过对温度的调节，使模板 d n a 双链或经p c r 扩增形成的双链d n a 解离，从而使双链d n a 变性为两个 单链d n a ( 模板d n a 的变性，温度在9 0 9 5 ) ；引物与模板d n a 单链的 互补序列配对复性( 模板d n a 与引物的退火，温度在5 5 - - 6 5 ) 成为引物 一d n a 单链复合物；以及在d n t p s 存在下d n a 聚合酶能使引物沿单链模板延 伸成为双链d n a ( 引物的延伸，温度在7 0 7 5 。c ) 。这种热变性复性延伸的 | | i 一 3 一 北京t 业人学硕l j 论文 0 善 墨。雠0 t 毒 口 芒 t 宝o 醒0 t e 巾t 图1 - 2p e 公司在同一台p c r 仪上对相同模板进行9 6 次扩增的扩增图 f i g1 - 2a m p l i f i c a t i o ng r a p ho f 9 6c y c l e si nt h es a m eb l o c ko f ap ec o m p a n y sp c ri n s t r u m e n t 1 3 2 实时p c r 仪的原理及应用 1 3 2 1 实时p c r 技术 实时p c r 技术是美国p e 公司于1 9 9 5 年研制出的一种新的核酸定量技术， 是指在p c r 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个p c r 进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法【5 j 。它在常规p c r 基 础上添加了荧光染料或荧光探针，荧光染料能够特异性地掺入d n a 双链而发 出荧光信号，从而保证荧光信号的增强与p c r 产物的增加完全同步i6 。实时p c r 是基于荧光共振能量转移( f l u o r e s c e n c er e s o n a n c ee n e r g yt r a n s f e r , f r e t ) 技术 的：一个具有特异性的寡核苷酸荧光探针，在探针的5 端标记一个荧光基团，3 端标记一个基团，两者能够构成能量传递结构，荧光基团所发出的荧光可被淬 灭基团吸收；p c r 扩增时( 在延伸阶段) ，报告荧光基团和淬灭荧光基团分离， 从而荧光监测系统能够检测到荧光信号【7 】。 现在通用的适用于实时p c r 检测系统的化学发光材料主要有两类：一类是 非特异性d n a 嵌入染料( 如s y b rg r e e ni 1 8 】) ；另一类是以杂交形式进行的单 链检测系统，主要有水解探针或t a q m a n 探针【9 1 、分子信标10 1 、s c o r p i o n s 1 1 】和杂 交探针【1 2 1 等。 实时p c r 反应早期，荧光产生的水平不能与背景明显地区分开来，随后荧 光的产生进入指数期、线性期和最终的平台期，在反应处于指数期的某一点上 来检测p c r 产物的量，并且由此来推断模板d n a 最初的量【l 引。为了便于对所 检测样本进行比较，在反应的指数期，首先要设定一个荧光信号的域值 第1 荦绪论 ( t h r e s h o l d ) ，一般这个域值是以p c r 反应的前1 5 个循环的荧光信号，荧光域值 的缺省设置是3 1 5 个循环的荧光信号的标准偏差的l o 倍。如果检测到的荧光 信号超过域值被认为是真正p c r 的信号，它可用于定义样本的域值循环数( c t 值) 。c t 值的含义是：每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环 数。研究表明，每个模板的c t 值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系【1 4 1 ， 起始拷贝数越多，c t 值越小，利用已知起始拷贝数的标准品可做出标准曲线， 因此只要获得未知样品的c t 值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝 数，如图1 3 所示。 由于实时p c r 技术不仅实现了p c r 从定性到定量的飞跃，而且与常规p c r 相比，具有特异性更强、灵敏度高、重复性好、定量准确、全封闭反应、自动 化程度高、有效解决p c r 污染问题等优点，已得到了广泛的应用【4 1 。 图卜3c e p h e i d 公司的s m a r tc y c l e r 上c t 值与起始拷贝数的对数图 f i g1 - 3l o g a r i t h m i cp i c t u r eb e t w e e nc tv a l u ea n di n i t i a t i v ec o p yn u m b e ri nc e p h e i dc o m p a n y s s m a r tc y c l e rs y s t e m 1 3 2 2 实时p c r 仪的组成 实时p c r 仪主要由温度控制系统和荧光检测系统组成。温度控制系统能够 实现p c r 扩增，其装置如附录1 所示，这部分是本文研究的主要内容，下面将 会做详细的阐述；荧光检测系统有一套完整的光路系统，能够激发并实时检测 荧光信号，其结构如图1 5 所示，各种仪器检测到的波长数和光学频率范围不 同，能区分的波长数越多，频率范围越宽，灵敏性越高，仪器性能越好【1 5 】。 北京t 业大学硕十论文 光源灯 图1 - 4 荧光检测系统 f i g 1 - 4f l u o r e s c e n td e t e c t i n gs y s t e m 1 3 2 3 实时p c r 仪的应用 c c d 相机 实时p c r 仪已广泛应用于临床及生命科学研究的各个领域中，现主要就以 下几方面作一概述： ( 1 ) 遗传性疾病的基因诊断。迄今对遗传性物质改变引起的疾病还无法根 治，只能通过产前监测和产前基因诊断减少病婴出生。s a n g k i t p o m 等l l6 j 报道使 用d s d n a 结合染料s y b rg r e e ni ，结合融解曲线分析对q 一地中海贫血纯合子、 杂合子作出诊断。使用双色荧光标记探针，结合不同的引物设计，可以实现对 某些先天性疾病的定量检测。z i m m e r m a n n 等【l7 j 提出采用双重荧光p c r 筛查唐 氏综合征，在产前诊断中有应用前景。 ( 2 ) 病原体的分子检测：p c r 技术的问世使病原体检测能够快速、方便地 进行。应用实时荧光p c r 技术就能快速、准确地得到定量检测结果。目前，实 时荧光p c r 技术已应用于肝病【l 引、性病以及人类免疫缺陷病毒( h i v ) 1 1 9 】等各种 病原体的临床诊断，为实现快速准确诊断提供了有效的检测方法。 ( 3 ) 肿瘤的分子诊断：尽管肿瘤发病的分子机制尚未完全阐明，但相关基 因的遗传学改变的积累是致癌性转变的根本原因之一已得到普遍承认。癌基因 的突变和表达增加，在许多肿瘤早期就出现。实时荧光p c r 技术不仅能有效地 检测到基因的突变，而且可以准确检测癌基因的表达量，成为检测肿瘤微小残 留分子标志的一种必备工具。如定量结直肠癌淋巴结的癌胚抗原( c e a ) m r n a 第1 章绪论 的表达量，可作为诊断癌症微转移的重要依据【2 0 l 。e c k e a 掣2 1 1 提出采用实时荧 光p c r 技术检测儿童急性淋巴细胞白血病微残留病灶，对儿童急性白血病的治 疗有重要指导意义。 ( 4 ) 其他方面：近年来研究发现孕妇外周血血浆游离d n a 中含有源于胎儿 的d n a ，但其仅占血浆总d n a 的3 6 。这给无创性产前诊断提供一种胎儿 d n a 的新来源，实时荧光定量p c r 技术可以灵敏地检测孕妇血浆中胎儿的 d n a 。g a l b i a t i 等【2 2 j 采用这一技术对妊娠前期、中期和后期孕妇血浆中的胎儿 d n a 进行检测，准确度分别为9 9 4 、9 7 8 和1 0 0 。h w a 等【2 3 】从以往未妊 娠男胎的孕妇血浆中分离胎儿d n a ，用实时荧光定量p c r 技术检测y 染色体 上的性别决定区( s r y ) 基因，在进行无创性产前性别诊断中有重要价值。 实时p c r 是p c r 技术的发展方向，随着技术方法的不断改进与完善、仪 器设备和试剂费用的降低及相关知识的了解和普及，在生命科学领域将得到更 加广泛的应用1 2 4 j 。 1 4 论文的主要研究内容 d n a 扩增系统是实时p c r 仪的基本组成部分，p c r 反应过程中的高温变性、 低温复性、中温延伸都是在一定的温度范围内才能进行的，故温度控制在p c r 中 起着重要的作用。本文主要针对d n a 扩增系统中的温度控制系统进行研究。 目前，实时p c r 仪在温度控制加热方面主要有两种方式：中心热循环式和半 导体加热样品盘式，前者对空气动力学的依赖较大，难以控制；后者以其体积小、 温度均匀、升降温速度快、温控精确、可靠性高等优点而被广泛采用。 本文采用了半导体加热方式来实现温度的升高与降低。 1 利用半导体( 帕尔贴) 来搭建p c r 力1 1 热与制冷系统，利用敏感度高的温 度传感器p t l0 0 采集温度信号，并设计专用于温度信号的采集、滤波电 路，对温度信号进行前端放大滤波处理； 2 设计激光器驱动电路以及荧光信号采集，滤波电路，对荧光信号进行滤 波处理； 3 基于d s p 的核心板卡硬件电路设计与软件调试； 4 u s b 2 0 的接口开发设计； 5 比较多种功率放大电路，最终以全桥推挽功率放大电路( b a l a n c e d t r a n s f o r m e r l e s s ，b t l ) 的原理构建驱动电路，使其能够完成光电隔离及 驱动加热制冷片。 北京t 业大学硕 ：论文 1 5 论文各章安排 本论文具体安排如下： 第1 章是绪论。主要阐述本文研究背景及意义，实时p c r 仪的原理和方法， 分析国内外研究进展情况，提出本文主要研究内容。 第2 章是系统硬件的开发。主要包括温度采集电路以及荧光信号采集电路； 信号调理电路；d s p 主控板电路；u s b 2 0 接口电路；光电隔离电路以及加热制 冷片驱动电路，最后介绍了对实时p c r 仪整体电源的选择与考量。、 第3 章是d s p 程序开发。主要涉及到a d 转换、温度控制p i d 算法，d s p 与p c 机通过u s b 2 0 端口的通讯模块，p w m 波输出以及提高a d c 精度算法 世 奇。 最后总结了论文中讨论的内容，指出该系统中存在的不足，并提出改进措 施与展望。 第2 章p c r 仪中电子系统硬件屯路设计 第2 章p c r 仪中电子系统硬件电路设计 2 1 系统整体设计 系统中使用传感器，不断地将探测的模拟信号( 荧光信号及温度型号) 转 换为连续的电平信号通过a d 转换器成为数字信号送到d s p 进行处理，当p c 机设定温度参数，对控制单元d s p 传递变温指令，d s p 将主机传来的温度与传 感器探测到的温度进行比较，由p i d 控制算法计算出控制量，然后用p w m 输 出占空比随控制量变化而变化的方波，对热电模块的驱动器进行控制从而使热 电模块加热或者降温。d s p 再将处理结果返回给主机。同时，d s p 也要将荧光 信号通过u s b 端口送至p c 机。系统原理框图见图2 1 。 图2 1 系统原理框图 f i g2 - 1s y s t e md i a g r a m 温控系统采用p t l 0 0 p t l 0 0 0 作为敏感元件。温度调理芯片t l 4 3 1 对其施 加激励电流，p t l 0 0 p t l 0 0 0 两端的电压输入，经滤波、放大后，经过d s p 内嵌 的a d c 模块送至t m s 3 2 0 f 2 8 1 2 。t m s 3 2 0 f 2 8 1 2 在计数器周期中断的控制下以 一定的频率读取温度的a d 码，并进行数字滤波得到温度数据。控制器 t m s 3 2 0 f 2 8 1 2 在接收到u s b 端口的控温指令和温度数据后，把采集到的实时 温度与控温要求的温度相比较进行p i d ，计算得出控制量，用该控制量去控制 9 北京t 业大学硕十论文 主电路的电流方向和p w m 输出。电流方向决定对控温对象加热还是制冷， p w m 的输出经光耦隔离去驱动功率m o s f e t 从而达到控制热电模块加热或 调节制冷功率的目的。p i d 参数也可以通过u s b 端口进行实时修改。进行温度 控制的同时，系统还要采集荧光信号，经过滤波后，同样经过d s p 内嵌的a d c 模块送至t m s 3 2 0 f 2 8 1 2 ，进行初步数据处理后，将采集的数据通过u s b 端口 送至p c 机进行显示，系统硬件原理图如图2 2 所示。 温度信号和荧光信号的采集是整个系统数据来源。只有准确的采测到样品 池的实时温度，才能做到准确控制系统的温度。只有实时的采样荧光信号，方 可利用荧光信号积累实时监测整个p c r 进程。本系统采用p t 电阻温度传感器， p t 电阻随着温度变化做线性变化，并通过对温度传感器的标定将温度与电阻的 关系一一对应，因此，系统的采样输入电路可将温度的变化量转为电信号的变 化，通过放大器的放大后送入d s p 的a d c 模块转换成数字信号，最终进行数 据的运算处理。 在进行数据采集电路设计时，主要考虑被测信号的变化率和通道数以及对 测量精度、分辨率、速度的要求等。本数据采集系统采用如下结构形式：多通 道并行数据采集系统，这种系统的每个通道都有独自的采样保持器和a d 转换 器，各个通道的信号相互独立地进行采样和a d 转换，这种结构的数据采集系 统的数据最快，所用的硬件也最多。 亟口镩 三 仿真口 口 嘲1 2 b 习 图2 2 系统硬件原理图 f i 9 2 - 2h a r d w a r es c h e m a t i cd i a g r a m 如图所示，系统硬件可以分为以下5 个模块： 1 荧光信号采集模块； 2 温度信号采集模块； 3 d s p 中央控制模块； 日臣堕口 日 亘 钓 堕 第2 章p c r 仪中电了系统硬件电路设计 4 u s b 2 0 通讯模块； 5 热电模块驱动模块。 2 2 测温电路 2 2 1 温度传感器的选择 测量温度的关键是选择合适的温度传感器。温度传感器的种类很多，分类 方法也很多，按照温度传感器输出信号的模式，可大致划分为三大类：模拟式 温度传感器、逻辑输出温度传感器、数字式温度传感器。常见的模拟式温度传 感器有氧化物半导体温度传感器、铂电阻、热电偶、p n 结温度传感器等，采用 模拟式温度传感器时，需要设计相应得采样电路、放大电路和模数转换电路， 接口电路比较复杂，但是其一般具有较高的精度。 温度传感器测量被测介质的温度的方式有两类：接触式和非接触式j 测温 时使传感器与被测物体直接接触的称为接触式温度传感器。如热电偶、热电阻、 p n 结等。传感器与被测物体不接触，而是利用被测物体的热辐射或热对流来测 量的称为未接触式温度传感器，如红外测温传感器等，它们通常用于高温测量。 本课题选用的是接触式温度传感器铂电阻p t l o o p t l0 0 0 ，它稳定性好、精 度高、电阻率较高、温度系数大。 铂电阻的线性较好，只是在接近其范围极限时呈非线性。铂电阻每摄氏度 可以改变几分之一欧姆，适合稳定性为0 0 5 。c 的系统【2 5 1 ，可以满足系统要求。 铂电阻温度传感器是利用其电阻和温度成一定函数关系而制成的温度传感 器，由于其测量准确度高、测量范围大、复现性和稳定性好等，被广泛用于中 温( 一2 0 0 * c - - 6 5 0 。c ) 范围的温度测量中。而且，铂电阻在5 0 6 0 0 。c 的范围内具有 其他任何温度传感器无可比拟的优势，包括高精度、稳定性好、抗干扰能力强 笙1 2 6 可 。 本系统主要采用p t l 0 0 作为温度传感器，p t l 0 0 温度传感器的电阻温度系 数为3 9 1 0 d ，电阻变化率为0 3 8 5 1q * c 。它是一种正温度系数的热敏电 阻传感器，其主要技术参数为： 1 ) 测量范围：2 5 0 , - - + 6 4 0 ； 2 ) 允许偏差值：a 级( 0 1 5 + 0 0 0 2 1 t 1 ) ，b 级( 0 1 5 + 0 0 0 5 1 t 1 ) ： 3 ) 热响应时间： 3 0 s ： 4 ) 最小置入深度：热电阻的置入深度至2 0 0 m m ； 5 ) 在0 1 0 0 摄氏度变化时，最大非线性偏差小于o 5 。 p t 热电阻阻值与温度的关系为： 北京r 业大字坝卜论文 当2 0 0 c t s 鲥羽 c l a r a l , l 卅 i n t